Summary
여기 우리는 세포 생존을 촉진 유전자 표적을 식별하는 방법을 순서 인간 LentiPlex 풀링 라이브러리 전통을 사용합니다. 우리는 설정하고 deconvolute LentiPlex 화면을하고 결과를 확인하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 발현의 규정에 대한 본질적인 세포 메커니즘입니다. Harnessing이 시스템의 본래 능력은 유전자 기능 연구 손실 최저의 유전자 발현 수준에 우리가 수 있습니다.
RNAi를 수행하기위한 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째는 화학적 합성 아르 작은 방해 RNAs (siRNAs)의 사용이며, 두 번째는 plasmids 1 ~ 인코딩된 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 활용합니다. 후자는 직접적으로 세포로 transfected 또는 복제 무능 lentiviral 입자로 포장하실 수 있습니다. lentiviral shRNAs를 사용하여의 주요 장점은 셀 유형, 안정적으로 장기 유전자 최저 및 선택에 대한 게놈에 통합하는 능력과 기능 화면의 높은 처리량 손실을 실시 그들의 효험 다양한으로 도입의 용이성이다. 이것을 촉진하기 위해서 우리는 shRNA 라이브러리를 풀링 LentiPlex을 만들었습니다.
MIS시온의 LentiPlex 인간 shRNA 풀링 도서관은 독자적인 프로세스를 사용하여 제작 게놈 전체 lentiviral 수영장입니다. 도서관은 15,000을 대상으로 TRC 컬렉션에서 75,000 이상 shRNA 구조 + 인간 유전자 2로 구성되어 있습니다. 각 라이브러리는 강력한 라이브러리 범위를 보장하기 위해 제품 출시 전에 shRNA 표현에 대해 테스트됩니다. 도서관은 p24 분석을 통해 적어도 5 X 10 8 TU / ML의 titers에서 즉시 사용 lentiviral 형식으로 제공하고 있습니다 미리 나누어 약 8,000 shRNA 십 subpools으로 각각 구성. 증폭 및 시퀀싱 primers는 또한 스트림 대상 식별을 위해 제공됩니다.
A549 세포, 인간의 폐 암종 세포 라인 3, 4에서 Paclitaxel과 함께 할 때 이전 연구 흔적 시너지 antitumor 활동을 설립하였습니다. 본 연구에서는 우리는 풀링 LentiPlex shRNA 라이브러리 응용 프로그램이 빠르게 세포 독성 O에 관련된 유전자에 대한 긍정적인 선택 화면을 수행할 입증F A549 세포 트레일 및 Paclitaxel에 노출. 종종 높은 처리량 화면이 발생 한 장벽은 비용과 deconvolution에 어려움이있다, 우리는 세부 전통적인 시퀀싱을 활용 비용 효과적인 접근 방식을 polyclonal.
Protocol
LentiPlex 풀링 화면 설정
관심 shRNA 시퀀스를 식별하기 위해서는 세포의 대부분은 하나의 shRNA는 구조받을 그러한 화면을 설정하는 것이 중요합니다. (감염의 다중성)해서는 낮은을 사용하여 셀 당 여러 integrants의 확률이 크게 감소됩니다. 그러나, 전달 효율, 따라서 원하는 MOIs는 대상 세포 유형에 강하게 의존한다. 따라서 최적의 방어의 결정은 새로운 셀 유형 화면을 시작하기 전에 수행됩니다 것이 필수적입니다.
1. 미션 LentiPlex와 대상 세포의 형질 도입이 shRNA 라이브러리 풀링
- 사용 입니다만 실제로는 다른 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 원하는 아르 복제면 접시의 개수가 적절하게 증가되어야합니다. 또한, 일반적으로 그것은 다른 subpools을 결합하기 유리한되지 않습니다. subpools 별도로 유지하면 deconvolution 과정에 도움이됩니다. prope을 보장합니다도입시 적용됩니다 subpool 번호와 함께 조직 문화 요리의 R 라벨. 입니다만 낮은는 셀 당 여러 integrants의 확률을 줄이기 위해 좋습니다.
- 제 1 일 - 다음날 (총 10 개의 수영장, = 30 요리를 총 세중의에서 수행한 각)에 ~ 70% confluency을 얻을 정도로 세포와 60 mm 요리 씨 적절한 번호입니다. 우리의 연구, 60mm 요리 전에 도입 70 %의 confluency을 달성 6 X 105 A549 세포와 씨앗을 품고 있었다. 이것은 세포가 기하 급수적으로 성장 단계에 아직도 얻을 수 있습니다. 성장 속도는 세포 유형별로 다를 수 있으며 화면을 시작하기 전에 결정되어야합니다.
- 세포가 37 ° C 야간 잠복기를 humidified 인큐베이터에서 5 % CO 2의 분위기에 의해 준수하도록 허용합니다.
- (선택 사항) 부정적인 제어 shRNAs와 함께 도입을위한 두 개의 추가 60 mm 요리를 포함합니다. 요리 분류는 "제어"SHC001H 및 SHC002H에 대해 "제어 B"에 대한.
- 일 2 - Transduce의 일LentiPlex 바이러스 입자와 전자 세포. 형질 도입의 날, 얼음 lentiviral 입자를 녹여.
- 층류 후드에 해동 입자를 전송하고 즉시 사용하지 않을 경우 얼음 계속.
- 계산이 얼마나 모든 세포 배양 접시에 걸쳐 방어 1을 얻기 위해서는 세포에 추가할 각 바이러스 하위 수영장.
- 예 : 1 × 10 6 세포 / 요리, 바이러스성 titer = 5 X 10 8 TU / ML, 원하는 입니다만 1. I. 1) X 10 6 세포 / 요리 X (방어 1) = 1 × 10 6 transducing 단위 (TU)가 필요 II.) 1 X 10 6 TU / (5.0 × 10 8 C에서 얻은 TU / ML) lentiviral 재고 솔루션 = 2 μL은 해당 요리에 추가되어 있어야합니다. 세포 배양 접시에 추가된 바이러스의 더 나은 유통을 보장하기 위해 전체 미디어 100-300 μL의 바이러스의 계산된 금액을 희석.
- 미리 씨앗 세포에서 미디어를 제거합니다. 전체 미디어 conta 추가각각의 접시에 ining hexadimethrine의 브로마이드 솔루션입니다. 미디어 hexadimethrine 브로마이드의 권장 최종 농도는 8 μg / ML입니다. 당신이 당신의 목표 세포에 독성으로 찾으면 덜 hexadimethrine 브로마이드를 사용합니다.
- 미리 실험 설계에 따라 적절한 요리 shRNA lentiviral 입자를 추가합니다. 부드럽게 소용돌이 접시가 균일하게 세포에 걸쳐 바이러스를 배포합니다.
- 37 18-20시간을 품어 ° 5퍼센트 CO 2 분위기에서 humidified 인큐베이터에서 C.
- (선택 사항) 및 제어 요리 B.의 SHC002H이 (shRNA 제어 발진) 실험을 통해 실험 요리 동일하게이 요리를 대접 제어 접시에 (빈 벡터 shRNA 제어) SHC001H과 방어 동일한에서 반복 3-8.
- 3 일 - 미디어를 변경합니다. 바이러스가 포함된 미디어를 대기음 신선한 전체 미디어 (hexadimethrine의 브로마이드 제외) 추가합니다. ° C 야간 37 세포를 품어.
2. 도금 치료치료 구성 요소 / 시약과 셀
- 하루 4 - 우물에서 대기음 미디어와 최적의 농도에서 치료 구성 요소를 포함하는 새로운 미디어를 추가할 수 있습니다. 문화 조건과 마찬가지로 치료 다를 수 있으며, 적절한 농도와 기간이이 미리 결정되어야합니다. 우리의 연구에서는, 우리는 100 NG / 트레일과 Paclitaxel 1 μm의의 ML를 사용합니다. 전지는 48 시간 동안 치료를했다.
- 살아남은 세포 T75 flasks에 다시 씨앗을 품고 거의 백퍼센트 합류까지 확장할 수 있어야합니다.
- (선택 사항) 선택의 끝에서 제어 요리 B. 요리와 요리 B는 각 풀링 라이브러리 요리 중 적어도 하나 이상의 이하의 식민지가 있어야 요리를 제어 검사. 접시에 식민지의 예기치 않게 높은 번호가있는 경우, 각 형질 도입 프로세스가 원하는 표현형 또는 선택적 압력에 관련된 경로 영향을보다 분석의 충분히 강한 다시 최적화되지 않습니다이 필요할 수 있습니다. 요리 B는 너무 많은 식민지가 포함되어있는 경우다음 RNAi 경로의 shRNA과 참여 표현 관심 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 효과가 SHC002H 특정되지 않도록 SHC001H있는 경우 반복하는 경우.
