Den CompoZr Custom sink-Finger nuklease (ZFN) Tjenesten gir presis genomet redigering i alle organisme eller celle linje til enhver locus defineres av brukeren. Denne artikkelen beskriver prosessen for design, produksjon, validering og implementering av CompoZr Custom ZFN Service.
Genome redigering er en kraftfull teknikk som kan brukes til å belyse gen-funksjon og det genetiske grunnlaget for sykdommen. Tradisjonell genet redigering metoder som kjemisk-baserte mutagenese eller tilfeldig integrering av DNA-sekvenser overdrar vilkårlige genetiske endringer i en samlet ineffektiv måte og krever inkorporering av uønskede syntetiske sekvenser eller bruk av avvikende kultur tilstander, potensielt forvirrende biologisk studie. Som kontrast kan forbigående ZFN uttrykk i en celle lette presis, arvelige genet redigering i en svært effektiv måte uten behov for administrasjon av kjemikalier eller integrasjon av syntetiske transgener.
Sink finger nukleaser (ZFNs) er enzymer som binder og kutte distinkte sekvenser av dobbel-strandet DNA (dsDNA). En funksjonell CompoZr ZFN enhet består av to individuelle monomere proteiner som binder en DNA "halv-site" på ca 15-18 nukleotider (se figur 1). Når to ZFN monomers "hjem" til sine tilstøtende målwebområder de DNA-cleavage domener dimerize og lage en dobbel-tråd pause (DSB) i DNA. 1 Innføring av ZFN-medierte DSBs i genomet legger grunnlaget for svært effektiv genom redigering. Imperfect reparasjon av DSBs i en celle via ikke-homologe end-bli (NHEJ) DNA reparasjon vei kan resultere i små innsettinger og slettinger (indels). Opprettelse av indels innenfor genet kodende sekvens av en celle kan resultere i frameshift og påfølgende funksjonell knockout av et gen locus ved høy effektivitet. 2. Mens denne protokollen beskriver bruken av ZFNs å skape et gen knockout, integrering av transgener kan også utføres via homologi-rettet reparasjon på ZFN cut nettstedet.
Den CompoZr Custom ZFN Tjenesten representerer en systematisk, helhetlig og godt karakterisert tilnærming til målrettet genet redigering for det vitenskapelige samfunn med ZFN teknologi. Sigma forskere samarbeider tett med etterforskerne for å 1) perform due diligence analyse inkludert analyse av relevante genet struktur, biologi, og modell system i henhold til prosjektets mål, 2) anvende denne kunnskapen til å utvikle en sunn målrettingsstrategien, 3) deretter designe, bygge, og funksjonelt validere ZFNs for aktivitet i en relevant cellelinje. Etterforskeren får positiv kontroll genomisk DNA og primere, og klar til bruk ZFN Reagensene i både plasmid DNA og in-vitro transkribert mRNA-format. Disse reagensene kan da bli levert til forbigående uttrykk i undersøkers cellelinje eller celle type valg. Prøver er deretter testet for genet redigering ved lokaliseringen av interesse ved standard molekylærbiologiske teknikker som PCR amplifisering, enzymatisk fordøye, og elektroforese. Etter positivt signal for genet redigering er oppdaget i den innledende befolkningen, celler er encellede klonet og genotypede for identifisering av muterte kloner / alleler.
Once ZFN-modifiserte cellene er isolert de har permanent og arvelig DNA modifikasjoner. Dette resulterer i evnen til å generere stabilt modifiserte cellelinjer eller avle dyr med ønskede genetiske modifikasjoner å drive forskning. CompoZr Custom ZFNs gi en robust metode for genomet redigering i en rekke celletyper. Publisering av vellykket genom redigering med ZFNs inkluderer, men er ikke begrenset til menneskelige cellelinjer, mus, rotte, sebrafisk, frosk, svin og CHO forskning modeller. 3,4,5,6,7,8,9 Evnen til å skape en dobbel-strandet pause på ønsket målområde i den angitte celletype er forsikret når de ZFNs er skikkelig leveres i en celle. Det er også mulig å utføre sekvensielle sink finger modifikasjoner til en celle for å ha mer enn en genetisk modifisering i en celle. Ti Muligheten til å velge et bestemt mål sekvens og bare endre det aktuelle locus er en primær årsak til evnen til å skape flere tilpasningerkationer.
Den CompoZr Custom ZFN sertifikat analyser blir generert med de samme reagensene gitt i settet og dermed sikre at alle komponenter i settet er blitt grundig validert for kunden suksess. Kritiske trinn i arbeidsflyten fra begynnelse til slutt er presentert nedenfor:
Cell kloning
Evnen til å isolere og utvide en gitt celle linje bør testes før du starter noen ZFN eksperimenter. Enkeltceller, bør isoleres og utvides for å sikre at en clonally-avledet befolkning er mulig. Noen cellelinjene er trassig i denne saken, og triks som berikelse for redigerte kloner, eller kultur med aircondition media kan bidra til å overvinne disse utfordringene.
Levering effektivitet
Optimalisering av levering effektivitet er et must før levering av ZFNs. Mange metoder kan brukes inkludert lipid-baserte transfeksjon, electroporation, og nucleofectipå. Den ideelle leveringsmetode består av en som gir den mest optimale blanding av levering effektivitet og celle overlevelse. Quantitating disse effektivitet kan estimeres ved å levere en GFP kontroll plasmid og quantitating ved visuell inspeksjon eller FACS 24-48hrs post-levering.
Cel-I analysen
Det er viktig at Cel-I analysen er utført parallelt med de riktige kontroller for å sikre at PCR, fordøyelsen, og elektroforese parametre ikke vil forstyrre tolkningen av ZFN eksperiment. Hver pakke inneholder kontroll genomisk DNA som brukes til å lage Cel-jeg bildet i sertifikatet for analysen. Forsterkning fra kontroll DNA med de medfølgende primere etterfulgt av Cel-I analysen vil tillate brukeren å sammenligne resultatene med det som er fastsatt i Certificate of Analysis (CofA) bilde, og isolere eventuelle ineffektivitet i dette aspektet av et eksperiment. En egnet negativ kontroll som en narr, eller GFP behandlet celleUtvalget bør også inkludert for å gi forklaring for eventuelle ikke-spesifikke cleavage produkter.
Kvalitativ / Kvantitativ analyse av encellede kloner
Etter ZFN behandling og enkelt celle kloning, kan populasjoner av celler skal skjermes for redigering ved lokaliseringen av interesse ved en rekke metoder. Cel-Jeg analysen kan gjennomføres på genomisk DNA fra kloner for å identifisere kandidater kloner for videre genotyping. Det er viktig å pigge WT PCR fragment i prøven amplikonene i forholdet 1:1 før du utfører Cel-jeg fordøye som homozygote muterte kloner vil inneholde homogene molekyler, og dermed formidle en negativ Cel-Jeg analyseresultat. En alternativ metode for screening disse kandidat kloner er å utforme en PCR-primer landing direkte på ZFN målområde. Brukes sammen med en av de kontroll primere, indikerer et negativt analyseresultat tap av WT sekvensen. En heterozygot klone inneholder minst ett WT allel vil yield PCR signal, men kan skilles fra fullt WT kloner ved å utføre PCR i sammenheng med SYBR qPCR.
Når kandidat kloner har blitt identifisert av metodene ovenfor, kan de bli genotypede av standard pyrosequencing, dyp sekvensering, eller andre sekvensering metoder. For alle sekvensering metoder, bør en fragment opprettet fra klonal genomisk DNA bli generert. For tradisjonelle pyrosequencing alleler kan bli separert av TA-kloning PCR produktet, og sekvensering de enkelte koloniene. For metoder som dypt sekvensering dette trinnet er ikke nødvendig.
Homologi Regissert Repair (HDR)
Denne protokollen gir metoden for ZFN mediert genet knockout via NHEJ. Integrering av transgener kan også utføres av innføring av en donor plasmid med homologi armer som flanke en ZFN kutt nettsted. 11. I dette scenariet, det ZFN opprettet dobbel-strandet pause blir reparert av HDR istedenfor NHEJ. HDR rettet integration av transgener kan bekreftes ved hjelp av liknende metoder til de prosedyrene som er fastsatt i denne protokollen.
Feilsøking
Levering av ZFNs
ZFN levering og uttrykk-levering kan bli kontrollert for ved levering av en GFP eller andre slike plasmid for visualisering og / eller kvantifisering. Lav uttrykk på grunn av arrangøren inkompatibilitet med celletype av interesse kan overvinnes ved levering av ZFNs i mRNA-format. I tillegg kan kuldesjokk-metoden benyttes til å ytterligere øke effekten av ZFNs i cellene. 12. Dersom mRNA blir brukt er det viktig at cellene blir vasket før levering for å sikre alle serum-deriverte Rnases har blitt fjernet. Det er også klokt å tine mRNA på is, og tilsett det til cellene i aller siste øyeblikk for å minimere sjansen for nedbrytning.
Cel-I analysen
Stiftelsen av Cel-I assay er konkret og god forsterkning av locus av interesse. Hvis ikke-spesifikke forsterkning produkter er observert bruke standard PCR feilsøkingsprosedyrer å øke spesifisiteten for eksempel optimalisering av mal beløp, primer konsentrasjon, og sykling parametere. Utføre SIDE analyse i motsetning til standard agarose-elektroforese som sistnevnte metoden ikke gir tilstrekkelig oppløsning og følsomhet. Cel-I fordøye forholdene kan også være optimalisert hvis ingen fordøyd produktet eller overdreven smearing er observert. Titrering av mengden av Cel-1 nuklease og / eller lengde av fordøyelsen tid kan titreres for å forbedre disse aspektene.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |