LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

Summary

Aqui usamos uma biblioteca LentiPlex humanos agrupados e tradicionais métodos de seqüenciamento de genes para identificar alvos promover a sobrevivência celular. Demonstramos como configurar e deconvolute uma tela LentiPlex e validar os resultados.

Abstract

RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo intrínseco de celular para a regulação da expressão gênica. Aproveitar o poder inato deste sistema nos permite níveis knockdown expressão gênica em perda de estudos da função gênica.

Existem dois métodos principais para a realização de RNAi. O primeiro é o uso de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que são sintetizados quimicamente, eo segundo utiliza-hairpin RNAs curtos (shRNAs) codificado dentro plasmídeos ^1. Este último pode ser transfectados em células direta ou embalados em replicação de partículas lentiviral incompetentes. As principais vantagens de usar shRNAs lentiviral é a facilidade de introdução em uma grande variedade de tipos de células, a sua capacidade de integrar de forma estável no genoma para knockdown do gene longo prazo e seleção, e sua eficácia na condução de alto rendimento perda de telas de função. Para facilitar isso criamos o LentiPlex pooled shRNA biblioteca.

O MISSION LentiPlex Biblioteca shRNA Humanos Pooled é um pool genome-wide lentiviral produzidos usando um processo patenteado. A biblioteca é constituída por mais de 75.000 construções shRNA da coleção alvo TRC + 15.000 genes humanos ^2. Cada biblioteca é testada para a representação shRNA antes do lançamento do produto para garantir a cobertura da biblioteca robusta. A biblioteca é fornecida em um formato pronto-to-use lentiviral em títulos de pelo menos 5 x 10 ⁸ TU / ml via ensaio p24 e é pré-dividido em dez subpools de aproximadamente 8.000 shRNA constrói cada um. Primers de amplificação e sequenciamento também são fornecidos para a identificação do alvo a jusante.

Estudos anteriores estabeleceram uma atividade antitumoral sinérgica de TRAIL, quando combinado com paclitaxel em células A549, um ser humano de pulmão linha de células de carcinoma ^{3, 4.} Neste estudo demonstramos a aplicação de um pool biblioteca LentiPlex shRNA rapidamente conduzir uma tela de seleção de positivo para genes envolvidos na citotoxicidade of A549 células quando expostas a TRAIL e Paclitaxel. Uma barreira muitas vezes encontrados com telas de alto rendimento é o custo ea dificuldade de deconvolução; detalhamos também uma abordagem custo-benefício policlonais utilizando sequenciamento tradicional.

Protocol

LentiPlex Configuração da Tela de Pooled

Para identificar seqüências shRNA de interesse, é fundamental para configurar a tela de tal forma que a maioria das células recebem apenas um shRNA construir. Usando uma baixa MOI (multiplicidade de infecção), a probabilidade de vários integrantes por célula é diminuído substancialmente. No entanto, a eficiência de transdução, e, portanto, MOIS desejado, depende fortemente do tipo de célula-alvo. Portanto, é imperativo que a determinação do MOI ideal é realizado antes de iniciar a tela em um novo tipo de célula.

