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Biology

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

doi: 10.3791/3304 Published: June 14, 2012

Summary

CompoZr 정의 아연 핑거 Nuclease (ZFN) 서비스는 사용자가 정의한 모든 현장에서 모든 유기체 또는 세포 라인의 정밀 게놈 수정을 가능하게합니다. 이 문서 CompoZr 정의 ZFN 서비스의 설계, 제조, 검증 및 구현을위한 프로세스를 설명합니다.

Abstract

게놈 편집 유전자 기능과 질병의 유전적 기초를 명료하게하다하는 데 사용할 수있는 강력한 기술입니다. 이러한 DNA 시퀀스의 화학 기반의 돌연변이 유발 또는 임의의 통합과 같은 방법을 수정하는 전통적인 유전자는 전체 비효율적인 방법으로 무차별 유전자 변화를 부여하고 바람직하지 합성 시퀀스의 결합을 필요로하거나 잠재적으로 생물학 연구를 혼동하고, 탈선 문화 조건을 사용하지 않습니다. 반대로 세포에서 일시적 ZFN 표현은 정확한 촉진 수있는 합성 transgenes의 화학 물질이나 통합 관리를위한 필요없이 고효율 방식으로 유전자 편집을 물려 전할 수있는.

아연 손가락 nucleases (ZFNs)는 이중 좌초된 DNA (dsDNA)의 서로 다른 시퀀스를 바인딩하고 절단 효소입니다. 기능성 CompoZr ZFN 유닛은 약 15-18 세포핵의 DNA를 "반 사이트를 '바인딩이 개별 monomeric 단백질 (그림 1 참조)으로 구성되어 있습니다. 둘이 언제 ZFN 모노DNA-절단 도메인 dimerize과 DNA의 이중 가닥 브레이크 (DSB). 게놈의 ZFN - 중재 DSBs 1 소개 고효율 게놈 편집을위한 토대를 낳는를 만드는 그들의 인접 타겟 사이트에 mers "홈". 비 동종 최종 합류 (NHEJ)의 DNA 복구 경로를 통해 세포의 DSBs의 불완전 복구가 작고 삽입 및 삭제 (indels)이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유전자 녹아웃을 만들 ZFNs의 사용, transgenes의 통합을 설명하는 동안 세포의 유전자 코딩 순서 이내 indels의 창조도를 통해 실시됩니다 frameshift 및 높은 효율의 유전자 현장 2.의 후속 기능 녹아웃이 발생할 수 ZFN 인하 사이트에서 상동 - 감독 수리.

CompoZr 정의 ZFN 서비스 ZFN 기술 과학 지역 사회를위한 타겟 유전자 편집으로, 체계적인 종합적이고 및 잘 특성화 접근 방식을 나타냅니다. 시그마 과학자) 1 수사관과 긴밀히 perfo 작동프로젝트의 목표, 2에 따라 관련 유전자의 구조, 생물학, 및 모델 시스템의 분석)를 포함하여 RM 실사 분석 후 설계, 구축하고, 기능적으로 관련에서 활동 ZFNs을 검증) 소리 타겟팅 전략, 3을 개발하기 위해이 지식을 적용 세포주. 조사는 긍정적인 제어 게놈의 DNA와 primers를 받게하고, 플라스미드 DNA를 모두와 인 - 체외 베꼈는데 mRNA 형식으로 제공된 ZFN 시약을 준비 - 사용하기. 이 시약은 다음 탐정의 세포주 또는 선택한 셀 타입에 과도 표현을 위해 제공됩니다. 샘플 그때 PCR 증폭, 효소 다이제스트 및 전기 영동을 포함한 표준 분자 생물학 기법에 의한 관심의 현장에서 유전자 편집 테스트됩니다. 유전자 편집을위한 긍정적인 신호가 초기 인구가 감지되면 세포 복제 단일 셀 및 돌연변이 클론 / 대립 유전자의 식별을 위해 genotyped 있습니다.

Protocol

1. 사용자 정의 ZFN 디자인 프로세스

  1. ZFN 설계 과정을 신속히 진행하기 위해 탐정을 제공한다 :
    • 이러한 유전자 이름, 종 및 유전자 주석 / 식별 번호로 대상 유전자에 관한 정보.
    • 실험 명확하게 명시 이상 - 모든 목적 (예 : 마네 또는 쫓고)
    • 비정형 유전자 구조, 유전자 현장에 연루 특별 생물학, 또는 다른 게놈의 모든 동종 지역을 포함한 유전자 표적의 특정 요소.
    • 아연 손가락 DNA 시퀀스의 특정 범위를 대상으로 nucleases.
  2. 시그마 생물 정보학 팀은 초기 아연 손가락 타겟 사이트를 개발하기 위해 silico ZFN 설계에서 수행하고있다.
  3. 초기 ZFN 대상 사이트는 ZFN 과학 기술 컨설턴트로 제공됩니다. 더 기술적으로 복잡한 프로젝트의 경우이 시그마 과학자는 프로젝트 전략을 수립하기 위해 수사관과 함께 작동합니다.
  4. 생물 정보학 검토를 위해 탐정으로 가기 ZFN 대상 사이트를 제공합니다. 잠재적인 ZFN 대상 사이트의 승인되면이 정보는 ZFN 제조 과정을 시작하려면 ZFN 생산 팀에 제공됩니다.

2. 사용자 정의 ZFN 생산

  1. 아연 손가락 모듈의 시그마 아카이브는 승인된 ZFN 디자인을 조립하는 데 사용됩니다.
  2. 각 ZFN 디자인은 조립 순서는 높은 처리량 복제 플랫폼에 확인됩니다.
  3. 모든 ZFN 디자인 생산은 모든 ZFN을 완료하면이 유효성 검사로 전송됩니다.

3. 사용자 정의 ZFNs의 유효성 검사

  1. 의 ZFN 프로젝트인간, 마우스, 쥐 또는 CHO 수종은 각 종족에 대한 잘 특징인 세포 라인에서 검증되고, 효모 기반의 분석은 다른 유기체 또는 세포 유형에 사용됩니다.
  2. ZFN 구조는 nucleofection하여 적절한 세포주에 전달되고 ZFNs가 표현됩니다.
  3. DNA가 ZFN transfected 세포 수영장에서 수확과 관심의 영역은 PCR 증폭입니다.
  4. Cel-1 검정 그러면 PCR 제품에 실시됩니다. 젤 전기 영동은 확인 ZFN 활동에 Cel-1 검정에서 실행됩니다.
  5. Cel-1 분석으로 확인 등의 높은 활동 ZFN 설계 그런 다음 고객에게 제공됩니다. ZFNs는 긍정적인 컨트롤로 Cel-1 분석 및 게놈 DNA에 대한 PCR의 primers와 함께 mRNA와 플라스미드 DNA에 전달됩니다.

4. Nucleofection에서 유효성을 검사할 ZFNs의 납품

  1. 2x10 5 셀 / ML nucleofection 전날의 밀도의 씨앗 세포를.
  2. nucleofection의 날,셀 라인 Nucleofector 키트 V를 꺼내 실온으로 따뜻하게하자.
  3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 Nucleofection 솔루션 V로 보충을 추가합니다.
  4. 세포를 세어보세요. 세포 밀도는 2.5-5x10 5 셀 / ML 사이 여야합니다.
  5. 이전 nucleofection에 최소한 20 분 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 각 잘하고 미리 따뜻한 관련 매체의 2ml와 6 잘 접시를 채우십시오.
  6. 5 분 200xg에 transfection 회 2x10 6 셀 (8x10과 총)을 원심 분리기.
  7. 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 20 ML로 두 번 세포를 씻으십시오.
  8. 실험 튜브를 준비 : (정의 ZFN 기술 게시판에서 테이블을 참조)
  9. 인큐베이터에서 단계 (6.5)에서 미디어를 포함한 6 잘 플레이트를 제거합니다.
  10. Nucleofection 솔루션 400 μl (100 μl / 반응)에 세포를 Resuspend V.
  11. 한 번에 한 반응은, 각각의 DNA 또는 mRNA 함유 튜브에 세포를 100 μl를 추가합니다. Transf해당 프로그램 Nucleofector에 2mm electroporation cuvette 및 nucleofect에 요기 혼합물.
  12. 즉시 각 시료의 nucleofection 후, cuvette에 단계에서 6 잘 플레이트 (6.9)에서 prewarmed 매체 ~ 500 μl를 추가할 전송 피펫을 사용합니다. 다음 6 잘 판에 남아있는 prewarmed 매체로 cuvette의 세포는 신중을 전송.
  13. 모든 반응을 종료하고 37 ° C.에 CO 2 배양기로 6 잘 플레이트를 반환

