Genome Redigering med CompoZr tilpassede zink finger Nucleaser (ZFNs)

Summary

Den CompoZr tilpassede zink-finger-nuklease (ZFN) Service muliggør præcis genom redigering i en organisme eller celle linie ved ethvert sted defineret af brugeren. Denne artikel beskriver processen for konstruktion, fremstilling, validering og implementering af CompoZr Brugerdefineret ZFN Service.

Abstract

Genom redigering er en kraftfuld teknik, der kan anvendes til at belyse genfunktioner og det genetiske grundlag for sygdom. Traditionelle genet redigering metoder, såsom kemisk-baseret mutagenese eller tilfældig integration af DNA-sekvenser giver vilkårlige genetiske ændringer i et samlet ineffektiv måde og kræver inkorporering af uønskede syntetiske sekvenser eller anvendelse af afvigende dyrkningsbetingelser, potentielt forvirrende biologisk undersøgelse. Derimod kan forbigående ZFN ekspression i en celle lette nøjagtig, arvelige genet redigering på en meget effektiv måde uden behov for indgivelse af kemikalier eller integration af syntetiske transgener.

Zinkfinger nukleaser (ZFNs) er enzymer, som binder og skæres forskellige sekvenser af dobbeltstrenget DNA (dsDNA). En funktionel CompoZr ZFN enhed består af to individuelle monomere proteiner, der binder en DNA "halv-site" på omkring 15-18 nukleotider (se figur 1). Når to ZFN monoMers "hjem" til deres tilgrænsende målsteder de DNA-spaltningsprodukterne domæner dimerisere og skabe en dobbelt-strenget pause (DSB) i DNA. ¹ Indførelse af ZFN-medierede DSB'er i genomet lægger et fundament for højeffektive genom redigering. Ufuldkommen reparation af DSB'er i en celle via den ikke-homologe ende-samling (NHEJ) DNA-reparationsvej kan resultere i små insertioner og deletioner (indels). Oprettelse af indels inden for genet kodende sekvens i en celle kan resultere i rammeskift og efterfølgende funktionelle knockout af et gen locus med høj effektivitet. ^2. Medens denne protokol beskriver anvendelsen af ZFNs at skabe et gen knockout integration af transgener kan også udføres via homologi-dirigeret reparation på ZFN kløvningspunkt.

Den CompoZr Brugerdefineret ZFN tjenesten udgør en systematisk, omfattende og velkarakteriseret tilgang til målrettede gen redigering for det videnskabelige samfund med ZFN teknologi. Sigma forskere arbejder tæt sammen med efterforskere til 1) perforeretrm due diligence analyse, herunder en analyse af relevante gen struktur, biologi, og model-system i henhold til projektets mål, 2) anvende denne viden til at udvikle en sund målrettet strategi, 3) og derefter design, opbygning og funktionelt validere ZFNs for aktivitet i en relevant cellelinie. Undersøgeren modtager positive kontrol genomisk DNA og primere, og klar til brug ZFN reagenser leveret i både plasmid-DNA og in vitro-transkriberet mRNA format. Disse reagenser kan derefter leveres til transient ekspression i forskerens cellelinie eller celletype valg. Prøverne testes derefter for genet redigering ved locus af interesse ved molekylærbiologiske standardteknikker, herunder PCR-amplifikation, enzymatisk fordøjelse, og elektroforese. Efter positivt signal for genet redigering detekteres i den første population, celler encellede klonet og genotypebestemmes til identifikation af mutante kloner / alleler.

Protocol

1. Tilpasset ZFN Design Process

1. For at fremskynde ZFN designprocessen, bør en investigator give:
• Information om mål-gen, såsom det gen navn, arter og gen noter / identifikationsnummer.
• Et klart over-all Formålet med forsøget (f.eks Knockout eller Knocking)
• Specifikke faktorer genet mål, som omfatter atypisk genstruktur, særligt biologi impliceret i det genetiske locus, eller enhver homologe regioner andre steder i genomet.
• Det specifikke område af DNA-sekvensen for zinkfinger nukleaser at målrette.
2. Sigma bioinformatik Holdet fører i silico ZFN design til at udvikle de første zink finger målsteder.
3. Indledende ZFN target sider stilles til rådighed til en ZFN videnskabelig teknisk konsulent. For mere teknisk komplekse projekter, fungerer dette Sigma videnskabsmand med efterforskerne til at udvikle projektet strategi.
4. Bioinformatik giver de bedste ZFN target sites til investigator til gennemgang. Efter godkendelse af de potentielle ZFN målområderne, er disse oplysninger til ZFN Production team til at begynde ZFN fremstillingsprocessen.

2. Brugerdefineret ZFN Produktion

1. Sigma arkiv zinkfinger-moduler bruges til at samle de godkendte ZFN design.
2. Hver ZFN design er samlet og sekvens verificeret på en high throughput kloning platform.
3. Når produktionen af ​​alle ZFN designs er færdig hver ZFN sendes til validering.

3. Validering af brugerdefinerede ZFNs

1. ZFN projekter imenneske, mus, rotte eller CHO arter er blevet valideret, velkarakteriserede cellelinier for hver art, er en gær-baseret assay anvendes til andre organismer eller celletyper.
2. ZFN konstruktioner leveres i en passende cellelinje ved nucleofection og ZFNs udtrykkes.
3. DNA høstes fra puljen af ​​ZFN transficerede celler og regionen af ​​interesse er PCR amplificeret.
4. Den Cel-1 assay udføres herefter på PCR-produktet. Gelelektroforese køres på Cel-1 assay til valideret ZFN aktivitet.
5. Den højeste aktivitet ZFN konstruktion blev bekræftet ved Cel-1 assay derefter leveres til kunden. ZFNs leveres i mRNA og plasmid-DNA sammen med PCR-primere for Cel-1 assay og genomisk DNA som en positiv kontrol.

4. Levering af validerede ZFNs af Nucleofection

1. Frø cellerne ved en densitet på 2x10 ⁵ celler / ml dagen før nucleofection.
2. På dagen for nucleofection,tage Cell Lines Nucleofector Kit V og lad varmt til stuetemperatur.
3. Tilsæt supplement til Nucleofection Solution V i henhold til producentens protokol.
4. Tæl cellerne. Celledensiteten bør være mellem 2,5-5x10 ⁵ celler / ml.
5. Fylde en 6-brønds plade med 2 ml medium i hver brønd og opvarme i en _CO2 inkubator ved 37 ° C i mindst 20 minutter før nucleofection.
6. Centrifuger 2x10 ⁶ celler pr transfektion (8x10 ⁶ alt) ved 200 x g i 5 minutter.
7. Vask cellerne to gange med 20 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
8. Forbered eksperimentelle rør: (se tabel i Custom ZFN teknisk bulletin)
9. Fjerne 6-brønds plade indeholdende medium fra trin (6.5) fra inkubatoren.
10. Resuspender celler i 400 pi (100 gl / reaktion) af Nucleofection opløsning V.
11. En reaktion på et tidspunkt, der tilsættes 100 ul celler til hver DNA-eller mRNA-indeholdende rør. Transfis blandingen til en 2 mm elektropora-tionskuvette og nucleofect på Nucleofector med passende program.
12. Umiddelbart efter nucleofection af hver prøve, overfører pipette for at tilføje ~ 500 pi forvarmet medium fra 6-brønds plade i trin (6.9) til kuvetten. Derefter forsigtigt overføre cellerne fra kuvetten til den resterende forvarmet medium i 6-brønds plade.
13. Afslutte alle reaktioner og returnere 6-brønds plade til _{CO2-inkubator} ved 37 ° C.

5. Høst Genomisk DNA efter levering af ZFNs

1. 6-brønds plade - ikke høste alle de samlede celler. Det er vigtigt at bevare kulturen for at få celler til en enkelt celle fortynding klon når du har bekræftet, at du har Cel-1 fordøjelse produkter. En til tre dage efter nucleofection opsamle cellerne til fremstilling kromosomalt DNA under anvendelse af GenElute Mammalian Genomisk DNA Miniprep Kit.