1. Transdução de células alvo com o LentiPlex Missão Pooled shRNA Biblioteca

1. O real MOI utilizado irá variar para diferentes tipos de células. Se replica são desejados, em seguida, o número de placas deve ser aumentado em conformidade. Além disso, normalmente, não será vantajoso para combinar a subpools diferentes. Mantendo o subpools separado auxiliar no processo de deconvolução. Garantir Proper rotulagem de cada prato de cultura de tecidos com o número subpool que é aplicada durante a transdução. A baixa MOI é aconselhado a reduzir a probabilidade de vários integrantes por célula.
2. Dia 1 - Semente do número apropriado de 60 mm de pratos com células suficientes para obter ~ 70% confluência no dia seguinte (10 piscinas no total, cada um realizado em triplicata = 30 pratos total). Para o nosso estudo, 60 pratos mm foram semeados com 6 x 105 células A549 para alcançar uma confluência de 70% antes de transdução. Isso garante que as células ainda estão em fase de crescimento exponencial. Taxas de crescimento variam de acordo com tipo de célula e deve ser determinado antes de iniciar a tela.
3. Permitem que as células a aderir pela incubação overnight a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO _2.
4. (Opcional) Incluir mais dois pratos de 60 mm para a transdução com shRNAs controle negativo. Rotular os pratos "Controle A" para SHC001H e "Control B" para SHC002H.
5. Dia 2 - ª transduçãocélulas e com as partículas LentiPlex viral. No dia da transdução, descongelar as partículas lentiviral no gelo.
6. Transferir as partículas descongelado para uma capela de fluxo laminar e manter em gelo, se não ser utilizado imediatamente.
7. Calcular o quanto de cada indivíduo viral sub-pool para adicionar as células para obter o MOI de 1 em todas as placas de cultura de célula.
   1. Exemplo: 1 x 10 ⁶ células / prato; título Viral = 5 x 10 ⁸ TU / ml, um desejado MOI de 1. i.) 1 x 10 ⁶ células / prato x (MOI de 1) = 1 x 10 ⁶ unidades de transdução (TU) necessários ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) obtidos a partir do C da A = 2 mL da solução de reserva lentiviral deve ser adicionado ao prato apropriado. Diluir o montante calculado do vírus em 100-300 mL de mídia completa, a fim de assegurar uma melhor distribuição do vírus quando adicionado ao prato de cultura de células.
8. Remova a mídia a partir de células pré-semeado. Adicionar completa media Contasolução de brometo Ining Hexadimetrina para cada prato. A concentração final recomendada de brometo de Hexadimetrina nos meios de comunicação é de 8 mg / ml. Use menos o brometo Hexadimetrina se você achar que ele seja tóxico para as células-alvo.
9. Adicionar Particulas de Lentivirus shRNA aos pratos apropriados, em conformidade com o projeto pré-determinado experimental. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente o vírus através de células.
10. Incubar 18-20 horas a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO _2.
11. (Opcional) Repita 3-8 na idênticos MOI com SHC001H (vazio vetor shRNA Control) em Dish Controle A e SHC002H (mexidos shRNA controle) em Dish Controle B. Tratar estes pratos de forma idêntica para os pratos experimentais durante o experimento.
12. Dia 3 - Troque a mídia. Aspirar-vírus contendo mídia e adicionar novos media completo (sem brometo de Hexadimetrina). Incubar as células a 37 ° C durante a noite.

2. Tratar platedcélulas com componente terapêutica / reagente

1. Dia 4 - Aspirar media de poços e adicionar novas mídias contendo componente terapêutica na concentração ideal. Tal como acontece com as condições de cultura, os tratamentos vão variar e concentrações adequadas e durações deve ser determinada de antemão. Em nosso estudo, foram utilizados 100 ng / mL de TRAIL e 1 mM de Paclitaxel. Células foram tratadas por 48 horas.
2. Células sobreviventes devem ser re-semeada em frascos T75 e permitiu expandir até quase 100% confluentes.
3. (Opcional) No final da seleção, inspecionar controle Dish A e Controle Dish Dish B. A e B Dish cada um deve ter menos de colônias, pelo menos, um dos pratos biblioteca pool. Se houver um número inesperadamente elevado de colônias em um prato, que qualquer processo de transdução afetou um caminho relacionado com o fenótipo desejado ou a pressão seletiva não é suficientemente forte e re-otimização do ensaio pode ser necessária. Se B Dish contém muitas colônias, Então a expressão de shRNA eo engajamento da via RNAi pode ter um efeito sobre o fenótipo de interesse. Se este for o caso repita com SHC001H, para garantir que o efeito não é específico para SHC002H.