5. ZFNs의 납품 후 게놈 DNA를 수확

  1. 6 - 잘 판 - 풀링된 세포를 모두 수확하지 않습니다. 그것은 당신이 Cel-1 소화 제품이 있는지 확인 후 단세포 희석 클론의 세포를 위해서는 문화를 유지하는 것이 중요합니다. 한 ~ 3 일 nucleofection 후 GenElute 포유류의 게놈의 DNA Miniprep 키트를 사용하여 염색체 DNA를 준비하는 세포를 수집합니다.

6. Cel-1 검정

  • PCR은 제공된 primers를 사용하여 ZFN transfected 샘플 키트에 제공된 긍정적인 제어 게놈의 DNA에서 게놈 DNA를 증폭. (사용자 정의 ZFN 기술 게시판의 테이블 참조) : PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 설정되었습니다.
  • PCR의 homoduplexes에서 heteroduplexes를 생성하기 위해서는 각 ZFN 취급 샘플 플러스 컨트롤에서 PCR 반응의 10 μl를 타고 thermocycler에서 다음 프로그램을 사용 :
    95 ° C 10 분
    95 ° C 85 ° C, -2 ° C / 초
    85 ° C 25 ° C, -0.1 ° C / 초
    4 ° C, 무기한으로
  • 42에서 각각의 반응과 부화 ° C ~ 20~40분위한에 향상제 1 μl와 Nuclease S 1 μl를 (Transgenomic 카탈로그 번호 706025에서) 추가합니다.
  • 이러한 DirectLoad WideRange의 DNA 사다리 (카탈로그 번호 D7058)와 같은 적절한 마커 (정의 ZFN 기술 게시판에 결과를 볼 수)에 10 % PAGE-TBE 겔에 dig​​estions를 실행합니다.
  • 에CE 긍정적인 신호가 cel-I 분석하여 ZFN - 처리 인구에서 발견되었습니다, clonal 분리 및 특성을 참조하십시오.
  • 7. Clonal 분리 및 특성화

    1. FACS 및 희석 복제를 포함하여 표준 방법에 의한 단일 세포 클론이 ZFN - 대우 샘플.
    2. 클론들이 줄지어 늘어 놓다 소재로 나머지를 다시 냉동, 게놈 DNA의 수확을 위해 세포의 일부 비율을 분할 후, 충분히 확장하도록 허용합니다.
    3. Cel-I primers를 사용하여 클론으로부터 게놈 DNA를 증폭하고 Cel-I 분석 (에서 마약을 WT DNA를 가진 사람과없는)의 amplicon을 분석하거나, 또는 genotyping에 직접 진행하는이 amplicon을 사용합니다.
    4. 유전자형 후보 클론 선호하는 방법으로 편집한 대립 유전자가있는 것으로 밝혀졌습니다.

