Den CompoZr tilpassede zink-finger-nuklease (ZFN) Service muliggør præcis genom redigering i en organisme eller celle linie ved ethvert sted defineret af brugeren. Denne artikel beskriver processen for konstruktion, fremstilling, validering og implementering af CompoZr Brugerdefineret ZFN Service.
Genom redigering er en kraftfuld teknik, der kan anvendes til at belyse genfunktioner og det genetiske grundlag for sygdom. Traditionelle genet redigering metoder, såsom kemisk-baseret mutagenese eller tilfældig integration af DNA-sekvenser giver vilkårlige genetiske ændringer i et samlet ineffektiv måde og kræver inkorporering af uønskede syntetiske sekvenser eller anvendelse af afvigende dyrkningsbetingelser, potentielt forvirrende biologisk undersøgelse. Derimod kan forbigående ZFN ekspression i en celle lette nøjagtig, arvelige genet redigering på en meget effektiv måde uden behov for indgivelse af kemikalier eller integration af syntetiske transgener.
Zinkfinger nukleaser (ZFNs) er enzymer, som binder og skæres forskellige sekvenser af dobbeltstrenget DNA (dsDNA). En funktionel CompoZr ZFN enhed består af to individuelle monomere proteiner, der binder en DNA "halv-site" på omkring 15-18 nukleotider (se figur 1). Når to ZFN monoMers "hjem" til deres tilgrænsende målsteder de DNA-spaltningsprodukterne domæner dimerisere og skabe en dobbelt-strenget pause (DSB) i DNA. 1 Indførelse af ZFN-medierede DSB'er i genomet lægger et fundament for højeffektive genom redigering. Ufuldkommen reparation af DSB'er i en celle via den ikke-homologe ende-samling (NHEJ) DNA-reparationsvej kan resultere i små insertioner og deletioner (indels). Oprettelse af indels inden for genet kodende sekvens i en celle kan resultere i rammeskift og efterfølgende funktionelle knockout af et gen locus med høj effektivitet. 2. Medens denne protokol beskriver anvendelsen af ZFNs at skabe et gen knockout integration af transgener kan også udføres via homologi-dirigeret reparation på ZFN kløvningspunkt.
Den CompoZr Brugerdefineret ZFN tjenesten udgør en systematisk, omfattende og velkarakteriseret tilgang til målrettede gen redigering for det videnskabelige samfund med ZFN teknologi. Sigma forskere arbejder tæt sammen med efterforskere til 1) perforeretrm due diligence analyse, herunder en analyse af relevante gen struktur, biologi, og model-system i henhold til projektets mål, 2) anvende denne viden til at udvikle en sund målrettet strategi, 3) og derefter design, opbygning og funktionelt validere ZFNs for aktivitet i en relevant cellelinie. Undersøgeren modtager positive kontrol genomisk DNA og primere, og klar til brug ZFN reagenser leveret i både plasmid-DNA og in vitro-transkriberet mRNA format. Disse reagenser kan derefter leveres til transient ekspression i forskerens cellelinie eller celletype valg. Prøverne testes derefter for genet redigering ved locus af interesse ved molekylærbiologiske standardteknikker, herunder PCR-amplifikation, enzymatisk fordøjelse, og elektroforese. Efter positivt signal for genet redigering detekteres i den første population, celler encellede klonet og genotypebestemmes til identifikation af mutante kloner / alleler.
Once ZFN-modificerede celler er isolerede, de har permanent og arvelige DNA-modifikationer. Dette resulterer i evnen til at generere stabilt modificerede cellelinjer eller avle dyr med ønskede genetiske modifikationer kunne foretage målinger. CompoZr Brugerdefinerede ZFNs tilvejebringe en robust fremgangsmåde til genomet redigering i en lang række celletyper. Offentliggørelse af vellykket genomet redigering med ZFNs indbefatter, men er ikke begrænset til humane cellelinier, mus, rotte, zebrafisk, frø, svin og CHO forskningsmodeller. 3,4,5,6,7,8,9 Evnen til at skabe en dobbeltstrenget brud på det ønskede målsted i det angivne celletype er sikret, når ZFNs korrekt leveres til en celle. Det er også muligt at udføre sekventielle zinkfinger modifikationer til en celle for at få mere end en genetisk modifikation i en celle. 10 Evnen til at udvælge en specifik målsekvens, og kun ændre den bestemte locus er en primær årsag til evnen til at skabe flere modifikationer.
Den CompoZr Brugerdefineret ZFN certifikat i analyse er genereret med selve reagenserne, der i sættet således sikre, at alle komponenter i sættet er blevet grundigt valideret for kunden succes. Kritiske trin i arbejdsgangen fra start til slut er præsenteret nedenfor:
Cellekloning
Evnen til at isolere og udvide en given cellelinje skal testes, før du begynder nogen ZFN eksperimenter. Enkeltceller skal isoleres og ekspanderes for at sikre, at en klonalt-afledt population er mulig. Nogle cellelinjer er genstridig i denne sag, og tricks, såsom berigelse for redigerede kloner, eller kultur med konditioneret medier kan bidrage til at overvinde disse udfordringer.
Leveringseffektivitet
Optimering af levering effektivitet er et must, inden leveringen af ZFNs. Mange fremgangsmåder kan anvendes, herunder lipidbaseret transfektion, elektroporering og nucleofectiden. Den ideelle leveringsmetode består af en, der giver den optimale blanding af levering effektivitet og celleoverlevelse. Kvantificering af disse effektivitet kan vurderes ved at levere en GFP kontrol plasmid og kvantificering ved visuel inspektion eller FACS 24 48 timer efter levering.
Cel-I-assay
Det er bydende nødvendigt, at Cel-I analysen er udført parallelt med den fornødne kontrol for at sikre, at PCR, fordøjelsen, og elektroforese parametre ikke vil forstyrre fortolkningen af ZFN eksperiment. Hver pakke indeholder kontrol genomisk DNA, der bruges til at oprette Cel-I billede i certifikatet for analysen. Forstærkning fra kontrol-DNA med de medfølgende primere efterfulgt af Cel-I analysen vil gøre det muligt for brugeren at sammenligne resultaterne med, der er fastsat i Certificate of Analysis (CofA) billede, og isolere eventuelle ineffektivitet i dette aspekt af et eksperiment. En passende negative kontrol som en falsk eller GFP behandlet cellePrøven bør også være inkluderet for at tillade belysning af eventuelle ikke-specifikke spaltningsprodukter.
Kvalitativ / Kvantitativ analyse af en enkelt-celle-kloner
Efter ZFN behandling og enkelt celle kloning, kan populationer af celler kan screenes for redigering ved locus af interesse ved en række metoder. Cel-I assayet kan udføres på genomisk DNA fra kloner med henblik på at identificere kandidat kloner yderligere genotypebestemmelse. Det er vigtigt at piggen WT PCR-amplikon i prøven amplikoner i forholdet 1:1 før udførelse af Cel-I fordøje som homozygote mutante kloner indeholder homogene molekyler, og således give et negativt Cel-I analyseresultatet. En alternativ fremgangsmåde til screening af disse kandidat kloner er at udforme en PCR-primer landing direkte på ZFN målstedet. Anvendes i forbindelse med en af de kontrol primere, et negativt assay resultat indikerer tab af WT-sekvensen. En heterozygote klon indeholdende mindst én WT allel yield PCR-signal, men kan adskilles fra fuldt WT kloner ved at udføre PCR i forbindelse med SYBR qPCR.
Når kandidat kloner er identificeret ved de ovennævnte fremgangsmåder, kan de genotypebestemmes af standard pyrosekventering, dyb sekventering eller andre sekventeringsreaktioner metoder. For alle sekventering metoder, bør en amplikon skabt fra klonale genomisk DNA genereret. For traditionelle pyrosekventering alleler kan adskilles ved TA-kloning af PCR-produktet, og sekventering af de enkelte kolonier. For fremgangsmåder, såsom dyb sekventering dette trin er ikke nødvendigt.
Homologi Instrueret reparation (HDR)
Denne protokol giver metoden til ZFN medieret gen-knockout via NHEJ. Integration af transgener kan også udføres ved indførelse af et donorplasmid med homologiarmene, som flankerer en ZFN kløvningspunkt. 11 I dette scenario, at ZFN skabte dobbelt-strenget pause er repareret ved HDR i stedet for NHEJ. HDR instrueret integration af transgener kan bekræftes ved hjælp af lignende metoder til procedurerne i hele denne protokol.
Fejlfinding
Levering af ZFNs
ZFN afgivelse og ekspression levering kan styres ved afgivelse af en GFP eller andet sådant plasmid til visualisering og / eller kvantificering. Lav ekspression skyldes promotor uforenelighed med celletypen af interesse, kan overvindes ved levering af ZFNs i mRNA-format. Endvidere kan kuldeshock fremgangsmåden anvendes til yderligere at øge effektiviteten af ZFNs i celler. 12. Hvis mRNA anvendes, er det bydende nødvendigt, at cellerne vaskes før levering til sikre, at alle serum-afledte RNaser er blevet fjernet. Det er også klogt at tø mRNA på is, og tilføje den til cellerne i allersidste øjeblik at minimere enhver chance for nedbrydning.
Cel-I-assay
Grundlaget for Cel-I ASSAy er specifik og rigelig amplifikation af locus af interesse. Hvis ikke-specifikke amplifikationsprodukter er observeret bruge standard PCR fejlfindingsprocedurer for at øge specificiteten såsom optimering af template beløb, primer koncentration, og cykling parametre. Udfør PAGE analyse i modsætning til standard agarose elektroforese som den sidstnævnte metode ikke giver tilstrækkelig opløsning og følsomhed. Cel-I fordøje betingelser kan også optimeres, hvis der ikke spaltet produkt eller overdreven udtværing observeres. Titrering af mængden af Cel-1 nuclease og / eller længden af fordøjelse tid kan titreres for at forbedre disse aspekter.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |