LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

Summary

Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

Abstract

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo intrínseco celular de la regulación de la expresión génica. Aprovechar el poder innato de este sistema nos permite niveles de caída expresión de genes en la pérdida de los estudios de la función del gen.

Hay dos métodos principales para la realización de RNAi. La primera es el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNAs) que son sintetizados químicamente, y la segunda utiliza a corto horquilla RNAs (shRNAs) codificados en plásmidos ^1. Estos últimos pueden ser transfectadas en células directa o empaquetados en la replicación lentiviral partículas incompetente. Las principales ventajas de la utilización de shRNAs lentiviral es la facilidad de introducción en una amplia variedad de tipos de células, su capacidad de integrar de manera estable en el genoma de caída a largo plazo y la selección de genes, y su eficacia en la conducción de alto rendimiento de las pantallas de la pérdida de función. Para facilitar esto hemos creado la biblioteca del shRNA LentiPlex agrupados.

El SIGBiblioteca SION LentiPlex Humanos del shRNA agrupado una piscina lentiviral genoma producido utilizando un proceso patentado. La biblioteca consta de más de 75.000 construcciones de la colección del shRNA TRC dirigidos 15,000 genes humanos ^2. Cada biblioteca es la prueba de la representación del shRNA antes del lanzamiento del producto para asegurar una cobertura sólida biblioteca. La biblioteca se presenta en un formato listo para usar lentiviral en títulos de al menos 5 x 10 ⁸ TU / ml a través de ensayo y p24 es pre-dividido en diez subpools de aproximadamente 8.000 ARNhc construye cada uno. Cebadores de amplificación y secuenciación también están disponibles para la identificación de objetivos intermedios.

Estudios previos han establecido una actividad antitumoral sinérgica de TRAIL en combinación con paclitaxel en las células A549, un carcinoma de pulmón humano línea celular ^{3, 4.} En este estudio se demuestra la aplicación de un LentiPlex agrupados biblioteca del shRNA para llevar a cabo rápidamente una pantalla de selección positiva de los genes involucrados en la citotoxicidad of A549 células cuando está expuesta a TRAIL y paclitaxel. Una barrera a menudo encontrados con alto rendimiento de las pantallas es el costo y la dificultad en la deconvolución, también los detalles de un enfoque policlonal rentable la utilización de la secuenciación tradicional.

Protocol

LentiPlex pantalla de configuración agrupados

Para identificar las secuencias del shRNA de interés, es fundamental para configurar la pantalla de tal manera que la mayoría de las células reciben una sola ARNhc construir. Mediante el uso de una baja MOI (multiplicidad de infección), la probabilidad de que varios integrantes de cada célula es mucho menor. Sin embargo, la eficiencia de la transducción, y por lo tanto, las MOI deseado, dependerá en gran medida del tipo de célula diana. Por lo tanto, es imperativo que la determinación del momento de inercia óptimo se lleva a cabo antes de iniciar la pantalla en un nuevo tipo de células.

1. Transducción de las células diana con la Misión LentiPlex agrupados ARNhc Biblioteca

1. El actual momento de inercia utilizados variarán para diferentes tipos de células. Si se desea se replica entonces el número de placas debe ser aumentado. Además, por lo general no va a ser ventajoso combinar los diferentes subpools. Mantener el subpools separado la ayuda en el proceso de deconvolución. Garantizar proper el etiquetado de cada plato de cultivo de tejidos con el número de subagrupación que se aplica durante la transducción. Una baja MOI se recomienda para reducir la probabilidad de que varios integrantes por celda.
2. Día 1 - Alimentar la semilla del número apropiado de 60 mm platos con cantidad suficiente de células para obtener ~ 70% de confluencia en el día siguiente (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado = 30 platos en total). Para nuestro estudio, placas de 60 mm fueron sembradas con 6 x 105 células A549 para lograr una confluencia del 70% antes de transducción. Esto asegura que las células están todavía en fase de crecimiento exponencial. Las tasas de crecimiento varían según el tipo celular y debe ser determinado antes de comenzar la pantalla.
3. Permiten a las células a adherirse mediante la incubación de la noche a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de CO2 al _5%.
4. (Opcional) Incluya otros dos de 60 mm para la transducción de platos con shRNAs control negativo. Etiqueta de los platos "Control A" para SHC001H y "Control B" para SHC002H.
5. Día 2 - º transducirlas células con las partículas e LentiPlex viral. En el día de la transducción, descongelar las partículas lentiviral en el hielo.
6. La transferencia de las partículas de descongelado a una campana de flujo laminar y mantener en hielo si no se utilizan inmediatamente.
7. Calcular cuánto de cada individuo viral sub-grupo que añadir a las células para obtener el MOI de 1 en todos los platos de cultivo celular.
   1. Ejemplo: 1 x 10 ⁶ células / plato, título viral = 5 x 10 ⁸ TU / ml, un deseado MOI de 1. i.) 1 x 10 ⁶ células / plato x (MOI de 1) = 1 x 10 ⁶ unidades de transducción (TU) necesarios ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) obtenidos de la C de A = 2 l de solución de reserva lentiviral se debe agregar al plato apropiado. Diluir la cantidad calculada del virus en 100-300 l de medio completo con el fin de asegurar una mejor distribución de los virus cuando se añade a la placa de cultivo celular.
8. Retire los medios de comunicación de las células pre-semilla. Añadir completa conta los medios de comunicaciónHexadimetrina nando una solución de bromuro de cada plato. La concentración final recomendada de bromuro Hexadimetrina en los medios de comunicación es de 8 mg / ml. Use menos bromuro de Hexadimetrina si usted encuentra que sea tóxico para las células de su objetivo.
9. Añadir partículas ARNhc lentiviral a los platos apropiados de acuerdo con el diseño predeterminado experimental. Remover con suavidad las placas para distribuir uniformemente el virus a través de las células.
10. Incubar 18-20 horas a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5% de CO _2.
11. (Opcional) Repita 3-8 en el momento de inercia con idéntica SHC001H (vector vacío del shRNA de control) en el plato de control A y SHC002H (revueltos siRNA control) en el plato de control B. Tratar estos platos de forma idéntica a los platos experimentales en todo el experimento.
12. Día 3 - Cambiar los medios de comunicación. Aspirar virus que contienen los medios de comunicación y añadir nuevos medios de comunicación completo (sin bromuro de Hexadimetrina). Se incuban las células a 37 ° C durante la noche.

2. El tratamiento de chapadocélulas con componentes terapéuticos y / o reactivos

1. Día 4 - Aspirar los medios de comunicación de los pozos y añadir medio fresco que contiene componente terapéutico en la concentración óptima. Al igual que con las condiciones de cultivo, los tratamientos varían y las concentraciones adecuadas y la duración debe ser determinado de antemano. En nuestro estudio, hemos utilizado 100 ng / ml de TRAIL y 1 M de paclitaxel. Las células fueron tratadas durante 48 horas.
2. Las células supervivientes deben ser re-sembradas en frascos T75 y se permite que se expanda hasta confluir casi el 100%.
3. (Opcional) Al final de la selección, inspección de control de un plato y plato de control del plato B. A y B del plato debe tener cada pocas colonias que por lo menos uno de los platos de la biblioteca común. Si hay un número inesperadamente alto de colonias en un plato, ya sea que el proceso de transducción ha afectado a una vía de relación con el fenotipo deseado o la presión selectiva no es lo suficientemente fuerte y volver a la optimización de la prueba pueden ser requeridos. Si B plato contiene demasiadas colonias, Entonces la expresión de shRNA y el compromiso de la vía de RNAi puede tener un efecto sobre el fenotipo de interés. Si este es el caso de repetir con SHC001H, para asegurarse de que el efecto no es específico de SHC002H.