    8. 대표 결과

    전체 CompoZr ZFN 워크플로우의 예제는 그림 2에 표시됩니다. ZFNs이 전달됩니다그들은 이중 좌초된 휴식 (DSB)를 만들어 적절한 DNA 시퀀스를 바인딩하고 분열 세포 있습니다. 자연 복구 프로세스가 아닌 동종 (NHEJ) 수리에게 DSB 입사 종료. 삭제, 삽입 또는 세포핵의 치환에서 일부 인스턴스 탈선 NHEJ 결과. 변성 / PCR 반응의 어닐링 단계 이후 야생의 종류와 수정된 amplicons 사이 heteroduplex 형성에 수확 게놈 DNA 검사 결과의 PCR 증폭. 어떤 heteroduplex 분자의 절단에 Cel-1 효소 결과의 추가. Cel-1 결과는 ZFN 절단을 확인하기 위해 페이지 분석에 의해 해결된다. 그림 3은 Cel-1 분석 및 예상되는 결과의 도식을 제공합니다.

    대표 Cel-1 결과는 그림 4와 5에 포함된 그림 4는 K562 세포에서 ZFNs 매우 적극적인 쌍 (21 %)의 결과가 포함되어 있습니다;. 그림 5에서 ZFNs의 덜 적극적인 쌍 (2.4 %)의 결과를 포함을K562 세포. ZFN 활동이 부모 PCR 조각 밑에 두 PCR 파편의 존재에 의해 두 수치로 확인된다.

    그림 1
    1 그림. 바운드 아연 손가락 nucleases의 표현. ZFNs는 FokI 제한 endonuclease의 절단 도메인 융합의 DNA 결합 도메인 아연 손가락으로 구성된 단백질을 꾀하고있다. heterodimer로 바인딩되면 ZFNs는 사용자가 특정의 DNA 시퀀스에서 더블 좌초된 휴식을 만듭니다.

    그림 2
    그림 2. 사용자 정의 ZFN 서비스 워크플로의 개략도. CompoZr의 ZFNs를 사용하여 유전자 변형 세포 라인을 생성하는 작업 흐름의 그래픽 표현.

    그림 3
    그림 3. Cel-1 분석 및 결과의 개략도.) ZFN 플라스미드 O R이 mRNA는 세포에 전달됩니다. B) ZFNs의 바인딩을 표현하고 세포의 일부에서 더블 좌초된 휴식 (DSB)를 만드는 그들의 목표 시퀀스를 했네요. C) 이외의 동종에 의해 일부 DSBs의 탈선 수리 염기 삽입 또는 삭제의 결과에 합류 종료. D) 게놈의 DNA가 세포 transfected 풀에서 수확과 관심의 현장에서 증폭된다. EF) PCR 제품은 변성이며 야생 유형 및 수정할 amplicons 사이 heteroduplex 형성을 만들고 다시 annealed. 사) heteroduplex 분자의 절단에 Cel-1 불일치 endonuclease 분석 결과. H) Cel-1 효소는 소화가 PAGE에 의해 해결된다. ImageJ 소프트웨어에 의해 결정 비경 밴드를 절단 제품의 관찰된 비율은 분수 인하와 ZFNs의 효율을 나타냅니다.

    그림 4
    4 그림. 21% 활성 ZFNs에서 Cel-1 결과 ImageJ 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. :_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

    그림 5
    그림 5. 2.4 % 활성 ZFNs에서 Cel-1 결과 ImageJ 소프트웨어에서보실 수 있습니다. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .

    Discussion

    일단 ZFN으로 수정한 세포들은 영구가와 DNA를 변형 물려 전할 수있는 격리됩니다. 연구를 원하는 유전 수정을 안정적으로 수정된 세포 라인이나 번식 동물을 생성하는 능력이 발생합니다. CompoZr 맞춤 ZFNs가 게놈이 세포 유형의 다양한 편집을위한 강력한 방법을 제공합니다. ZFNs의 편집 성공적인 게놈의 간행물을 작성하는 기능을 포함하지만, 인간의 세포 라인, 마우스, 쥐, zebrafish, 개구리, 돼지의 및 CHO 연구 모델에 국한되지 않습니다. 3,4,5,6,7,8,9 ZFNs가 제대로 셀로 전송되면 특정 세포 유형에서 원하는 대상 사이트에서 이중 좌초된 휴식이 보장됩니다. 그것은 세포 내에서 하나 이상의 유전자 조작을하기 위해 감방으로 연속 아연 손가락 수정을 수행할 수도 있습니다. 10 특정 대상 순서를 선택하고 해당 특정 현장이 여러 개를 만들 수있는 능력에 대한 주요 원인이 수정할 수있는 능력 modifi양이온.