3. polyclonal 세포 인구에서 Deconvolution
- 각 subpool에서 세포의 이종 인구 수확 및 게놈 DNA를 분리. 우리의 시험에서는, 세포는 PBS에 잠시 세탁 및 게놈 DNA가 포유류의 게놈 GenElute Miniprep 키트 및 공급 프로토콜 (시그마 - 올드 리치, G1N70)를 사용하여 고립되기 trypsinized되었습니다. 또는 시장에서 현재 사용할 수있는 다른 게놈 정화 키트는 DNA 분리에 사용할 수 있습니다. 교양 세포의 시작 금액에 대한 프로토콜 권장 사항을 따르십시오하는 것이 중요합니다.
- 대상의 PCR 증폭. shRNA 템플릿 복구 절차는 선택한 셀 인구에서 shRNA 삽입의 전체 수영장 증폭, 또는 indivi의 검색을 가능하게개별적으로 포착하고 확장되었다 식민지에서 이중 shRNA 템플릿. 제어 및 선택한 대상 세포에서 shRNA 삽입의 증폭 후, PCR 제품은 합성 수 있습니다.
- 이 PCR 증폭 단계는 시그마 ReadyMix, 카탈로그 번호 P2893을 사용하여 최적화되었습니다. 기타 시약은 증폭에 사용할 수 있지만, 사이클링 조건 및 / 또는 마그네슘 농도가 성공적으로 증폭을 위해 수정해야 할 수 있습니다. 농도 20 MM에서 증폭 primers는 LentiPlex 키트에 포함되어 있습니다.
- 표 1에서 설명한대로 PCR 반응을 설정합니다. 나열된 순서대로 구성 요소를 추가합니다. 설명 금액 한 50 μL 반응을위한 것입니다. 더 많은 반응을 보려면 반응 원하는 숫자로 마스터 믹스 구성 요소를 규모와 10 %의 없더군요를 포함합니다. 권장 DNA 템플릿의 양은 50-100 NG입니다.
- 그것은 강력 한 반응에 대한 템플릿 appropr에 희석 미션 shRNA 인간 긍정적인 제어 벡터로 구성되어 것을 권장합니다집중을 늦었어. 이 템플릿과 함께 성공적인 확대는 PCR 분석 구성 요소 및 사이클링 조건이 충분한 것을 나타냅니다. 참고 : 실험 샘플 및 시약의 carryover 오염을 방지하기 위해, 그것이 긍정적인 컨트롤이 이후의 PCR 반응이 설정이있는 곳에서 별도의 위치에 희석하는 것이 좋습니다.
- 귀하의 thermocycler에 표 2에 나열된 PCR 프로그램을 저장합니다.
- 각 예제, DirectLoad 5 μL와 함께 염색과 electrophorese 1 μL 3 μL PCR 반응 ™ PCR 100 BP 낮은 사다리, 카탈로그 번호 D3687 1 % 아가로 오스 겔에 309 BP의 amplicon의 존재를 확인을 결합.
- PCR amplicons의 Subcloning : PCR 제품 TOPO이 (Invitrogen, K4575 - 01) 제조 업체의 프로토콜 다음, TOPO - TA 클로닝 키트를 사용하여 복제되었습니다. 그 결과 하나의 PCR 제품의 각 벡터에 포함된 것입니다.
- 250 개인 세균성 식민지는 (각 각 PCR amplicon을 포함) 격리 성장했다N 100 MG / ML 암피실린와 LB 2 ML 문화 인치 플라스미드 DNA는 다음 GenElute 플라스미드 Miniprep 키트 (시그마 - 올드 리치, PLN70)을 사용하여 추출되었습니다.
- 플라스미드 DNA를 정화하는 것은 EcoRI로 소화하며 삽입의 존재를 확인하는 electrophoresed되었습니다.
- 플라스미드 DNA 샘플은 다음 합성과 shRNA 삽입은 LentiPlex 라이브러리와 함께 제공되는 LentiPlex의 shRNA 순서 검색 데이터베이스를 사용 확인되었습니다.
4. 대상 식별 및 검증
- shRNA 시퀀스는 5' - GAAACACCGG - 3 '로 시작합니다. 동봉된 shRNA 시퀀스 검색 Access 데이터베이스 양식에있는 검색 상자에 검색어를 순서대로 적어도 10 다음 있지만 미만 21 세포핵을 입력합니다.
- 풀링 shRNA의 종류를 선택합니다. 선택, 순서가 발견하는 subpool을 선택합니다.
- 이제 검색을 수행하기 위해 "잠재력 조회수 찾기"버튼을 클릭하십시오. 이것은 일과 일치하는 해당 TRC shRNA 시퀀스 (들)을 파악해야전자 데이터를 순서. TRC shRNA 순서에 대한 자세한 내용 (들)은 식별하고 해당 유전자의 목표는 쉽게 시그마 - 올드 리치의 즐겨찾기 진에서 찾을 수 있습니다 : http://www.sigma.com/yfg을
- 확인된 대상 유전자는 원래 TRC 클론 더하기 하나 잘 형식으로 1 shRNA를 사용하여 동일한 유전자를 대상으로 최소한 두 개의 추가 shRNAs와 함께 원래의 심사 분석을 반복하여 확인하여야한다. 진정한 조회수 웰스의 대부분에서 동일한 표현형 표시됩니다.
5. 대표 결과
LentiPlex 풀링 화면 흐름의 예제는 그림 1에서 자세한 있습니다. 트레일과 Paclitaxel의 면전에서 확산되는 Transduced 세포 flasks가 합류했다까지 확대 허용되었다. 게놈 DNA는 수확과 PCR 증폭 및 복제의 대상이 그림 1에서 그림과 같이가, 시퀀싱 및 shRNA 식별 제출되기 전에 같은 Figu에서 설명되었다다시 한 C. 250 클론은 이러한 25, 합성되었다 여러 클론으로 표시되었고, 나머지 225은 한 복제로 표현되었고 이번에 추진되지 않았습니다.
그림 2에 표시된 TBX3, PPP2CA 및 AKT2 포함한 여러 후보 유전자는 여러 클론로 표시되었습니다. T - 박스 전사 인자는 TBX3 네 클론의 총 나타나 종양 마이 그 레이션 5 연루되어있다. PPP2CA의 downregulation은 androgen 부족 유도된 세포주기 체포를 덜어 6 apoptosis 방지하여 androgen 부족한 조건에서 교양 LNCaP 세포의 성장을 유지하기 위해 증명되었습니다. AKT2 암 개발 7, 8에서 여러 역할을 재생하는 시연 RAC - 베타 세린 / 트레오닌 단백질 키나제 및 putative oncogene이다.
MG 2 * 최종 농도는 + 용액 3 MM 것입니다;1.5 MM은 DNA 형성 촉매 ReadyMix과 마그네슘 염화물 용액에서 1.5 밀리미터에서 기여하고 있습니다.
표 1. Lentiplex PCR 반응 조건
표 2. Lentiplex PCR 증폭 프로그램
그림 1. (A) LentiPlex은 화면 풀링 (B) Polyclonal deconvolution 작업 흐름과 shRNA 타겟의 (C) 신분증.
A.의 LentiPlex 화면을 풀링. 첫째, 종자 세포가 다음 (총 10 개의 수영장, 세중의에서 수행한 각, 총 30 요리), shRNA를 subpools를 추가합니다. 다음 치료 구성 요소 / 시약 (우리의 경우 트레일와 아빠의와 치료각각 clitaxel). 그런 다음, flasks에서 살아남기 세포를 reseed 확대 수 있습니다. 수확 이기종 각 subpool 세포 인구 게놈 DNA를 분리.
B. Polyclonal deconvolution가. shRNA 삽입을 포함하는 DNA를 증폭하기 위해 PCR을 수행합니다. 템플릿 gDNA 또한 polyclonal 이후 PCR 제품의 크기는 균일하지만, 차례로 polyclonal 있습니다. PCR 제품은 벡터로 복제된 후 관할 세균으로 변환됩니다.
shRNA 대상의 식별 C.. 각 식민지가 고립되고 플라스미드 DNA가 추출됩니다. 각 클론 한 개인 PCR 조각으로 복제 벡터를 포함하고 있습니다. 플라스미드 DNA는 삽입과 합성의 존재를 확인하기 위해 소화 있습니다. shRNA 삽입은 LentiPlex의 shRNA 순서 검색 데이터베이스를 사용 식별됩니다.
그림 2. 수 확인된didate 유전자. 25 후보 유전자는 여러 히트 있다고 확인했다. 225 후보 유전자는 단 1 안타를했고 추구되지 않았습니다. 후보 유전자마다 각각의 클론의 고장에 대한 보충 표 1을 참조하십시오.
보충 표 1. Polyclonal 시퀀싱의 유전자 ID에서 확인된 개별 TRC 도서관 클론이 발견 클론을 조회.
Discussion
본 연구에서는, 우리는 paclitaxel / 오솔길 치료 다음과 같은 A549 세포의 세포 독성에 관련된 유전자를 식별하는 게놈 - 와이드 스크린을 제시. 게놈 - 와이드 스크린의 풀링 방법의 사용은 시간, 비용, 일반적으로 기존의 못하였 느니라 스크린과 관련된 설비 투자를 줄일 수 있습니다. 화면의 성공에 중요한 사전에 수행 최적화 실험이 있습니다. 형질 도입 조건과 방어는 경험적으로 결정되어야합니다.
선택 방법은 원하는 표현형 (예, 생존, 표면 단백질 발현 등) 표시 세포의 강력한 선택할 수 있도록해야합니다. 이러한 매개 변수의 최적화가 감지 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다.
여기 gDNA가 선택 세포의 대량 인구에서 수확했다 그리고 TOPO 개별 shRNA 삽입을 식별하는 복제. 본 실험에 대한 한 가지 가능한 개선하기 위해 FACS를 사용하여 라이브 세포를 선택했을만이 살 세포가 수집됩니다. 식별 대상은 심사 분석의 대상 특정 shRNAs과 도입에 의해 확인됩니다. 진정한 조회수 웰스의 대부분의 표현형를 표시합니다.
LentiPlex 풀링 라이브러리는 응용 프로그램에 융통성이 있습니다. 그것은 하류 어플 리케이션의 광범위한 배열과 호환되며 긍정적이거나 부정적인 중 선택 전략과 함께 사용할 수 있습니다. shRNA 삽입의 deconvolution가 PCR / 복제, microarray, 또는 차세대 시퀀싱 9, 10을 통해 달성이며, 심사 조건에 따라 다릅니다. RNAi 화면을 deconvolute 이러한 기술의 파워와 속도가 잘 구축하는 동안 하나의 microarray와 관심과 차세대 시퀀싱 방법은 생물 정보학 자원과 지식을 정확하게 분석하고 실험 결과를 해석하는 데 필요한의 가용성이다. 이러한 기술과 관련된 비용은 종종 시간 게놈 와이드 스크린의 사업에 대한 장벽 수 있습니다. APCR / 복제 기반의 접근 방식, microarrays 및 차세대 시퀀싱으로 동안으로 강력한 아닌 효과적이고 저렴한 대안입니다.
애질런트는 이제 LentiPlex 화면에서 추가 지원하는 TRC shRNA 라이브러리를 기반으로 사용자 정의 배열을 제공합니다. 이러한 옵션은 연구자가 세포 기능의 다양한 공부를 LentiPlex를 사용할 수 있습니다.
Disclosures
매튜 J. Coussens, 커트니 Corman, 애쉴리 L. 피셔, 잭 사고, 그리고 존 Swarthout이 문서에서 사용되는 도구와 시약을 만드는 시그마 - 올드 리치에 의해 고용하고 있습니다.
Acknowledgments
목표는 시그마 - 올드 리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다
LentiPlex는 시그마 - 올드 리치 생명 공학 LP의 상표입니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LentiPlex Pooled Array |  Sigma-Aldrich |
SHPH01 | |
| A549 Cells | ATCC | CCL-185 | |
| TRAIL | Sigma-Aldrich |
T5694 | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich |
T7402 | |
| Topo TA Cloning Kit | Invitrogen | K4575-01 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich |
P2893 | |
| GenElute Plasmid Miniprep kit | Sigma-Aldrich |
PLN70 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich |
H9268 |
References
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