3. Deconvolución de una población de células policlonales

1. Cosecha de la población heterogénea de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico. En nuestro estudio, las células fueron lavadas brevemente en PBS y trypsinized antes de ADN genómico se aisló utilizando el GenElute mamíferos Genómica Miniprep kit y el protocolo suministrado (Sigma-Aldrich, G1N70). Por otra parte, los kits de purificación genómica otros que están actualmente disponibles en el mercado puede ser utilizado para el aislamiento de ADN. Es importante seguir las recomendaciones del protocolo de la cantidad a partir de células cultivadas.
2. Amplificación por PCR de los objetivos. La plantilla del shRNA procedimiento de recuperación permite la amplificación de todo el conjunto de inserciones del shRNA de la población de células seleccionadas, o la recuperación de los individos plantillas del shRNA de las colonias que fueron recogidos de forma individual y ampliado. Después de la amplificación de las inserciones del shRNA de control y celdas seleccionadas de destino, los productos de PCR puede ser secuenciado.
3. Este paso de amplificación de PCR fue optimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Otros reactivos pueden ser utilizados para la amplificación, pero las condiciones de la bicicleta y / o concentración de magnesio puede ser necesario modificar para la amplificación de éxito. Amplificación de los primers en la concentración de 20 mM se incluyen con el kit LentiPlex.
4. Establecer la reacción de PCR como se describe en la Tabla 1. Agregue los componentes en el orden indicado. Las cantidades descritas son para una reacción de 50 mL. Para más reacciones, la escala de los componentes de mezcla principal por el número deseado de reacciones e incluyen 10% de exceso. La cantidad de ADN plantilla recomendada es de 50 a 100 ng.
5. Se recomienda encarecidamente que por una reacción de la plantilla se compone de los vectores MISIÓN ARNhc Humanos control positivo diluido el parámetro adecuadoIATE concentración. Amplificación de éxito con esta plantilla indica que los componentes y las condiciones de ensayo de PCR en bicicleta son las adecuadas. NOTA: Para evitar la contaminación remanente de las muestras experimentales y reactivos, se sugiere que el control positivo se diluye en un lugar separado del lugar donde las posteriores reacciones de PCR se establezcan.
6. Guarde el programa de PCR en la Tabla 2 en el termociclador.
7. Para cada muestra, se combinan tres reacciones de PCR con l 1 l de medio de contraste y la electroforesis junto con 5 L de DirectLoad ™ PCR escalera de 100 pb de baja, número de catálogo D3687 en un 1% en gel de agarosa para confirmar la presencia de un amplicón de 309 pb.
8. Subclonación de PCR amplificados: productos de PCR fueron TOPO clonado utilizando el kit de clonación TOPO-TA, siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen, K4575-01). El resultado es que un producto de PCR se encuentra en cada vector.
9. 250 colonias bacterianas individuales (cada uno con un individuo amplicón PCR) fueron aislados y crecern en dos culturas ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina. Plásmido de ADN fue extraído utilizando el kit Miniprep GenElute plásmido (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Purificado el plásmido de ADN fue digerido con EcoRI y electroforesis para confirmar la presencia de la inserción.
11. Muestras de ADN del plásmido fueron secuenciados y el inserto del shRNA identificarse utilizando la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex Buscar siempre con la biblioteca LentiPlex.

4. Objetivo la identificación y validación

1. La secuencia se inicia con ARNhc 5'-GAAACACCGG-3 '. Escriba por lo menos los próximos 10 pero menos de 21 nucleótidos en la secuencia de consulta en el cuadro Buscar en la secuencia de forma cerrada del shRNA base de datos de búsqueda de acceso.
2. Seleccionar las especies de la shRNA común. Opcionalmente, active la subagrupación de la que se encontró la secuencia.
3. Ahora haga clic en "Buscar éxitos potenciales" para realizar la búsqueda. Se deben indicar la correspondiente secuencia de TRC shRNA (s) que coinciden con the secuencia de datos. Más información sobre la secuencia de TRC shRNA (s) identificados y los objetivos gen correspondiente se pueden encontrar fácilmente en Sigma-Aldrich es su gen favorito: http://www.sigma.com/yfg
4. Identificaron los genes diana deberá ser validada por repetición de la prueba de detección original junto con el clon de la CVR y por lo menos dos shRNAs adicionales que se dirigen a un mismo gen con un siRNA 1 a 1 y el formato. Verdaderos hits mostrará el mismo fenotipo en la mayoría de los pozos.

5. Resultados representante

Un ejemplo de un flujo de trabajo LentiPlex pantalla agrupados se detalla en la Figura 1. Células transducidas que proliferaron en la presencia de TRAIL y paclitaxel se les permitió expandirse hasta frascos fueron confluentes. ADN genómico fue extraído y sometido a la amplificación por PCR y la clonación, como se ilustra en la Figura 1 A, antes de ser presentado para la identificación de la secuencia y del shRNA como se describe en Figure 1 C 250 clones fueron secuenciados, de estos 25 fueron representados por múltiples clones y los restantes 225 estaban representados por sólo una copia y no se persigue en este momento.

Como se muestra en la Figura 2, varios genes candidatos, incluida TBX3, PPP2CA y AKT2 estuvieron representados por múltiples clones. El factor de transcripción T-box, TBX3 apareció en un total de cuatro clones y se ha implicado en el tumor de migración a PHP ^5. Regulación a la baja PPP2CA se ha demostrado que mantener el crecimiento de las células LNCaP cultivadas en condiciones deficientes de andrógenos por el alivio de la privación de andrógenos inducidos por el ciclo celular detención y prevención de la apoptosis ^6. AKT2 es una serina RAC-beta / treonina proteína quinasa y oncogen putativo demostrado que desempeñan distintas funciones en el desarrollo del cáncer ^{7, 8.}

* La concentración final de Mg ^{2 +} en la solución de 3 mm;1,5 mM se aporta desde el Readymix Taq y 1,5 mm de la solución de cloruro de magnesio.
Tabla 1. Lentiplex Condiciones de reacción PCR

Tabla 2. Lentiplex programa de amplificación de PCR

Figura 1. (A) LentiPlex agrupados pantalla, (B) de flujo de trabajo deconvolución policlonales, y (c) la identificación de los objetivos del shRNA.

