Den CompoZr anpassad Zink-finger nukleas (ZFN) service möjliggör exakt genomet redigering i någon organism eller cellinje som helst ställe som definieras av användaren. Den här artikeln beskriver processen för konstruktion, tillverkning, validering och genomförande av CompoZr Custom ZFN Service.
Genomet redigering är en kraftfull teknik som kan användas för att belysa genfunktion och den genetiska grunden för sjukdomen. Traditionell gen redigera metoder såsom kemisk-baserade mutagenes eller slumpvis integrering av DNA-sekvenser ge urskillningslösa genetiska förändringar i en övergripande ineffektivt sätt och kräver införande av oönskade syntetiska sekvenser eller användning av avvikande odlingsbetingelser, potentiellt förvirrande biologiska studier. Däremot kan övergående ZFN uttryck i en cell underlätta exakt, ärftliga genen redigering på ett mycket effektivt sätt utan behov för administration av kemikalier eller integrering av syntetiska transgener.
Zinkfinger nukleaser (ZFNs) är enzymer som binder och skars distinkta sekvenser av dubbelsträngat DNA (dsDNA). En funktionell CompoZr ZFN består av två individuella monomera proteiner som binder en DNA "halv-site" på ca 15-18 nukleotider (se figur 1). När två ZFN monomers "hem" till sina intilliggande målställen de DNA-klyvnings domäner dimerisera och skapar en dubbel-sträng paus (DSB) i DNA. 1 Införande av ZFN-medierade DSB i genomet lägger en grund för högeffektiv genomet redigering. Ofullkomlig reparation av DSB i en cell via den icke-homologa ände-sammanfogning (NHEJ) DNA-reparationsvägen kan resultera i små insättningar och deletioner (indels). Skapande av indels inom genen kodande sekvensen av en cell kan resultera i ramskifte och efterföljande funktionella knockout av en gen lokus med hög effektivitet. 2 Även om detta protokoll beskriver användningen av ZFNs att skapa en gen-knockout, integrering av transgener kan även genomföras via homologi-riktat reparation vid ZFN snittet webbplatsen.
Den CompoZr Custom ZFN service är en systematisk, omfattande och väl karakteriserade inställning till riktade gen redigering för det vetenskapliga samfundet med ZFN teknik. Sigma forskarna ett nära samarbete med utredare att 1) perforeradrm due diligence analyser inklusive analys av relevant genstruktur, biologi och modellsystem i enlighet med projektmålen, 2) tillämpa denna kunskap för att utveckla en sund inriktning strategi 3) sedan utforma, bygga och funktionellt validera ZFNs för aktivitet i en relevant cellinje. Utredaren får positiva DNA-kontroll genomiska och primers och redo att använda ZFN reagenser som levereras i både plasmid-DNA och in-vitro transkriberat mRNA-format. Dessa reagens kan sedan levereras för transient expression i utredarens cellinje eller celltyp som väljs. Proverna testas sedan för gen redigering vid platsen för intresse genom vanliga molekylärbiologiska tekniker, inklusive PCR-amplifiering, enzymatiska digestiv, och elektrofores. Efter positiv signal för genen redigering detekteras i den initiala populationen, celler är encelliga klonats och genotypas för identifiering av mutanta kloner / alleler.
Once ZFN modifierade celler isolerade de har permanenta och ärftliga DNA ändringar. Detta resulterar i förmågan att generera stabilt modifierade cellinjer eller djur föder upp med önskade genetiska modifieringar att bedriva forskning. CompoZr anpassade ZFNs tillhandahålla en robust metod för genomet redigering i en mängd olika celltyper. Publicering av framgångsrika genomet redigering med ZFNs inkluderar men är inte begränsat till humana cellinjer, mus, råtta, zebrafisk, groda, gris och CHO modellerna forskning. 3,4,5,6,7,8,9 Förmågan att skapa en dubbelsträngad paus vid det önskade målstället i den angivna celltypen säkerställes när ZFNs korrekt levereras in i en cell. Det är också möjligt att utföra sekventiella ändringar zink finger till en cell för att få mer än en genetisk modifiering i en cell. 10 Möjligheten att välja en specifik sekvens och bara ändra just den platsen är en primär orsak till förmågan att skapa flera modifikatjoner.
Den CompoZr Custom ZFN intyg analys genereras med de allra reagenser som finns i satsen vilket garanterar att alla komponenter i satsen grundligt har validerats för kunden framgång. Kritiska steg i arbetsflödet från början till slut presenteras nedan:
Cellkloning
Förmågan att isolera och expandera en given cellinje testas innan några ZFN experiment. Enstaka celler skall isoleras och expanderas för att säkerställa att en klonalt-härledd populationen är möjlig. Vissa cellinjer är motsträviga i denna fråga, och tricks som berikande för redigerade kloner eller kultur med konditionerade medier kan bidra till att övervinna dessa utmaningar.
Avgivningseffektivitet
Optimering av leverans effektivitet är ett måste innan leverans av ZFNs. Många metoder kan användas, inklusive lipidbaserad transfektion, elektroporering, och nucleofectividare. Den ideala leveransmetod består av en som ger den mest optimala blandningen av leverans effektivitet och cellöverlevnad. Kvantifiering dessa effektivitetsvinster kan uppskattas genom att leverera en GFP kontroll plasmid och kvantifiering genom visuell inspektion eller FACS 24-48 timmar efter leverans.
Cel-I-analysen
Det är viktigt att Cel-I analysen utförs parallellt med lämpliga kontroller för att säkerställa att PCR, matsmältning, och elektrofores parametrar som inte kommer att störa tolkningen av ZFN experiment. Varje kit innehåller kontroll DNA som används för att skapa Cel-I bild i intyget om analysen. Förstärkning från kontrollen DNA med de medföljande primers följt av Cel-I analysen gör det möjligt för användaren att jämföra resultaten med uppgifterna i intyget om Analysis (CofA) bild, och isolera eventuella ineffektivitet i denna aspekt av ett experiment. En lämplig negativ kontroll t.ex. en falsk, eller GFP behandlade cellenProvet bör också inkluderas för att medge belysning av eventuella icke-specifika spjälkningsprodukter.
Kvalitativ / Kvantitativ analys av enkel-cellkloner
Efter ZFN behandling och enskild cell kloning kan populationer av celler screenas för redigering på stället av intresse genom ett antal metoder. Cel-I-analysen kan utföras på genomiskt DNA från kloner för att identifiera kandidat-kloner för ytterligare genotypning. Det är viktigt att spetsen WT PCR-amplikon i provet amplikonema vid ett 1:1-förhållande innan du utför Cel-I smälta som homozygot mutant kloner kommer att innehålla homogena molekyler och därmed förmedla en negativ Cel-I analysresultatet. En alternativ metod för screening av dessa kandidatkloner är att utforma en PCR-primer landning direkt på ZFN målstället. Användas tillsammans med en av kontrollgrupperna primrar, indikerar en negativ analys, följd förlust av WT-sekvensen. En heterozygot klon som innehåller minst en WT-allelen kommer att yield PCR-signal, men kan vara skilda från helt WT kloner genom att utföra PCR i samband med SYBR qPCR.
När kandidatkloner har identifierats av ovanstående metoder kan de genotypas av standard Pyrosequencing, djup sekvensering, eller andra metoder sekvensering. För alla sekvenseringsmetoder, bör en amplikon som skapats från den klonala genomiskt DNA genereras. För traditionella Pyrosequencings alleler kan vara åtskilda av TA-kloning av PCR-produkten och sekvensering av individuella kolonier. För metoder, t ex djup-sekvensering detta steg är inte nödvändigt.
Homologi Riktad Repair (HDR)
Detta protokoll ger metoden för ZFN medierad gen knockout via NHEJ. Integration av transgener kan också genomföras genom införande av en donator plasmid med homologi armar som flankerar en ZFN snitt webbplats. 11 I detta scenario skapade ZFN dubbelsträngade paus repareras av HDR i stället för NHEJ. HDRn riktad iIntegrationen av transgener kan bekräftas med liknande metoder med de förfaranden som hela detta protokoll.
Felsökning
Leverans av ZFNs
ZFN leverans och uttryck-avgivning kan kontrolleras genom att tillhandahålla en GFP eller annan sådan plasmid för visualisering och / eller kvantifiering. Lågt uttryck på grund av promotorn oförenlighet med cellen typ av intresse kan övervinnas genom leverans av ZFNs i mRNA-format. Dessutom kan köldchock metoden användas för att ytterligare öka effekten av ZFNs i celler. 12 Om mRNA används är det viktigt att celler tvättas innan leverans för att säkerställa alla serumhärlett RNaser har tagits bort. Det är också klokt att tina mRNA på is, och lägg till den till cellerna vid den allra sista stund för att minimera alla chanser för nedbrytning.
Cel-I-analysen
Grunden för Cel-I assay är specifik och gott förstärkning av orten av intresse. Om icke-specifika PCR-produkterna iakttas använda vanliga PCR felsökning för att öka specificiteten som optimering av mall beloppet, primer koncentration, och cykling parametrar. Gör PAGE-analys i motsats till standard agaroselektrofores som senare metoden inte ger tillräcklig upplösning och känslighet. Cel-I smälta tillstånd kan också optimeras om ingen ned produkten eller smet observeras. Titrering av mängden Cel-1-nukleas och / eller längden av koktiden kan titreras för att förbättra dessa aspekter.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |