CompoZr कस्टम जिंक फिंगर Nuclease सेवा के (ZFN) किसी भी जीव या किसी भी उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित ठिकाना पर सेल लाइन में सटीक जीनोम संपादन के लिए सक्षम बनाता है. इस लेख के डिजाइन, निर्माण, मान्यता और CompoZr कस्टम ZFN सेवा के कार्यान्वयन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA “half-site” of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers “home” to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator’s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.
एक बार ZFN संशोधित कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं वे स्थायी है और डीएनए संशोधन पैतृक. यह stably संशोधित सेल लाइनों वांछित आनुवंशिक संशोधन के साथ या नस्ल के पशुओं को उत्पन्न करने के लिए अनुसंधान का संचालन करने की क्षमता में यह परिणाम है. CompoZr कस्टम ZFNs जीनोम कोशिका प्रकार की एक विस्तृत विविधता में संपादन के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करते हैं. सफल ZFNs साथ संपादन जीनोम का प्रकाशन शामिल है, लेकिन मानव कोशिका लाइनों, माउस, चूहा, zebrafish, मेंढक, सुअर का और चो अनुसंधान के मॉडल तक सीमित नहीं है 3,4,5,6,7,8,9. बनाने की क्षमता डबल असहाय निर्दिष्ट सेल प्रकार में वांछित लक्ष्य साइट पर तोड़ जब ZFNs ठीक से एक सेल में वितरित कर रहे हैं आश्वासन दिया है. यह भी संभव है एक सेल करने के लिए अनुक्रमिक जस्ता उंगली संशोधनों प्रदर्शन के क्रम में एक कोशिका के भीतर एक से अधिक आनुवंशिक संशोधन है 10 के लिए एक विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रम का चयन करें और केवल संशोधित करने के लिए एकाधिक बनाने की क्षमता के लिए है कि विशेष रूप से ठिकाना एक प्रमुख कारण है की क्षमता modifiफैटायनों.
CompoZr कस्टम ZFN विश्लेषण के प्रमाण पत्र बहुत किट में इस प्रकार आश्वस्त है कि किट के सभी घटकों को अच्छी तरह से ग्राहक सफलता के लिए मान्य किया गया है प्रदान अभिकर्मकों के साथ उत्पन्न होता है. अंत तक शुरू से वर्कफ़्लो का महत्वपूर्ण कदम नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं:
सेल क्लोनिंग
को अलग करने के लिए और एक दिया सेल लाइन का विस्तार करने की क्षमता किसी भी ZFN प्रयोगों की शुरुआत से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए. एकल कक्षों और अलग किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि आबादी clonally व्युत्पन्न संभव है विस्तार है. कुछ सेल लाइनों इस मामले में अड़ियल हैं, और संपादित क्लोन के लिए संवर्धन, या कंडीशन मीडिया के साथ संस्कृति के रूप में ऐसी चालें करने के लिए इन चुनौतियों से उबरने में मदद कर सकते हैं.
वितरण दक्षता
वितरण दक्षता का अनुकूलन ZFNs के वितरण से पहले जरूरी है. कई तरीकों लिपिड आधारित अभिकर्मक, electroporation, और nucleofecti के सहित इस्तेमाल किया जा सकता हैपर. आदर्श वितरण पद्धति एक है कि वितरण दक्षता और सेल अस्तित्व के सबसे इष्टतम मिश्रण देता है के होते हैं. इन क्षमता Quantitating के दृश्य निरीक्षण या FACS 24 48hrs प्रसव के बाद से एक GFP नियंत्रण के प्लाज्मिड और quantitating देने से अनुमान लगाया जा सकता है.