3. Deconvolução a partir de uma população de células policlonais

1. Colheita da população heterogênea de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico. Em nosso estudo, as células foram lavadas rapidamente em PBS e tripsinizados antes de DNA genômico foi isolado usando o GenElute mamíferos Genomic Miniprep kit e fornecido protocolo (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativamente, qualquer kits de purificação de genômica outros que estão atualmente disponíveis no mercado podem ser usados ​​para o isolamento de DNA. É importante seguir as recomendações de protocolo para o montante de partida das células em cultura.
2. A amplificação de alvos. O procedimento de recuperação shRNA modelo permite a amplificação de todo o pool de inserções shRNA da população de células selecionado, ou a recuperação de individupla modelos shRNA de colônias que foram escolhidos individualmente e expandido. Após a amplificação de insertos shRNA do controle e as células-alvo selecionados, os produtos de PCR pode ser seqüenciado.
3. Esta etapa de amplificação por PCR foi otimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Outros reagentes podem ser usados ​​para a amplificação, mas as condições de bicicleta e / ou concentração de magnésio pode precisar ser modificado para amplificação bem sucedida. Primers de amplificação na concentração de 20 mM estão incluídos no kit LentiPlex.
4. Configurar a reação de PCR, conforme descrito na Tabela 1. Adicione os componentes na ordem listada. Os montantes descritos são para uma reação de 50 mL. Para mais reacções, escala os componentes master mix pelo número desejado de reações e incluem sobrecarga de 10%. A quantidade de DNA modelo recomendado é de 50-100 ng.
5. É altamente recomendável que, para uma reação do modelo consiste na MISSÃO Controle de Vetores shRNA Humanos Positivo diluído para o adequado doiate de concentração. Amplificação de sucesso com este modelo indica que os componentes ensaio de PCR e as condições de ciclismo são adequados. NOTA: Para evitar contaminações de amostras e reagentes experimental, sugere-se que o controlo positivo seja diluído em um local separado, onde as reações posteriores PCR são criados.
6. Salve o programa PCR listados na Tabela 2 em seu termociclador.
7. Para cada amostra, combine 3 mL de reação de PCR com 1 mL de corante e electroforese juntamente com 5 mL de DirectLoad ™ PCR 100 bp Escada Baixo, número de catálogo D3687 em um gel de agarose 1% para confirmar a presença de um amplicon bp 309.
8. Subclonagem de PCR amplicons: produtos de PCR foram clonados TOPO utilizando o kit de clonagem TOPO-TA, seguindo o protocolo do fabricante (Invitrogen, K4575-01). O resultado é que um produto de PCR está contido em cada vetor.
9. 250 colônias de bactérias individuais (cada um contendo um indivíduo amplicon PCR) foram isolados e crescern em 2 mL de culturas LB com 100 mg / mL ampicilina. DNA plasmidial foi então extraído usando o GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. DNA plasmidial purificado foi digerido com EcoRI e eletroforese para confirmar a presença do inserto.
11. Amostras de DNA plasmidial foram seqüenciados ea inserção shRNA identificados utilizando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence fornecido com a biblioteca LentiPlex.

4. Identificação e Validação alvo

1. A seqüência inicia com shRNA 5'-GAAACACCGG-3 '. Digite pelo menos nos próximos 10, mas menos de 21 nucleotídeos como a seqüência de consulta na caixa de pesquisa na sequência shRNA fechado Pesquisa forma banco de dados Access.
2. Selecionar as espécies do shRNA em pool. Opcionalmente, selecione o subconjunto a partir do qual a seqüência foi encontrado.
3. Agora clique em "Find hits em potencial" para realizar a pesquisa. Isto deve identificar o correspondente TRC seqüência shRNA (s) que correspondem ªe seqüenciamento de dados. Mais informações sobre a seqüência shRNA TRC (s) identificados e as metas gene correspondente pode ser facilmente encontrada no Sigma-Aldrich é o seu favorito Gene: http://www.sigma.com/yfg
4. Genes-alvo identificados devem ser validados pela repetição do ensaio de rastreio original com o clone TRC original mais pelo menos duas shRNAs adicionais que visam o mesmo gene usando um shRNA 1-1 formato bem. Bate verdade irá exibir o mesmo fenótipo na maioria dos poços.

5. Resultados representante

Um exemplo de um fluxo de trabalho da tela LentiPlex pooled é detalhado na Figura 1. Transduzidas células que proliferaram na presença de TRAIL e Paclitaxel foram autorizados a se expandir até frascos foram confluentes. DNA genômico foi colhida e submetida à amplificação por PCR e clonagem como ilustrado na Figura 1 A, antes de ser submetido à identificação e seqüenciamento shRNA como descrito no FIGUre 1 C. 250 clones foram seqüenciados, destes 25 foram representados por clones múltiplos e os 225 restantes foram representados por apenas um clone e não foram perseguidos neste momento.

