הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Summary

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

Abstract

הגנום עריכה היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי להבהיר את תפקיד הגן ואת הבסיס הגנטי של המחלה. הגן המסורתית עריכת שיטות כגון mutagenesis הכימי מבוסס או שילוב אקראי של רצפי DNA להעניק שינויים גנטיים חסרות הבחנה בצורה יעילה הכוללת ודורשים שילוב של רצפים סינתטיים לא רצויים או שימוש התנאים תרבות חריגים, פוטנציאל מבלבל המחקר הביולוגי. לעומת זאת, הביטוי ZFN חולפת בתא יכול להקל מדויק, תורשתי עריכת הגן בצורה היעילה ביותר ללא צורך בממשל של כימיקלים או שילוב של transgenes סינתטיים.

Nucleases אצבע אבץ (ZFNs) הם אנזימים אשר נקלטות וחותכים רצפים שונים של גדילי הדנ"א הכפול (dsDNA). יחידה תפקודית CompoZr ZFN מורכב משני חלבונים monomeric בודדים אשר נקלטות על ידי ה-DNA "חצי אתר" של כ 15-18 נוקלאוטידים (ראה איור 1). כאשר 2 ZFN מונומרס "בית" לאתרים סמוכים היעד שלהם את ה-DNA מחשוף תחומים dimerize וליצור הפסקה הגדיל פעמיים (DSB) ב-DNA. ¹ מבוא של ZFN בתיווך DSBs בגנום מניח היסודות עריכת הגנום היעילה ביותר. תיקון מושלם של DSBs בתא דרך לא הומולוגיים בסוף שהצטרף מסלול (NHEJ) תיקון דנ"א יכול לגרום הוספות קטנות ומחיקות (indels). יצירת indels בתוך רצף הגן המקודד של התא יכול לגרום frameshift ו בנוקאאוט תפקודית הבאות של לוקוס הגן על יעילות גבוהה. ² אמנם פרוטוקול זה מתאר את השימוש ZFNs ליצור פצצה גן, שילוב של transgenes יכול גם להתנהל דרך הומולוגיה מכוונת לתיקון במקום לחתוך ZFN.

אישית CompoZr ZFN שירות מייצג גישה שיטתית, מקיפה, היטב מאופיין לעריכה הגן ממוקד עבור הקהילה המדעית עם הטכנולוגיה ZFN. מדענים סיגמא לעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם חוקרים 1) perfoבדיקת RM ניתוח בשל כולל ניתוח של מבנה הגן ביולוגיה רלוונטי,, ​​מערכת מודל בהתאם מטרות הפרויקט, 2) ליישם את הידע הזה כדי לפתח אסטרטגיה קול מיקוד, 3) ואז לתכנן, לבנות, והן מבחינה תפקודית לאמת ZFNs לפעילות רלוונטי התא קו. החוקר מקבל שליטה חיובית הדנ"א הגנומי primers, ומוכן לשימוש ריאגנטים ZFN שסופקו ב-DNA הן הפלסמיד ואת חוץ גופית בפורמט ה-mRNA עיבד. ריאגנטים אלה עשויים אז להיות מועברת לביטוי חולף בתור תא של החוקר או סוג תא של בחירה. דגימות נבדקו אז מוקד של עניין קנה מידה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כולל הגברה PCR, תקציר האנזימטית, ו אלקטרופורזה לעריכה הגן. לאחר איתות חיובי עבור עריכת הגן מזוהה בקרב האוכלוסייה הראשונית, הם תאים מתא בודד לשכפל ו genotyped לזיהוי של שיבוטים / אללים מוטנטים.

Protocol

1. תהליך עיצוב מותאם אישית ZFN

1. כדי לזרז את תהליך התכנון ZFN, החוקר צריך לספק:
• מידע על הגן היעד כגון שם גנים, מינים, וכן ביאור / מספר זיהוי הגן.
• בבירור מעל כל מטרת הניסוי (למשל, נוק או הפיל)
• כל הגורמים הספציפיים של היעד הגן הכוללים מבנה הגן טיפוסית, ביולוגיה מיוחד מעורב לוקוס גנטי, או כל מקום אחר הומולוגיים אזורים בגנום.
• טווח מסוים של רצף ה-DNA של אצבע אבץ nucleases להתמקד.
2. צוות ביואינפורמטיקה Sigma עורכת בעיצוב ZFN סיליקו לפתח הראשונים אצבע אבץ אתרי היעד.
3. היעד הראשוני אתרים ZFN ניתנים יועץ ZFN טכנית מדעית. עבור פרויקטים מורכבים יותר מבחינה טכנית, זה מדען Sigma עובד עם החוקרים לפתח אסטרטגיית הפרויקט.
4. אינפורמטיקה מספקת היעד האתרים המובילים ZFN לחוקר לבדיקה. עם אישור של אתרי מטרה פוטנציאליים ZFN, מידע זה מסופק צוות הפקה ZFN כדי להתחיל את תהליך הייצור ZFN.