Cel – मैं परख
यह आवश्यक है कि मैं Cel – परख समानांतर में उचित नियंत्रण के साथ किया जाता है करने के लिए सुनिश्चित करें कि पीसीआर, पाचन, और वैद्युतकणसंचलन मापदंडों ZFN प्रयोग की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. प्रत्येक किट नियंत्रण जीनोमिक डीएनए कि Cel मैं विश्लेषण के प्रमाण पत्र में छवि बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है शामिल हैं. प्रदान की Cel – मैं परख के बाद प्राइमरों के साथ नियंत्रण डीएनए से प्रवर्धन उपयोगकर्ता का विश्लेषण प्रमाणपत्र (CofA) छवि में प्रदान की गई है कि के साथ परिणाम की तुलना करने के लिए अनुमति देगा, और एक प्रयोग के इस पहलू में किसी भी संभावित inefficiencies को अलग. के रूप में एक नकली, या GFP एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण सेल का इलाजनमूना भी किसी भी गैर विशिष्ट दरार उत्पादों की व्याख्या की अनुमति देने के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
एकल सेल क्लोनों की / गुणात्मक मात्रात्मक विश्लेषण
ZFN उपचार और एकल कोशिका क्लोनिंग के बाद, कक्षों की आबादी तरीकों की एक संख्या से ब्याज का ठिकाना पर संपादन के लिए जांच की जा सकती है. Cel – मैं परख क्लोन से जीनोमिक डीएनए पर आगे जीनोटाइपिंग के लिए उम्मीदवार क्लोन की पहचान के उद्देश्य के लिए आयोजित किया जा सकता है. यह नमूना amplicons में एक 1:1 अनुपात में कील WT पीसीआर amplicon के लिए महत्वपूर्ण है से पहले प्रदर्शन Cel मैं के रूप में समयुग्मजी उत्परिवर्ती क्लोन सजातीय अणु होते पचाने में है, और इस तरह एक नकारात्मक परिणाम Cel मैं परख हूं. इन उम्मीदवार क्लोन स्क्रीनिंग के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के सीधे ZFN लक्ष्य साइट पर एक पीसीआर प्राइमर लैंडिंग डिजाइन है. नियंत्रण प्राइमरों के साथ संयोजन के रूप में प्रयुक्त, एक नकारात्मक परख परिणाम WT अनुक्रम के नुकसान को इंगित करता है. एक इतरयुक्ती कम से कम एक WT एलील युक्त क्लोन y जाएगाield पीसीआर संकेत, लेकिन SYBR qPCR के संदर्भ में पीसीआर के प्रदर्शन से पूरी तरह से WT क्लोन से अलग किया जा सकता है.
एक बार उम्मीदवार क्लोन उपरोक्त तरीकों से पहचान की गई है, वे मानक pyrosequencing, गहरी अनुक्रमण या अन्य अनुक्रमण विधियों द्वारा genotyped किया जा सकता है. सभी अनुक्रमण विधि के लिये, एक प्रतिरूप जीनोमिक डीएनए से बनाया amplicon के उत्पन्न किया जाना चाहिए. पारंपरिक pyrosequencing alleles के लिए TA-क्लोनिंग पीसीआर उत्पाद से अलग किया जा सकता है, और व्यक्तिगत कालोनियों अनुक्रमण. गहरी अनुक्रमण इस कदम के रूप में इस तरह के तरीके के लिए आवश्यक नहीं है.
अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (HDR)
इस प्रोटोकॉल के माध्यम से मध्यस्थता जीन पीटा ZFN NHEJ के लिए विधि प्रदान करता है. Transgenes के एकीकरण एक अनुरूपता हथियार के साथ प्लाज्मिड दाता का परिचय द्वारा भी आयोजित हो सकती है कि पार्श्व ZFN कटौती इस परिदृश्य में. साइट 11, ZFN बनाया डबल असहाय को तोड़ने के बजाय HDR NHEJ द्वारा मरम्मत की है. HDR मैं निर्देशन कियाtransgenes की ntegration इस प्रोटोकॉल भर में प्रदान की प्रक्रियाओं के लिए इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है.
समस्या निवारण
ZFNs की डिलिवरी
ZFN वितरण और अभिव्यक्ति वितरण GFP या अन्य इस तरह के दृश्य और / या quantitation के लिए प्लाज्मिड. की डिलीवरी के लिए नियंत्रित किया जा सकता है कम ब्याज की सेल प्रकार के साथ प्रमोटर असंगति के कारण अभिव्यक्ति mRNA के प्रारूप में ZFNs की डिलीवरी के द्वारा दूर किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ठंड झटका विधि करने के लिए आगे कोशिकाओं में ZFNs की प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है 12. यदि mRNA के लिए प्रयोग किया जाता है यह जरूरी है कि कोशिकाओं को प्रसव के लिए पहले धो रहे हैं सुनिश्चित करने के सभी सीरम व्युत्पन्न Rnases हटा दिया गया है. बर्फ पर mRNA के पिघलना, और बहुत आखिरी पल में कोशिकाओं को जोड़ने के लिए गिरावट के लिए कोई मौका कम से कम यह भी समझदारी है.
Cel – मैं परख
Cel मैं Assa के नींवy ब्याज की बिन्दुपथ की विशिष्ट और पर्याप्त प्रवर्धन है. यदि गैर विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों मनाया जाता है मानक पीसीआर समस्या निवारण प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए ऐसे टेम्पलेट राशि का अनुकूलन, प्राइमर एकाग्रता, और साइकिल चालन के मापदंडों के रूप में विशिष्टता वृद्धि. पृष्ठ विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में मानक agarose वैद्युतकणसंचलन के लिए विरोध के रूप में उत्तरार्द्ध विधि पर्याप्त संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान नहीं करता है. Cel मैं पचाने शर्तों को भी अगर कोई से पचा उत्पाद या अत्यधिक smearing मनाया जाता है अनुकूलित किया जा सकता है. Cel-1 nuclease और या पाचन समय की लंबाई / राशि का अनुमापन इन पहलुओं में सुधार करने के लिए में titrated किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |