LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d'Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

Summary

Ici, nous utilisons une bibliothèque LentiPlex humains mis en commun et des méthodes de séquençage d'traditionnelle identifier les gènes cibles de promouvoir la survie cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et de déconvoluer un écran LentiPlex et valider les résultats.

Abstract

L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme intrinsèque cellulaire pour la régulation de l'expression génique. Exploiter la puissance innée de ce système nous permet d'inactivation génique niveaux d'expression de la perte d'études de la fonction des gènes.

Il existe deux méthodes principales pour effectuer l'ARNi. La première est l'utilisation de petits ARN interférents (siRNA) qui sont synthétisés chimiquement, et la seconde utilise des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) encodé dans ^une plasmides. Ces derniers peuvent être transfectés dans des cellules directement ou emballés dans des particules réplication incompétents lentiviraux. Les principaux avantages de l'utilisation de shRNA lentiviraux est la facilité d'introduction dans une grande variété de types de cellules, de leur capacité à intégrer de façon stable dans le génome des gènes knockdown terme de temps et de sélection, et leur efficacité dans la conduite de haut débit de perte d'écrans de fonction. Pour faciliter cela, nous avons créé la librairie shRNA LentiPlex commun.

Le SIGLentiPlex SION homme shRNA Bibliothèque Pooled est une piscine à l'échelle du génome lentiviral produites en utilisant un procédé exclusif. La bibliothèque se compose de plus de 75.000 constructions de shRNA de la collection TRC ciblant 15 000 gènes humains + ^2. Chaque bibliothèque est testé pour la représentation des shRNA avant la sortie de produits pour assurer une couverture bibliothèque robuste. La bibliothèque est fournie dans un format prêt à utiliser lentiviraux à des titres d'au moins 5 x 10 ⁸ TU / ml par dosage de p24 et est pré-divisée en dix sous-pools d'environ 8000 shRNA construit chacun. Amorces d'amplification et de séquençage sont également fournis pour l'identification des cibles en aval.

Des études antérieures établi une activité antitumorale synergique de TRAIL lorsqu'il est combiné avec le paclitaxel dans les cellules A549, une ligne de poumon humain carcinome ^{3, 4.} Dans cette étude, nous démontrons l'application d'une bibliothèque LentiPlex shRNA regroupées pour procéder rapidement à des un écran de sélection positive pour les gènes impliqués dans la cytotoxicité of cellules A549 lorsqu'ils sont exposés à TRAIL et Paclitaxel. Un obstacle souvent rencontré avec des écrans à haut débit est le coût et la difficulté de déconvolution; nous avons aussi en détail une approche rentable polyclonaux utilisant le séquençage traditionnel.

Protocol

Configuration de l'écran LentiPlex Pooled

Pour identifier des séquences shRNA d'intérêt, il est essentiel de mettre en place l'écran de telle sorte que la majorité des cellules ne reçoivent qu'une seule shRNA construire. En utilisant une faible MOI (multiplicité d'infection), la probabilité d'intégrants multiples par cellule est grandement diminué. Cependant, l'efficacité de transduction, et donc MOI désiré, dépendent fortement du type de cellule cible. Par conséquent, il est impératif que la détermination de la MOI optimale est effectué avant de commencer l'écran dans un type cellulaire nouvelle.

1. Transduction des cellules cibles avec la mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothèque

1. La réelle MOI utilisée varie en fonction des différents types cellulaires. Si désiré, puis répétitions sont le nombre de plaques doit être augmenté en conséquence. De plus, généralement il ne sera pas avantageux de combiner les sous-pools différents. Garder le sous-pools distincts seront une aide dans le processus de déconvolution. Assurez-vous proper étiquetage de chaque plat culture tissulaire avec le nombre sous-pool qui est appliquée lors de la transduction. Un peu MOI est conseillé de réduire la probabilité d'intégrants multiples par cellule.
2. Jour 1 - Seed le nombre approprié de 60 mm de plats avec suffisamment de cellules pour obtenir environ 70% de confluence le jour suivant (10 piscines au total, chacun réalisés en triple = 30 plats au total). Pour notre étude, boîtes de 60 mm ont été ensemencées avec 6 x 105 cellules A549 pour atteindre un confluence de 70% avant de transduction. Cela garantit que les cellules sont encore en phase de croissance exponentielle. Les taux de croissance varient selon le type de cellules et doit être déterminé avant de commencer l'écran.
3. Permettent aux cellules d'adhérer par une nuit d'incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO _2.
4. (Facultatif) Inclure deux autres de 60 mm plats pour la transduction des shRNA contrôle négatif. Étiquette les plats "Contrôle A" pour SHC001H et "Control B» pour SHC002H.
5. Jour 2 - ème transduirecellules e avec les particules virales LentiPlex. Le jour de la transduction, le dégel des particules lentiviraux sur la glace.
6. Transfert des particules décongelés à une hotte à flux laminaire et de garder sur la glace si elle n'est pas utilisée immédiatement.
7. Calculez combien de chacun des sous-virale piscine d'ajouter aux cellules pour obtenir le MOI de 1 dans toutes les boîtes de culture cellulaire.
   1. Exemple: 1 x 10 ⁶ cellules / boîte; titre viral = 5 x 10 ⁸ TU / ml; une MOI de 1 désiré. i.) 1 x 10 ⁶ cellules / boîte x (MOI de 1) = 1 x 10 ⁶ unités de transduction (TU) nécessaires ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) obtenue à partir du C A = 2 pi de solution stock lentiviraux devrait être ajouté à l'antenne appropriée. Diluer le montant calculé du virus à raison de 100-300 ul de milieu complet afin d'assurer une meilleure répartition du virus lorsqu'il est ajouté à la boîte de culture cellulaire.
8. Retirez le support à partir des cellules pré-ensemencés. Ajouter complète des médias ContaMINIER solution de bromure hexadiméthrine à chaque plat. La concentration finale recommandée de bromure hexadiméthrine dans les médias est de 8 pg / ml. Utilisez moins de bromure de hexadiméthrine si vous trouvez qu'il soit toxique pour les cellules de votre cible.
9. Ajouter particules shRNA Lentiviral aux plats appropriés conformément à la conception prédéterminé expérimental. Mélanger délicatement les plaques pour répartir uniformément le virus à travers les cellules.
10. Incuber 18-20 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO _2.
11. (Facultatif) Répétez 3-8 à l'identique avec MOI SHC001H (vide vecteur de shRNA Control) dans un plat de contrôle A et SHC002H (brouillés shRNA contrôle) dans un plat de contrôle B. Traiter ces plats à l'identique aux plats expérimentaux durant l'expérience.
12. Jour 3 - Changer les médias. Aspirer contenant le virus des médias et ajouter Fresh Media complète (sans bromure hexadiméthrine). Incuber les cellules à 37 ° C pendant la nuit.

2. Traiter plaquéscellules avec composante thérapeutique / réactif

1. Jour 4 - Aspirer les médias à partir des puits et ajouter milieu frais contenant composante thérapeutique à la concentration optimale. Comme avec les conditions de culture, les traitements varient et les concentrations et les durées appropriées doivent être déterminées au préalable. Dans notre étude, nous avons utilisé 100 ng / mL de TRAIL et 1 uM de Paclitaxel. Les cellules ont été traitées pendant 48 heures.
2. Cellules survivantes devraient être ré-ensemencées dans des flacons T75 et a permis d'étendre jusqu'à près de 100% de confluence.
3. (Facultatif) A la fin de la sélection, inspecter contrôle vaisselle A et B. Contrôle vaisselle vaisselle A et B de chaque plat doit avoir moins de colonies que au moins un des plats les bibliothèques mises en commun. S'il ya un nombre étonnamment élevé de colonies dans un plat, que ce soit le processus de transduction a affecté une voie liée au phénotype désiré ou la pression sélective n'est pas suffisamment forte et ré-optimisation de l'essai peut être nécessaire. Si B plat contient trop de colonies, Alors l'expression de shRNA et l'engagement de la voie de l'ARNi peut avoir un effet sur le phénotype d'intérêt. Si c'est le cas avec SHC001H répéter, afin de s'assurer que l'effet n'est pas spécifique à SHC002H.