2. הייצור מותאם אישית ZFN

1. ארכיון סיגמא של מודולים אצבע אבץ משמש כדי להרכיב את העיצובים ZFN מאושרות.
2. עיצוב כל ZFN מורכב ורצף אומת על פלטפורמה תפוקה גבוהה שיבוט.
3. לאחר הייצור של כל העיצובים ZFN הוא להשלים את כל ZFN נשלח אימות.

3. אימות של ZFNs אישית

1. ZFN פרויקטיםהמין האנושי, עכבר, חולדה או CHO מאומתים על שורות תאים שאפיינו גם עבור כל מין, assay המבוסס על שמרים משמש אורגניזמים אחרים או סוגי תאים.
2. בונה ZFN מועברים לתוך קו התא המתאים ידי nucleofection ואת ZFNs באים לידי ביטוי.
3. ה-DNA נאסף מתוך מאגר של תאים ZFN transfected והאזור עניין מוגבר PCR.
4. Assay-1 CEL מתנהל ואילך מוצר ה-PCR. ג'ל אלקטרופורזה מנוהלת על assay cel-1 לפעילות ZFN תוקף.
5. ZFN הגבוהה ביותר בפעילות העיצוב כמו אושר על ידי assay cel-1 מסופק מכן ללקוח. ZFNs מועברות ב-mRNA ו-DNA פלסמיד יחד עם primers ה-PCR עבור assay cel-1 ו-DNA הגנומי כביקורת חיובית.

4. מסירת ZFNs מאומת על ידי Nucleofection

1. זרע התאים בצפיפות של 2x10 ⁵ תאים למ"ל יום לפני nucleofection.
2. ביום nucleofection,להוציא את קו סלולרי Nucleofector ערכת V ולתת חם לטמפרטורת החדר.
3. מוסיפים את תוספת הפתרון Nucleofection V לפי הפרוטוקול של היצרן.
4. לספור את התאים. צפיפות התאים צריך להיות בין 2.5-5x10 ⁵ תאים למ"ל.
5. מלאו צלחת 6-היטב עם 2ml של המדיום בכל היטב מראש חם CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני nucleofection.
6. סרכזת 2x10 ⁶ תאים לכל transfection ⁽⁶ בסך הכל 8x10) בשעה 200xg במשך 5 דקות.
7. לשטוף את התאים פעמיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS).
8. הכינו צינורות הניסוי: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN)
9. הסר את הצלחת היטב המכיל 6-Media משלב (6.5) מתוך האינקובטור.
10. Resuspend תאים μl 400 (100 μl / התגובה) של פתרון Nucleofection V.
11. תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים ל-DNA או כל mRNA המכיל צינור. Transfאה את התערובת ל 2 מ"מ electroporation קובט ו nucleofect על Nucleofector עם תוכנית מתאימה.
12. מיד לאחר nucleofection של מדגם זה, השתמש פיפטה העברת להוסיף ~ 500 μl של המדיום prewarmed מהצלחת 6-גם בשלב (6.9) כדי קובט. ואז, בזהירות להעביר תאים קובט עד בינוני prewarmed שנותר בצלחת 6 היטב.
13. לסיים את כל התגובות ולהחזיר את צלחת 6-היטב CO ₂ באינקובטור ב 37 ° C.

5. קציר הדנ"א הגנומי לאחר מסירת ZFNs

1. 6 גם בצלחת - לא לקצור את כל התאים אספו. חשוב לשמור על תרבות כדי שיהיה תאים לשבט תא בודד דילול לאחר שתוודא כי יש לך מוצרים cel-1 עיכול. אחד עד שלושה ימים לאחר nucleofection לאסוף את התאים כדי להכין את ה-DNA כרומוזומלי באמצעות DNA GenElute היונקים הגנום ערכת Miniprep.

6. Cel-1 Assay

PCR להגביר את הדנ"א הגנומי מן דגימות transfected ZFN והשליטה חיובית דנ"א גנומי המסופק בערכה, באמצעות primers המצורף. תגובת PCR מוגדר עם התנאים הבאים: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN).

כדי ליצור heteroduplexes מן homoduplexes ה-PCR לקחת 10 μl של תגובה PCR מכל מדגם ZFN לטפל בתוספת מלאה להשתמש בתוכנית הבאה על thermocycler:
95 מעלות צלזיוס, 10 דקות
95 ° C עד 85 ° C, -2 ° C / 2
85 ° C עד 25 ° C, -0.1 ° C / 2
4 ° C, ללא הגבלת זמן

הוסף 1 μl של משפר ו 1 μl של nuclease S (מ מס 'קטלוגי Transgenomic 706025) לתגובה כל דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 20-40 דקות.

הפעל את digestions על ג'ל עמוד TBE 10% עם סמנים מתאימים, כגון סולם WideRange DNA DirectLoad (מק"ט D7058) (ראה תוצאות עלון מותאם אישית טכנית ZFN).

עלאיתות חיובי לספירה זוהה ZFN שטופלו על ידי אוכלוסיות assay cel-I, המשך בידוד ואפיון משובט ו.

7. בידוד אפיון משובט ו

1. מתא בודד לשבט את ZFN שטופלו דגימות בשיטות סטנדרטיות כולל FACS ו שיבוט דילול.
2. אפשר המשובטים להרחיב במידה מספקת, ואז לפצל חלק חלקם של התאים לקציר הדנ"א הגנומי, הקפאת בחזרה את יתרת חומר הפקידה.
3. להגביר את הדנ"א הגנומי מן שיבוטים באמצעות cel-I primers ולנתח amplicon ידי assay cel-I (עם או בלי ה-DNA WT זינק ב), או לחילופין להשתמש amplicon להמשיך ישירות genotyping.
4. המועמד שיבוטים גנוטיפ מזוהה כבעל אללים בעריכת השיטה המועדפת.

8. נציג תוצאות

דוגמה כולו CompoZr ZFN העבודה מוצגת באיור 2. ZFNs מועברותלתאים שם נקלטות ודבק את רצף ה-DNA המתאים היוצרת הפסקה פעמיים תקועים (DSB). תהליך התיקון הטבעי, שאינם הומולוגיים בסופו של דבר להצטרף (NHEJ), תיקון DSB. בכמה מקרים חריגים תוצאות NHEJ ב הכניסה מחיקה או החלפה של נוקלאוטידים. PCR הגברה של שנקטפו תוצאות הדנ"א הגנומי במבנה heteroduplex בין סוג פראי amplicons להשתנות אחרי denaturation / צעד חישול התגובה PCR. תוספת של cel-1 תוצאות האנזים המחשוף של כל מולקולות heteroduplex. Cel-1 תוצאות נפתרים על ידי ניתוח עמוד לאשר מחשוף ZFN. איור 3 מספק סכימטי של assay cel-1 ואת התוצאות הצפויות.

נציג cel-1 תוצאות כלולים איורים 4 ו -5 איור 4 מכיל תוצאות זוג פעיל מאוד ZFNs (21%) ב K562 תאים,. איור 5 מכיל תוצאות זוג פחות פעילים (2.4%) של ZFNs בK562 תאים. פעילות ZFN הוא אישר דמויות הן על ידי נוכחות של שני קטעי ה-PCR מתחת שבר PCR ההורים.

באיור 1. ZFNs ייצוג nucleases אצבע קשורות אבץ. מתוכננים חלבונים המורכבים אצבע אבץ DNA-binding תחום התמזגו לתחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI. כאשר קשורים כמו heterodimer, ZFNs ליצור הפסקה פעמיים תקועים על רצף DNA מסוים המשתמש.

איור 2. סכמטי של זרימת עבודה מותאמים אישית ZFN שירות. ייצוג גרפי של זרימת עבודה כדי ליצור קו תאים מהונדסים גנטית באמצעות ZFNs CompoZr.