6. Cel-1 assay

PCR amplificere det genomiske DNA fra de ZFN transficerede prøverne og den positive kontrol genomiske DNA tilvejebragt i kittet med de medfølgende primere. Den PCR-reaktionen er sat op med følgende betingelser: (se tabel i Custom ZFN teknisk bulletin).

For at generere heteroduplexer fra PCR homoduplexer tage 10 pi PCR-reaktion fra hver ZFN behandlede prøve plus kontrol og bruge følgende program på en termocyklusapparat:
95 ° C, 10 minutter
95 ° C til 85 ° C, 2 ° C / sekund
85 ° C til 25 ° C, -0,1 ° C / sekund
4 ° C, uendelige

Tilsættes 1 ml af forstærkeren og 1 pi af nuklease S (fra Transgenomic katalognr 706.025) til hver reaktion og inkuber ved 42 ° C i 20-40 minutter.

Kør spaltninger på en 10% PAGE-TBE gel med ordentlige markører, såsom DirectLoad widerange DNA Ladder (katalognummer D7058) (se resultater i Tilpasset ZFN tekniske bulletin).

Once positivt signal er blevet påvist i ZFN-behandlede befolkninger ved cel-I analysen, fortsæt til klonal isolering og karakterisering.

7. Klonal Isolering og karakterisering

1. Enkelt-celle-klon i ZFN-behandlede prøver ved standardmetoder, herunder FACS og fortyndingskloning.
2. Tillader klonerne at ekspandere tilstrækkeligt, derefter delt nogle andelen af ​​celler til genomisk DNA høst frysning tilbage resten som opsparet materiale.
3. Amplificere genomisk DNA fra klonerne ved hjælp af Cel-I-primere og analysere amplikonet af Cel-I assay (med og uden WT DNA tilsat i), eller alternativt anvende denne amplikon at fortsætte direkte til genotypebestemmelse.
4. Genotypen kandidat kloner identificeret som havende redigeret alleler ved den foretrukne fremgangsmåde.

8. Repræsentative resultater

Et eksempel på hele CompoZr ZFN arbejdsgang er vist i figur 2. ZFNs leveresat celler, hvor de binder og spalter den passende DNA-sekvens, der skaber en dobbeltstrenget brud (DSB). Den naturlige reparation proces, ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ), reparationer DSB. I nogle tilfælde afvigende NHEJ resulterer i deletion, insertion eller substitution af nucleotider. PCR-amplifikation af høstede genomiske DNA resulterer i heteroduplex dannes mellem vildtype og modificerede ampliconer efter denaturering / udglødningstrin af PCR-reaktionen. Tilsætningen af ​​Cel-1 enzym resulterer i spaltning af de heteroduplexmolekyler. Cel-1 resultater opløses ved PAGE-analyse for at bekræfte ZFN spaltning. Figur 3 tilvejebringer en skematisk afbildning af Cel-1 assay og de ​​forventede resultater.

Repræsentative Cel-1 resultater er indeholdt i figur 4 og 5. Figur 4 indeholder resultater fra en meget aktiv par ZFNs (21%) i K562-celler. Figur 5 indeholder resultater fra en mindre aktiv par (2,4%) af ZFNs iK562-celler. ZFN aktivitet bekræftet i begge figurer ved tilstedeværelsen af ​​to PCR-fragmenter under parentale PCR-fragment.

Figur 1. Repræsentation af bundne zinkfinger nukleaser. ZFNs er konstrueret proteiner bestående af et zinkfinger-DNA-bindende domæne fusioneret til spaltning domæne FokI restriktionsendonuklease. Når de er bundet som en heterodimer, ZFNs skabe et dobbeltstrenget brud på en brugers specificeret DNA-sekvens.

Figur 2. Skematisk af Custom ZFN arbejdsgange. Grafisk repræsentation af arbejdsgangen for at generere en genetisk modificeret celle linie med CompoZr ZFNs.