LentiPlex A. agrupados pantalla. En primer lugar, las células de la semilla, a continuación, añadir subpools shRNA, (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado, de 30 platos en total). A continuación, tratar con los componentes terapéuticos y / o reactivos (en nuestro caso, TRAIL y Paclitaxel, respectivamente). A continuación, sembrar de nuevo las células supervivientes en los frascos y dejar que se expanda. Cosecha heterogénea población de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico.

Deconvolución B. policlonales. Realizar PCR para amplificar el ADN que contiene el inserto shRNA. El producto de PCR es uniforme en tamaño, pero policlonales en secuencia desde la ADNg plantilla también policlonales. Producto de PCR se clonaron en el vector y luego se transforma en bacterias competentes.

C. Determinación de los objetivos del shRNA. Colonias individuales son aislados y el plásmido de ADN se extrae. Cada clon contiene el vector de clonación con un individuo fragmento de PCR. ADN plásmido se digiere para confirmar la presencia de la inserción y secuenciados. La inserción del shRNA se identifica con la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex búsqueda.

Figura 2. Identificadas puedenLos genes candidato. 25 genes candidatos se identificaron que había muchos golpes. 225 genes candidatos sólo tenía un golpe y no fueron perseguidos. Por favor, véase la Tabla 1 suplementaria un desglose de los clones individuales por gen candidato.

Que complementa el cuadro 1. Individuales TRC clones Biblioteca identificados a partir de la secuenciación de genes ID policlonales Visitas clones detectados.

Discussion

En este estudio, se presenta una pantalla de todo el genoma para identificar genes implicados en la citotoxicidad de las células A549 después del tratamiento con paclitaxel / TRAIL. El uso de un enfoque combinado en una pantalla de todo el genoma reduce el tiempo, el costo y la inversión en equipo que normalmente se asocian con las pantallas convencionales dispuestos. Fundamental para el éxito de la pantalla son experimentos de optimización realizado de antemano. Condiciones de transducción y MOI debe ser determinado empíricamente.

El método de selección debe permitir una selección sólida de células que presentan el fenotipo deseado (por ejemplo, la supervivencia, la expresión de proteínas de superficie, etc.) La optimización de estos parámetros se reducirá el número de falsos positivos detectados.

Aquí, ADNg fue cosechado de la población mayor parte de las celdas seleccionadas y luego TOPO clonado para identificar inserciones individuales shRNA. Una posible mejora para este experimento habría sido para seleccionar las células en vivo usando FACS para asegurarque sólo las células vivas son recogidos. Los objetivos fijados, será validado por la transducción con el objetivo específico de shRNAs en un ensayo de cribado. Verdaderos hits mostrará el fenotipo de la mayoría de los pozos.

La Biblioteca LentiPlex combinados es flexible en su aplicación. Es compatible con una amplia gama de aplicaciones posteriores y puede ser utilizado con las estrategias de selección positiva o negativa. Dependiendo de las condiciones de selección, deconvolución de los insertos del shRNA se lleva a cabo a través de PCR / clonación, microarrays, o secuenciación de próxima generación ^{9, 10.} Aunque la potencia y velocidad de estas técnicas para deconvolute pantallas de RNAi está bien establecida, una preocupación por microarrays y próxima generación de métodos de secuenciación es la disponibilidad de recursos bioinformáticos y los conocimientos necesarios para analizar e interpretar correctamente los resultados experimentales. Los costos asociados con estas técnicas puede muchas veces ser un obstáculo para la realización de las pantallas de todo el genoma. APCR / enfoque basado en la clonación, aunque no tan poderoso como los microarrays y la secuenciación de próxima generación es una alternativa costo efectiva y de menor.

Agilent ofrece ahora una gama personalizada basada en la biblioteca del shRNA TRC para ayudar aún más en las pantallas de LentiPlex. Estas opciones permiten a los investigadores a utilizar LentiPlex para estudiar una amplia gama de funciones celulares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268