3. Déconvolution d'une population cellulaire polyclonale

1. Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d'isoler l'ADN génomique. Dans notre essai, les cellules ont été lavées brièvement dans du PBS et la trypsine avant d'ADN génomique a été isolé en utilisant la génomique des mammifères GenElute Miniprep kit et fourni protocole (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativement, d'autres kits de purification toute génomiques qui sont actuellement disponibles sur le marché peuvent être utilisés pour l'isolation d'ADN. Il est important de suivre les recommandations du protocole pour le montant de départ de cellules cultivées.
2. L'amplification par PCR de cibles. La procédure de récupération shRNA modèle permet l'amplification de l'ensemble du pool d'inserts shRNA de la population de cellules sélectionnées, ou pour la récupération des indideux modèles de shRNA de colonies ont été individuellement pris et élargi. Après amplification d'encarts shRNA du contrôle et de cellules cibles sélectionnées, les produits de PCR peut être séquencé.
3. Cette étape d'amplification PCR a été optimisé en utilisant Sigma Readymix, Catalogue n ° P2893. D'autres réactifs peuvent être utilisés pour l'amplification, mais les conditions du vélo et / ou la concentration de magnésium peut être nécessaire de modifier pour l'amplification réussie. Amorces d'amplification à la concentration 20 mM sont inclus avec le kit LentiPlex.
4. Mettre en place la réaction PCR comme décrit dans le tableau 1. Ajoutez les composants dans l'ordre indiqué. Les montants sont décrits pour une réaction de 50 ul. Pour plus de réactions, de l'échelle des composants master mix par le nombre souhaité de réactions et notamment surconsommation de 10%. Le montant de la matrice d'ADN recommandée est de 50-100 ng.
5. Il est fortement recommandé que pour une réaction du modèle se compose de la MISSION shRNA Vector Control humain positif dilué au approprIATE concentration. Amplification réussie avec ce modèle indique que les composants PCR et les conditions du vélo sont adéquates. REMARQUE: Pour éviter des contaminations croisées des échantillons expérimentaux et des réactifs, il est suggéré que le témoin positif peut être diluée dans un endroit séparé de l'endroit où ultérieures réactions de PCR sont mis en place.
6. Enregistrer le programme PCR énumérés dans le tableau 2 dans votre thermocycleur.
7. Pour chaque échantillon, mélanger réaction 3 uL PCR avec 1 ul de colorant et électrophorèse côtés 5 pi de DirectLoad ™ PCR de 100 bp Ladder bas, D3687 Numéro de catalogue sur un gel à 1% d'agarose pour confirmer la présence d'un amplicon 309 pb.
8. Sous-clonage des amplicons PCR: Les produits de PCR ont été clonés TOPO utilisant le kit de clonage TOPO-TA, après le protocole du fabricant (Invitrogen, K4575-01). Le résultat est que l'on produit de PCR est contenue dans chaque vecteur.
9. 250 colonies bactériennes individuelles (contenant chacun un individu amplicon de PCR) ont été isolés et grandirn dans 2 ml de cultures de LB avec 100 mg / ml d'ampicilline. L'ADN plasmidique a ensuite été extrait en utilisant la GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Purifié ADN plasmidique a été digéré par EcoRI et électrophorèse pour confirmer la présence de l'insert.
11. Les échantillons d'ADN plasmidique ont ensuite été séquencés et l'insert de shRNA identifiées en utilisant la séquence shRNA LentiPlex Recherche base de données fournie avec la bibliothèque LentiPlex.

4. Identification de la cible et la validation

1. La séquence shRNA initie avec 5'-GAAACACCGG-3 '. Saisissez au moins les 10 prochaines, mais moins de 21 nucléotides que la séquence requête dans le champ de recherche sur la séquence ci-jointe shRNA Recherche base de données Access.
2. Sélectionner les espèces du shRNA commun. En option, sélectionnez le sous-pool à partir duquel la séquence a été trouvée.
3. Maintenant, cliquez sur «Trouver tubes potentiels" pour effectuer la recherche. Cela devrait identifier les correspondants TRC shRNA de séquence (s) qui correspondent èmee séquençage des données. Plus d'informations sur la séquence shRNA TRC (s) identifié et les objectifs gène correspondant peut être facilement trouvé chez Sigma-Aldrich votre gène favoris: http://www.sigma.com/yfg
4. Gènes cibles identifiés devraient être validées en répétant le test de dépistage d'origine avec le clone original TRC et au moins deux shRNA supplémentaires qui ciblent le même gène en utilisant un shRNA 1-1 format bien. Frappe True afficher le même phénotype dans la majorité des puits.

5. Les résultats représentatifs

Un exemple d'un workflow d'écran LentiPlex groupée est détaillé dans la Figure 1. Cellules transduites qui ont proliféré dans la présence de TRAIL et Paclitaxel ont été autorisés à étendre jusqu'au flacons sont confluentes. L'ADN génomique a été récoltée et soumise à l'amplification par PCR et le clonage, comme illustré dans la figure 1 A, avant d'être soumis pour l'identification et le séquençage shRNA comme décrit dans Figure 1 C 250 clones ont été séquencés, de ces 25 étaient représentés par des clones multiples et les 225 restants ont été représentés par seulement 1 clone et n'ont pas été poursuivies à ce moment.