Conforme mostrado na Figura 2, vários genes candidatos, incluindo TBX3, PPP2CA e AKT2 foram representados por clones múltiplos. O fator de transcrição T-box, TBX3 apareceu em um total de quatro clones e tem sido implicado na migração do tumor ^5. Downregulation PPP2CA tem sido demonstrado para manter o crescimento de células cultivadas em LNCaP andrógeno condições deficientes, aliviando o andrógeno-privação induzida por parada do ciclo celular e impedindo a apoptose ^6. AKT2 é uma serina RAC-beta / treonina proteína-quinase e oncogene putativo demonstrado que desempenhar vários papéis em câncer de desenvolvimento ^{7, 8.}

* Concentração final de Mg ^{2 +} em solução será de 3 mM;1,5 mM é uma contribuição do Readymix Taq e 1,5 mM de solução de cloreto de magnésio.
Tabela 1. Reaction Lentiplex Condições PCR

Tabela 2. Lentiplex Programa de Amplificação PCR

Figura 1. (A) LentiPlex pooled tela, (B) deconvolução workflow policlonais, e (C) identificação de alvos shRNA.

LentiPlex A. pooled tela. Primeiro, as células de sementes, em seguida, adicione subpools shRNA, (10 piscinas no total, cada uma feita em triplicado, por 30 pratos total). Em seguida, tratar com componente terapêutica / reagente (no nosso caso, TRAIL e Paclitaxel, respectivamente). Então, reseed células sobreviventes em frascos e deixe crescer. População heterogênea colheita de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico.

B. deconvolução policlonais. Perform PCR para amplificar DNA contendo a inserção shRNA. O produto da PCR é uniforme em tamanho, mas policlonais em seqüência desde o gDNA modelo também foi policlonais. Produto de PCR é clonado no vetor e depois transformado em bactérias competentes.

C. Identificação de alvos shRNA. Colônias individuais são isolados e plasmídeo de DNA é extraído. Cada clone contém o vetor de clonagem com um fragmento de PCR individual. Plasmídeo de DNA é digerido para confirmar a presença da inserção e seqüenciados. A inserção shRNA é identificado usando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence.

Figura 2. Pode identificadosGenes didatos. 25 genes candidatos foram identificados, que tinha vários hits. 225 genes candidatos tiveram apenas 1 hit e não foram perseguidos. Por favor, consulte a Tabela Complementar 1 para a repartição dos clones individuais por gene candidato.

Tabela Suplementar 1. Clones individuais TRC Biblioteca identificados a partir de ID policlonais Seqüenciamento Gene hits Clones detectado.

Discussion

Neste estudo, apresentamos uma tela de todo o genoma para identificar genes envolvidos na citotoxicidade de células A549 seguinte paclitaxel / TRAIL tratamento. O uso de uma abordagem conjunta em uma tela do genoma reduz o tempo, custo e investimento em equipamentos normalmente associados com telas convencionais vestiu. Fundamental para o sucesso da tela são experimentos de otimização realizado com antecedência. Condições de transdução e MOI deve ser determinado empiricamente.

O método de selecção devem permitir a seleção robusta de células exibindo o fenótipo desejado (por exemplo, a sobrevivência, a expressão de proteínas de superfície, etc). Otimização destes parâmetros irá reduzir o número de falsos positivos detectados.

Aqui, gDNA foi colhida da população em massa de células selecionadas e depois TOPO clonado para identificar insere shRNA individual. Uma possível melhora para este experimento teria sido selecionar para células vivas usando FACS para garantirque apenas as células vivas são coletadas. Os alvos identificados serão validados por transdução com destino-específico shRNAs em um ensaio de rastreio. Bate verdade irá exibir o fenótipo na maioria dos poços.

A Biblioteca LentiPlex Pooled é flexível na sua aplicação. É compatível com uma ampla gama de aplicações a jusante e pode ser usado com estratégias de seleção positiva ou negativa. Dependendo das condições de triagem, deconvolução das inserções shRNA é realizado através de PCR / clonagem, microarray, ou a próxima geração de sequenciamento de ^{9, 10.} Enquanto a potência ea velocidade destas técnicas para deconvolute telas RNAi está bem estabelecida, uma preocupação com microarray e próxima geração de métodos de seqüenciamento é a disponibilidade de recursos de bioinformática e conhecimentos necessários para analisar e interpretar corretamente os resultados experimentais. Os custos associados a estas técnicas podem muitas vezes ser uma barreira para a empresa de telas de genoma de largura. APCR / clonagem abordagem baseada, embora não tão poderoso como microarrays e sequenciamento de última geração é uma alternativa de custo eficaz e de menor.

Agilent oferece agora um conjunto personalizado baseado na biblioteca shRNA TRC para ajudar ainda mais em telas LentiPlex. Essas opções permitem que os pesquisadores de usar LentiPlex para estudar uma grande variedade de funções celulares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268