    분석의 CompoZr 정의 ZFN 인증서 따라서 키트의 모든 구성 요소가 철저하게 고객의 성공을위한 검증되었다는 확보 키트에 제공된 매우 시약으로 생성됩니다. 처음부터 끝까지 흐름의 중요한 단계는 아래에 제공됩니다 :

    세포 클로닝

    주어진 세포주를 분리하고 확장하는 능력은 어떤 ZFN 실험을 시작하기 전에 테스트해야합니다. 단일 세포 분리 clonally 파생 인구가 가능하도록 확장되어야합니다. 일부 세포 라인이 문제에 고집 불통이며, 그러한 시설이 미디어에서 편집한 클론을위한 농축이나 문화와 같은 트릭은 이러한 도전을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.

    배달 효율

    전송 효율의 최적화 ZFNs 배달하기 전에해야합니다. 많은 방법은 지질 기반 transfection, electroporation, 그리고 nucleofecti 포함하여 사용할 수 있습니다에. 이상적인 전달 방법은 배달 효율성과 세포 생존의 가장 최적의 조화를 affords 하나 구성되어 있습니다. 이러한 효율성을 Quantitating 것은 육안 검사 또는 FACS 24-48 이후의 전달에 의한 GFP 컨트롤이 플라스미드와 quantitating 제공함으로써 추정 수 있습니다.

    Cel-I 분석

    그것은 Cel-I 분석은 PCR, 소화하고, 전기 영동 매개 변수 ZFN 실험의 해석을 방해하지 않도록 적절한 컨트롤로 병렬로 수행되는 것이 필수적입니다. 각 키트는 분석 증명서에 Cel-I 이미지를 만드는 데 사용되는 컨트롤 게놈 DNA를 포함하고 있습니다. Cel-I 분석 다음에 제공 primers와 제어 DNA의 증폭은 사용자가 분석 증명서 (CofA) 이미지에서 제공 그걸로 결과를 비교할 수 있도록하고, 실험의 측면에서 잠재적인 비효율을 분리할 것이다. 이러한 모의하거나, GFP 등 적절한 제외어 제어는 세포를 치료샘플도 아닌 특정 절단 제품의 해설을 허용하기 위해 포함되어야합니다.

    단일 세포 클론의 정량 / 정성 분석

    ZFN 처리와 단일 세포 복제 후 세포의 인구는 방법을 번호별로 관심이 현장에서 편집 상영됩니다. Cel-I 분석은 더욱 genotyping을위한 후보 클론을 식별하기위한 목적으로 클론으로부터 게놈 DNA를 실시 수 있습니다. 수행하기 전에 그것은 1:1의 비율로 샘플 amplicons에 스파이크 WT PCR의 amplicon에 중요 Cel - 전 homozygous 돌연변이 클론은 균일한 분자를 포함하므로 소화, 따라서 부정적인 Cel - 전 분석 결과를 전달. 이 후보 클론을 분석해위한 다른 방법은 직접 ZFN 대상 사이트에 한쪽 PCR 프라이머의 방문을 설계하는 것입니다. 제어 primers 중 하나와 함께 사용, 부정적인 분석 결과는 WT 시퀀스의 손실을 나타냅니다. 적어도 하나의 WT allele를 포함하는 heterozygous 클론이 Y됩니다ield PCR 신호지만,이 SYBR qPCR의 맥락에서 PCR을 수행하여 완벽하게 WT 클론에서 인종 차별을 수 있습니다.

    후보 클론은 위의 방법으로 확인되었습니다되면, 그들은 표준 pyrosequencing 깊은 시퀀싱 또는 기타 시퀀싱 방법으로 genotyped 수 있습니다. 모든 시퀀싱 방법은 clonal 게놈의 DNA에서 생성된 amplicon이 생성되어야합니다. 전통 pyrosequencing의 대립 유전자의 경우는 TA - 복제 PCR 제품으로 인종 차별, 그리고 개별 식민지를 시퀀싱 수 있습니다. 이러한 깊은이 단계를 순서와 같은 방식의 경우 필요하지 않습니다.