Comme le montre la figure 2, plusieurs gènes candidats dont TBX3, PPP2CA et AKT2 étaient représentés par des clones multiples. Le facteur de transcription T-box, TBX3 apparu dans un total de quatre clones et a été impliquée dans la migration tumorale ^5. Downregulation PPP2CA a été démontré pour maintenir la croissance des cellules LNCaP cultivées dans des conditions déficientes androgènes en soulageant le blocage androgénique induite par arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose prévention ^6. AKT2 est une sérine-bêta CAR / thréonine protéine kinase-oncogène et putatifs démontré à jouer plusieurs rôles dans le cancer de développement ^{7, 8.}

* Concentration finale de Mg ^{2 +} en solution va être de 3 mm;1,5 mm est versé du Readymix Taq et 1,5 mm de la solution de chlorure de magnésium.
Tableau 1. Conditions Lentiplex réaction PCR

Tableau 2. Lentiplex Programme d'amplification par PCR

Figure 1. (A) LentiPlex regroupés écran, (B) workflow déconvolution polyclonaux, et (C) l'identification des cibles shRNA.

LentiPlex A. regroupés écran. Abord, les cellules de semence, puis ajouter sous-pools shRNA, (10 piscines au total, chacune réalisée en trois exemplaires, pour les 30 plats au total). Ensuite, traiter avec composante thérapeutique / réactif (dans notre cas, TRAIL et Paclitaxel, respectivement). Puis, réensemencer les cellules survivantes dans des fioles et permettent de se développer. Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d'isoler l'ADN génomique.

B. déconvolution polyclonaux. Effectuer la PCR pour amplifier l'ADN contenant l'insert de shRNA. Le produit de PCR est de taille uniforme, mais polyclonaux en séquence depuis l'ADNg modèle a également été polyclonaux. Produit de PCR est cloné dans le vecteur et ensuite transformés dans des bactéries compétentes.

C. Identification de cibles shRNA. Colonies individuelles sont isolées et l'ADN plasmidique est extrait. Chaque clone contient le vecteur de clonage avec un fragment de PCR individuels. L'ADN plasmidique est digéré pour confirmer la présence de l'insert et séquencé. L'insert de shRNA est identifié en utilisant le shRNA LentiPlex Recherche de séquence en base.

Figure 2. Identifiés peuventLes gènes didate. 25 gènes candidats ont été identifiés qui avait de multiples coups. 225 gènes candidats avaient seulement 1 coup et n'ont pas été poursuivies. S'il vous plaît voir le tableau 1 pour une ventilation supplémentaire des clones individuels par gène candidat.

1 Tableau complémentaire. Individuels TRC clones identifiés à partir de la bibliothèque ID séquençage des gènes polyclonaux Clics clones détectés.

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un écran l'échelle du génome pour identifier les gènes impliqués dans la cytotoxicité des cellules A549 après le paclitaxel / TRAIL traitement. L'utilisation d'une approche groupée dans un écran à l'échelle du génome réduit le temps, de coût et d'investissement d'équipement normalement associées aux écrans conventionnels vêtu. Essentiel à la réussite de l'écran sont des expériences d'optimisation effectué au préalable. Conditions de transduction et MOI doit être déterminée empiriquement.

La méthode de sélection doit permettre une sélection robuste de cellules présentant le phénotype souhaité (par exemple, la survie, l'expression des protéines de surface, etc.) L'optimisation de ces paramètres permettra de réduire le nombre de faux positifs détectés.

Ici, ADNg a été récolté auprès de la population majeure partie des cellules sélectionnées, puis cloné à identifier TOPO inserts shRNA individuels. Une amélioration possible pour cette expérience aurait été de sélectionner pour les cellules vivantes en utilisant FACS pour assurerque seules les cellules vivantes sont collectées. Les cibles identifiées seront validés par transduction avec l'objectif spécifique des shRNA dans un test de dépistage. Frappe True afficher le phénotype dans la majorité des puits.

La Bibliothèque LentiPlex Pooled est souple dans son application. Il est compatible avec un large éventail d'applications en aval et peut être utilisé avec des stratégies de sélection positive ou négative. Selon les conditions de dépistage, déconvolution des inserts shRNA est accompli par PCR / clonage, puces à ADN, ou séquençage de nouvelle génération ^{9, 10.} Alors que la puissance et la vitesse de ces techniques pour déconvoluer écrans ARNi est bien établie, un souci de puces à ADN et la prochaine génération de méthodes de séquençage est la disponibilité des ressources bio-informatique et les connaissances nécessaires pour analyser et interpréter correctement les résultats expérimentaux. Les coûts associés à ces techniques peuvent souvent être un obstacle à la réalisation d'écrans échelle du génome entier. APCR / clonage approche basée, tout en n'étant pas aussi puissant que les microréseaux et de séquençage de nouvelle génération est une alternative rentable et inférieure.

Agilent propose maintenant un tableau personnalisé basé sur la librairie shRNA TRC d'une aide supplémentaire dans les écrans LentiPlex. Ces options permettent aux chercheurs d'utiliser LentiPlex pour étudier un large éventail de fonctions cellulaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268