איור 3. סכמטי של assay cel-1 ואת התוצאות.) ZFN o פלסמיד mRNA R מועבר לתאים. ב) הביעו לאגד ZFNs וחותכים רצף היעד שלהם ליצור הפסקה גדילי כפול (DSB) בחלק של תאים. ג) תיקון החריג של DSBs מסוימים על ידי אי - שהצטרף בסופו של הומולוגיים התוצאות הכניסה נוקלאוטיד או מחיקה. D) הדנ"א הגנומי נאסף ממאגר transfected של תאים מוגבר על מוקד של עניין. EF) PCR המוצר הוא מפוגל מחדש מרותק יצירת היווצרות heteroduplex בין סוג פראי amplicons שונה. ז) cel-1 endonuclease אי התאמה ב assay תוצאות המחשוף של מולקולות heteroduplex. ע) cel-1 אנזים מעכל נפתרות על ידי. היחס הנצפה של המוצר מחשוף ללהקה Parenteral, נקבע על ידי ImageJ תוכנה, מציין לחתוך חלק והיעילות של ZFNs את.

באיור 4. Cel-1 נובע ZFNs פעילים 21% התוכנה ImageJ זמין בכתובת:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

איור 5. Cel-1 נובע% 2.4 ZFNs פעילים ImageJ התוכנה ניתן למצוא באתר:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .

Discussion

פעם ZFN-Modified תאים מבודדים להם קבוע תורשתי שינוי ה-DNA. התוצאה היא היכולת ליצור שורות תאים מהונדסים ביציבות או בעלי חיים גזע עם שינויים גנטיים הרצוי לערוך מחקר. CompoZr ZFNs מותאמים אישית לספק שיטה יציבה עבור עריכת הגנום במגוון רחב של סוגי תאים. פרסום הגנום מוצלחת עם עורך ZFNs כולל אך לא מוגבל ל שורות תאים אנושיים, עכבר, חולדה, דג הזברה, צפרדע, חזירי ומודלים צ מחקר. ^{3,4,5,6,7,8,9} היכולת ליצור פעמיים תקועים הפסקה באתר היעד הרצוי בסוג תא מסוים מובטח כאשר ZFNs מועברות כמו שצריך אל תוך התא. כמו כן, ניתן לבצע עוקבים אצבע שינויים אבץ לתא כדי שיהיה יותר הנדסה גנטית בתוך תא. ¹⁰ היכולת לבחור רצף יעד ספציפי ורק לשנות את מוקד מסוים הוא הגורם העיקרי היכולת ליצור מספר רב של modifiקטיונים.

אישית CompoZr תעודת ZFN ניתוח נוצרת עם ריאגנטים במיוחד המסופק בערכה ובכך להבטיח כי כל מרכיבי הערכה אומתו באופן יסודי להצלחת הלקוח. השלבים הקריטיים של זרימת העבודה מתחילתו ועד סופו מוצגים להלן:

התא שיבוט

היכולת לבודד להרחיב את קו תא נתון יש לבדוק לפני תחילת כל הניסויים ZFN. תאים בודדים יש לבודד והרחיב על מנת להבטיח כי האוכלוסייה clonally הנגזרות אפשרי. כמה שורות תאים הם הסרבן בעניין זה, ועל טריקים כגון העשרה שיבוטים ערוכים, או תרבות עם התקשורת מיזוג יכול לעזור להתגבר על אתגרים אלה.

משלוח יעילות

אופטימיזציה של יעילות האספקה ​​היא חובה לפני מסירת ZFNs את. שיטות רבות ניתן להשתמש גם transfection השומנים מבוסס, electroporation, ו nucleofectiב. שיטת הצגה אידיאלית מורכבת זו מאפשרת את השילוב האופטימלי ביותר של יעילות מסירה הישרדות התא. Quantitating אלה יעילות ניתן להעריך על ידי אספקת שליטה GFP פלסמיד ו quantitating על ידי בדיקה ויזואלית או FACS 24-48hrs שלאחר הלידה.

Cel-I assay

זוהי חובתו של cel-assay אני מתבצע במקביל הבקרות המתאימות על מנת להבטיח כי הפרמטרים PCR, מערכת העיכול, וכן אלקטרופורזה לא יפריע פרשנות של הניסוי ZFN. כל ערכה כוללת בקרת DNA הגנומי שבו נעשה שימוש כדי ליצור את התמונה cel-I באישור של ניתוח. הגברה מ-DNA השליטה עם primers הניתנים ואחריו assay cel-I תאפשר למשתמש להשוות את התוצאות עם זה המסופק תעודת ניתוח (CofA) תמונה, ולבודד כל חוסר יעילות פוטנציאליים היבט זה של הניסוי. שליטה שליליות מתאימות כגון מעושה, או GFP טיפול בתאמדגם יש לכלול גם לאפשר הבהרה של כל המוצרים שאינם ספציפיים מחשוף.