    상동 감독 수리 (HDR)

    이 프로토콜은 NHEJ 통해 ZFN 매개 유전자 녹아웃을위한 방법을 제공합니다. transgenes의 통합도 측면은 ZFN 인하 사이트 11.이 시나리오에서는이 ZFN 두 번 좌초된 휴식은 HDR 대신 NHEJ에 의해 수리되어 만든 상동의 팔을 가진 플라스미드 기증자의 도입에 의해 실시됩니다. HDR 내가 감독transgenes의 ntegration이 프로토콜에 걸쳐 제공되는 절차와 비슷한 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다.

    문제 해결

    ZFNs의 납품

    ZFN 전달 및 표현 배달은 GFP 또는 기타 시각화 및 / 또는 quantitation를위한 플라스미드 등.의 전달에 의해 제어할 수 있습니다 관심 세포 유형 모터 비호환으로 인해 낮은 표현은 m​​RNA 형식 ZFNs의 전달에 의해 극복할 수있다. 또한 차가운 충격 메소드는 더 이상 세포의 ZFNs의 효능을 높이기 위해 활용됩니다. 12 mRNA를 사용하는 경우 그것이 세포가 모든 혈청 파생 Rnases가 제거되었을 수 있도록 인도하기 전에 세차하는 필수적입니다. 그것은 얼음의 mRNA를 해동하고, 열화에 대한 가능성을 최소화하기 위해 매우 마지막 순간에 세포에 그것을 추가하는 것도 신중한입니다.

    Cel-I 분석

    Cel-I assa의 기초y는 관심있는 현장의 구체적이고 충분한 증폭이다. 불특정 증폭 제품이 관찰하는 경우에는 이러한 템플릿 금액의 최적화, 프라이머 농도, 그리고 사이클링 매개 변수로 특이성을 높이기 위해 표준 PCR 문제 해결 절차를 사용하십시오. 후자의 방법은 적절한 해상도와 감도를 제공하지 않으므로 표준 아가로 오스 전기 영동 반대로 페이지 분석을 수행합니다. 더 소화 제품이나 과도한 번짐가 관찰되지 않을 경우 Cel-I 다이제스트 조건도 최적화할 수 있습니다. Cel-1 nuclease 및 / 또는 소화 시간의 길이 금액의 적정 이러한 측면을 개선하기 위해 titrated 수 있습니다.

    Disclosures

    연구원 표준 연구 라이센스 계약하에 공동으로 ZFN 수정된 세포 또는 동물을 제공할 수 있습니다. 이 상황에서는 시그마는 물질 전달 계약은 시그마, ZFN 고객과 공동 작업자 사이에 위치에 넣어되어 있는지 묻습니다. : 연구 라이센스에서 볼 수 있습니다 http://www.sigma.com/zfn .

    ZFN 수정된 세포 시그마를 사용하여 상업용 응용 프로그램에 대한 가능성이있다면 상업용 라이선스가 제자리에 넣어되어 있는지 묻습니다.

    이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스가 시그마 주식 회사가 후원합니다

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Nuclease S (Cel-1 Enzyme) Transgenomic 706025
    Expand High Fidelity PCR System Roche Group 03 300 242 001
    Cell Line Nucleofector Kit V Lonza Inc. VCA-1003
    GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit Sigma-Aldrich NA0400

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    References

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    Hansen, K., Coussens, M. J., Sago, J., Subramanian, S., Gjoka, M., Briner, D. Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs). J. Vis. Exp. (64), e3304, doi:10.3791/3304 (2012).More

    Hansen, K., Coussens, M. J., Sago, J., Subramanian, S., Gjoka, M., Briner, D. Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs). J. Vis. Exp. (64), e3304, doi:10.3791/3304 (2012).

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