Figur 3. Skematisk afbildning af Cel-1 Assayet og resultaterne. A) ZFN plasmid o r mRNA leveres til celler. B) Udtrykt ZFNs binder og reducere deres målsekvens skabe et dobbeltstrenget brud (DSB) i en portion af celler. C) Aberrant reparation af nogle DSB'er ved ikke-homolog ende sammenføjning resulterer i nukleotid insertion eller deletion. D) Genomisk DNA høstet fra transficerede pulje af celler og amplificeres ved locus af interesse. EF) PCR-produkt denatureres, og re-udglødet skabe heteroduplex dannes mellem vildtype og modificerede ampliconer. G) Cel-1-mismatch-endonuklease assay resulterer i spaltning af heteroduplexmolekyler. H) Cel-1 enzym fordøjelsesvæskerne løses ved hjælp af PAGE. Den observerede forhold mellem spaltningsprodukt til parenteral bånd, bestemt ved ImageJ software, angiver fraktionen snit og effektivitet ZFNs.

Figur 4. Cel-1 resultater fra 21% aktive ZFNs ImageJ software er tilgængelig på.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Figur 5. Cel-1 resultater fra 2,4% aktive ZFNs ImageJ softwaren er tilgængelig på:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

Once ZFN-modificerede celler er isolerede, de har permanent og arvelige DNA-modifikationer. Dette resulterer i evnen til at generere stabilt modificerede cellelinjer eller avle dyr med ønskede genetiske modifikationer kunne foretage målinger. CompoZr Brugerdefinerede ZFNs tilvejebringe en robust fremgangsmåde til genomet redigering i en lang række celletyper. Offentliggørelse af vellykket genomet redigering med ZFNs indbefatter, men er ikke begrænset til humane cellelinier, mus, rotte, zebrafisk, frø, svin og CHO forskningsmodeller. ^{3,4,5,6,7,8,9} Evnen til at skabe en dobbeltstrenget brud på det ønskede målsted i det angivne celletype er sikret, når ZFNs korrekt leveres til en celle. Det er også muligt at udføre sekventielle zinkfinger modifikationer til en celle for at få mere end en genetisk modifikation i en celle. ¹⁰ Evnen til at udvælge en specifik målsekvens, og kun ændre den bestemte locus er en primær årsag til evnen til at skabe flere modifikationer.

Den CompoZr Brugerdefineret ZFN certifikat i analyse er genereret med selve reagenserne, der i sættet således sikre, at alle komponenter i sættet er blevet grundigt valideret for kunden succes. Kritiske trin i arbejdsgangen fra start til slut er præsenteret nedenfor:

Cellekloning

Evnen til at isolere og udvide en given cellelinje skal testes, før du begynder nogen ZFN eksperimenter. Enkeltceller skal isoleres og ekspanderes for at sikre, at en klonalt-afledt population er mulig. Nogle cellelinjer er genstridig i denne sag, og tricks, såsom berigelse for redigerede kloner, eller kultur med konditioneret medier kan bidrage til at overvinde disse udfordringer.

Leveringseffektivitet

Optimering af levering effektivitet er et must, inden leveringen af ​​ZFNs. Mange fremgangsmåder kan anvendes, herunder lipidbaseret transfektion, elektroporering og nucleofectiden. Den ideelle leveringsmetode består af en, der giver den optimale blanding af levering effektivitet og celleoverlevelse. Kvantificering af disse effektivitet kan vurderes ved at levere en GFP kontrol plasmid og kvantificering ved visuel inspektion eller FACS 24 48 timer efter levering.

Cel-I-assay

Det er bydende nødvendigt, at Cel-I analysen er udført parallelt med den fornødne kontrol for at sikre, at PCR, fordøjelsen, og elektroforese parametre ikke vil forstyrre fortolkningen af ​​ZFN eksperiment. Hver pakke indeholder kontrol genomisk DNA, der bruges til at oprette Cel-I billede i certifikatet for analysen. Forstærkning fra kontrol-DNA med de medfølgende primere efterfulgt af Cel-I analysen vil gøre det muligt for brugeren at sammenligne resultaterne med, der er fastsat i Certificate of Analysis (CofA) billede, og isolere eventuelle ineffektivitet i dette aspekt af et eksperiment. En passende negative kontrol som en falsk eller GFP behandlet cellePrøven bør også være inkluderet for at tillade belysning af eventuelle ikke-specifikke spaltningsprodukter.

Kvalitativ / Kvantitativ analyse af en enkelt-celle-kloner

Efter ZFN behandling og enkelt celle kloning, kan populationer af celler kan screenes for redigering ved locus af interesse ved en række metoder. Cel-I assayet kan udføres på genomisk DNA fra kloner med henblik på at identificere kandidat kloner yderligere genotypebestemmelse. Det er vigtigt at piggen WT PCR-amplikon i prøven amplikoner i forholdet 1:1 før udførelse af Cel-I fordøje som homozygote mutante kloner indeholder homogene molekyler, og således give et negativt Cel-I analyseresultatet. En alternativ fremgangsmåde til screening af disse kandidat kloner er at udforme en PCR-primer landing direkte på ZFN målstedet. Anvendes i forbindelse med en af ​​de kontrol primere, et negativt assay resultat indikerer tab af WT-sekvensen. En heterozygote klon indeholdende mindst én WT allel yield PCR-signal, men kan adskilles fra fuldt WT kloner ved at udføre PCR i forbindelse med SYBR qPCR.

Når kandidat kloner er identificeret ved de ovennævnte fremgangsmåder, kan de genotypebestemmes af standard pyrosekventering, dyb sekventering eller andre sekventeringsreaktioner metoder. For alle sekventering metoder, bør en amplikon skabt fra klonale genomisk DNA genereret. For traditionelle pyrosekventering alleler kan adskilles ved TA-kloning af PCR-produktet, og sekventering af de enkelte kolonier. For fremgangsmåder, såsom dyb sekventering dette trin er ikke nødvendigt.

Homologi Instrueret reparation (HDR)

Denne protokol giver metoden til ZFN medieret gen-knockout via NHEJ. Integration af transgener kan også udføres ved indførelse af et donorplasmid med homologiarmene, som flankerer en ZFN kløvningspunkt. ¹¹ I dette scenario, at ZFN skabte dobbelt-strenget pause er repareret ved HDR i stedet for NHEJ. HDR instrueret integration af transgener kan bekræftes ved hjælp af lignende metoder til procedurerne i hele denne protokol.

Fejlfinding

Levering af ZFNs

ZFN afgivelse og ekspression levering kan styres ved afgivelse af en GFP eller andet sådant plasmid til visualisering og / eller kvantificering. Lav ekspression skyldes promotor uforenelighed med celletypen af ​​interesse, kan overvindes ved levering af ZFNs i mRNA-format. Endvidere kan kuldeshock fremgangsmåden anvendes til yderligere at øge effektiviteten af ZFNs i celler. ^12. Hvis mRNA anvendes, er det bydende nødvendigt, at cellerne vaskes før levering til sikre, at alle serum-afledte RNaser er blevet fjernet. Det er også klogt at tø mRNA på is, og tilføje den til cellerne i allersidste øjeblik at minimere enhver chance for nedbrydning.

Cel-I-assay

Grundlaget for Cel-I ASSAy er specifik og rigelig amplifikation af locus af interesse. Hvis ikke-specifikke amplifikationsprodukter er observeret bruge standard PCR fejlfindingsprocedurer for at øge specificiteten såsom optimering af template beløb, primer koncentration, og cykling parametre. Udfør PAGE analyse i modsætning til standard agarose elektroforese som den sidstnævnte metode ikke giver tilstrækkelig opløsning og følsomhed. Cel-I fordøje betingelser kan også optimeres, hvis der ikke spaltet produkt eller overdreven udtværing observeres. Titrering af mængden af ​​Cel-1 nuclease og / eller længden af ​​fordøjelse tid kan titreres for at forbedre disse aspekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400