איכותי / כמותי וניתוח של תא יחיד שיבוטים

לאחר הטיפול ZFN ו שיבוט תא בודד, אוכלוסיות של תאים עשויים להיות מוקרן לעריכה על מוקד של עניין על ידי מספר שיטות. Cel-assay אני יכול להתנהל על הדנ"א הגנומי של שיבוטים לצורך זיהוי שיבוטים המועמד עבור genotyping נוסף. חשוב amplicon ספייק PCR WT לתוך amplicons מדגם ביחס 1:01 לפני ביצוע cel-I לעיכול כמו שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים יכיל מולקולות הומוגניות, ובכך להעביר תוצאה שלילית cel-I assay. שיטה חלופית לסינון מועמדים אלה שיבוטים היא לעצב 1 הנחיתה PCR פריימר ישירות באתר היעד ZFN. הפועל בשיתוף עם אחד primers שליטה, תוצאה assay שלילי מצביע על אובדן הרצף WT. שיבוט הטרוזיגוטיים המכיל לפחות אלל WT יהיה yIELD PCR האות, אבל יכול להיות מופרדים מן שיבוטים WT באופן מלא על ידי ביצוע PCR בהקשר של SYBR QPCR.

לאחר שיבוטים המועמד זוהו על ידי השיטות הנ"ל, ניתן genotyped ידי pyrosequencing רגיל, סידור עמוק, או רצף שיטות אחרות. לכל שיטות רצף, amplicon נוצר מ-DNA גנומי משובט צריך להיות שנוצר. עבור אללים pyrosequencing המסורתיים ניתן הפרדה לפי המוצר ת"א שיבוט PCR, ו רצף המושבות בודדים. שיטות כגון עמוק רצף שלב זה אינו הכרחי.

הומולוגיה תיקון בימוי (HDR)

פרוטוקול זה מספק שיטה בנוקאאוט גן ZFN מתווכת דרך NHEJ. שילוב transgenes ניתן גם שנערך על ידי הכנסת התורם פלסמיד בזרועות הומולוגיה כי האגף חתך ZFN באתר. ¹¹ בתרחיש זה, ZFN נוצר פעמיים תקועים הפסקה תוקן על ידי HDR במקום NHEJ. HDR מכוונת אניntegration של transgenes ניתן אישר שימוש בשיטות דומות בהליכים הניתנים בכל פרוטוקול זה.

פתרון בעיות

מסירת ZFNs

משלוח ZFN וביטוי משלוח יכול להיות נשלט על ידי אספקה ​​של ה-GFP או אחר כגון פלסמיד עבור להדמיה / או לכמת. ביטוי נמוך בשל חוסר תאימות עם מקדם סוג התא של עניין ניתן להתגבר על ידי אספקה ​​של ZFNs בפורמט ה-mRNA. בנוסף, שיטת ההלם הקר עשוי להיות מנוצל כדי להגביר עוד יותר את היעילות של ZFNs בתאים. ¹² אם mRNA משמש זוהי חובתו של תאים נשטפים לפני המסירה על מנת להבטיח את כל סרום הנגזרות Rnases הוסרו. כמו כן, נבון להפשיר את ה-mRNA על קרח, ולהוסיף אותו אל התאים ברגע האחרון ממש כדי למזער כל סיכוי השפלה.

Cel-I assay

קרן של אסא cel-Iy הוא הגברה ספציפי נרחב של מוקד של עניין. אם לא מוגדרים מוצרים הגברה הם נצפו להשתמש תקן ה-PCR הליכי פתרון בעיות כדי להגדיל את הספציפיות כגון אופטימיזציה של כמות תבנית, ריכוז פריימר, ורכיבה על אופניים פרמטרים. ביצוע ניתוח PAGE לעומת agarose אלקטרופורזה רגילה שיטה זו האחרונה אינה מספקת רזולוציה רגישות נאותים. Cel-I תנאים לקט עשוי גם להיות מותאם אם לא מתעכל המוצר או מריחות מוגזמת הוא ציין. טיטרציה של כמות cel-1 nuclease ו / או משך זמן העיכול ניתן טיטרציה כדי לשפר את ההיבטים האלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400