GENPLAT: una plataforma automatizada para el descubrimiento de enzimas de la biomasa y la optimización Cocktail

Summary

GENPLAT (Plataforma GLBRC la enzima) es una plataforma automatizada para el descubrimiento y optimización de los cócteles de enzimas para la degradación de la biomasa. Se puede adaptar a las materias primas y varias mezclas de enzimas que contienen múltiples componentes.

Protocol

1. Producción de enzimas

1. La producción de proteínas en Pichia pastoris mediante la clonación de los genes correspondientes en vectores pPICZ o pPICZα y su transformación en P. pastoris. Se cultivan las células en 300 ml en lotes desconcertado matraces de 500 ml con la inducción de metanol cada 24 horas (Banerjee et al., 2010a).
2. Concentrar y desalinizar los filtrados del cultivo por filtración de flujo tangencial.
3. Tienda de las enzimas en pequeñas alícuotas de 20% de glicerol a -80 ° C. El rango de concentración es 1.10 mg / ml.

2. Diseño del Experimento

1. Introduzca el número de enzimas para la prueba, su superior e inferior de proporciones (por ejemplo, una menor proporción de 5% para las enzimas del núcleo), y el tipo de diseño experimental (por ejemplo, cuadrática o cúbica) en el diseño Expertsoftware.
2. Calcular la cantidad en mg de cada enzima que se añade a hacer una carga total de 15 mg / g glucano, y después calcular la cantidad de cada enzima en l que añadir acada reacción.
3. Generar hojas de cálculo Excel especificando material de laboratorio de origen, los pozos de la fuente, material de laboratorio de destino, los pozos de destino, y los volúmenes de transferencia para la distribución de agua y las enzimas de acuerdo con el diseño experimental y la importación en el software Biomek FXP utilizando la función de transferencia-de-archivo.

3. La hidrólisis enzimática

1. Suspender la suspensión de la biomasa en 50 mM de citrato sódico, pH 4,8, que contiene 5 mg / ml de tetraciclina y 5 cicloheximida mg / ml, en el embalse de paddle.
2. Robot pipeta 200 ul de la mezcla en cada pocillo de una placas de 96 pocillos de reacción de pozo profundo con Span-8 1000-l puntas de pipeta con los últimos 0,5 cm cortado. Mezclar la pasta una vez a 100 l / seg y luego aspirar el mismo volumen de la reserva paddle y se distribuye en las placas.
3. Prescindir de las enzimas en el mismo plato con el programa entró en el FX Beckman.
4. Sellar las placas con capmats perforables.
5. Invertir y toquelas placas en varias ocasiones para superar la tensión superficial. Coloque las placas a 50 ° C durante 48 horas en la hibridación incubadora girando a 10 rpm.

4. Determinación de la Glc y XYL

1. Centrifugar las placas de reacción durante 3 minutos a 1250 xg en una centrífuga de basculante.
2. Transferencia de 100 l del sobrenadante en regulares placas de 96 pocillos con la vaina de la AP96 FX Biomek.
3. Las placas se incuban a 90-95 ° C durante 10 minutos para inactivar las enzimas, y luego se centrifuga a 1250 xg durante 30 segundos.
4. Para las mediciones de Glc, la transferencia de 12 l de los sobrenadantes en regulares placas de 96 pocillos. Añadir 192 l de la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) reactivo. Las placas se incuban a 50 ° C durante 20 minutos y leer las absorbancias a 510 nm en un lector de microplacas. En blanco se mezcla de reacción sin enzima.
5. Para las mediciones de XYL, la transferencia de 4 l en placas de 384 pocillos. Añadir los reactivos de ensayo y leer las placas a 340 nm. En blancoes la mezcla de reacción sin enzima.

5. Análisis de Datos

1. Convertir los valores de absorbancia a su Glc% y los rendimientos XYL basada en el conocido Glc y contenido XYL de la biomasa original. Importación de estos porcentajes, las respuestas en el software Design-Expert. Compruebe la paramenters estadísticos para asegurarse de que los criterios para un modelo sólido que se cumplan.
2. Confirman la predicción mejor modelo experimental.

6. Los resultados representativos con GENPLAT:

(1) Creación de mezclas optimizadas de cada uno de proteínas puras. Los resultados indican que las enzimas son importantes, y en qué proporciones, y también que las enzimas no son importantes. Algunas proteínas que son abundantes en la T. reesei secretoma (Nagendran et al., 2009), como Cip1 y CIP2, parecen desempeñar ningún papel en la liberación del maíz Glc pretratados por la expansión de fibra amoniaco (AFEX) o alcalino hyd rastrojo Rogen peróxido (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Por otro lado, algunas proteínas son inesperadamente importante. Por ejemplo, endo-xilanasas de las familias de glicosil hidrolasa 10 y 11 son importantes para la liberación Glc, una xilanasa no puede sustituir a la otra (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, una proteína de menor importancia en la T. reesei secretoma, es muy importante para Glc pero no XYL liberación. Algunas enzimas son importantes para la liberación de ambos Glc y XYL, mientras que otros sólo son necesarios para uno u otro (Banerjee et al., 2010c).

Una mezcla sintética que contiene 16 componentes, cada uno a una concentración de 0,94 mg / ml (es decir, una mezcla no optimizado), lanzado el 38% de la disponible Glc de AFEX pretratados DDG. En condiciones de hidrólisis idénticas, una mezcla optimizada, en la que las concentraciones de los 16 componentes del 0% al 32%, dado a conocer el 52% de la Glc (Fig. 2). Este experimento ilustra la utilidad de la construcción de mezclas definidas.

_content "> (2) Creación de un cóctel optimizado para el pretratamiento diferentes / combinaciones de sustrato. actuales preparaciones de celulasa comerciales son de" talla única para todos ". En realidad, el mejor cóctel depende del sustrato y el pretratamiento. Un solo producto como Accellerase 1000 ofrece diferentes rendimientos de los diferentes sustratos tratados previamente de la misma manera, y desde el mismo sustrato expuestos a diferentes tratamientos previos (Fig. 1). Hemos utilizado GENPLAT para optimizar las mezclas de enzimas puras para múltiples tratamientos previos y materias primas mutiple (Banerjee et al., 2010c). Figura 2 muestra cómo la proporción óptima de la enzima de 16 enzimas puras es diferente para el rastrojo de maíz AFEX pretratados, AHP pretratados rastrojo de maíz y DDG AFEX pretratados. Sólo el 11 por enzimas se muestra en la Fig. 2. porque el óptimo proporciones de los otros cinco (Cel61B, AbfB, Cip1, CIP2 y Cel12A) resultaron ser del 0% (Banerjee et al., 2010c).

(3) Nuevos descubrimiento de enzimas T. reesei y A. niger cultivado en diferentes sustratos. Un extracto especial impulsado Glc rendimiento cuando se añade a nuestra colección básica. La proteína responsable fue purificado y ha demostrado ser una hidrolasa novela glicosil no están presentes en cualquier preparado enzimático comercial (Banerjee y Walton, resultados no publicados).

(4) El descubrimiento de mejores enzimas. Después de haber demostrado con GENPLAT que las enzimas son más importantes para la degradación de unbiomasa en particular, tenemos una mejor comprensión de las enzimas que debe ser el enfoque de mejora. Mejores ejemplos de las enzimas críticas se puede encontrar buscando en la naturaleza o fabricados por ingeniería de proteínas. (Una enzima podría ser "mejor" que su homólogo de T. reesei de varias maneras, dependiendo de la propiedad deseada, por ejemplo, actividad específica más alta, una mayor sinergia, disminución de la sensibilidad proteolítica, o la estabilidad térmica mejorada). GENPLAT ofrece una plataforma significativa para el ensayo de enzimas potencialmente mejor, ya que utiliza un cóctel complejo realista (importante porque no enzimática de biomasa funciona en forma aislada) y un sustrato realista (importante porque los resultados con pura celulosa u otros sustratos artificiales pueden no ser relevantes para lignocelulósicos naturales materiales).

(5) la optimización de enzimas comerciales. Cantidades suficientes de enzimas puras no existen en el mundo real. Hasta que lo hagan, el etanol prolos productores deben confiar en los productos comerciales, tales como Accellerase 1000 y MultifectXylanase. Sin embargo, las mezclas de enzimas comerciales funcionan mejor que cualquier individuo, y GENPLAT se puede utilizar para el diseño optimizado de múltiples cócteles de enzimas comerciales. La Figura 3 muestra el uso de GENPLAT para optimizar una mezcla de cuatro preparados enzimáticos comerciales. Las proporciones óptimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG se encontró que el 47% Accellerase1000, el 27% Multifect pectinasa, el 22% Novozyme 188, y el 4% Multifect xilanasa (Banerjee et al., 2010c). Figura 3B muestra las diferencias en el rendimiento de AFEX Glc-DDG con cuatro preparados enzimáticos, la mezcla comercial optimizado ofrece un mayor rendimiento de Glc Accellerase1000 solo, SpezymeCP solo, o una mezcla sintética de 16 componentes. Esta experiencia también indica que la mezcla sintética de 16 componentes que falta uno o más enzimas necesarias para la óptima liberación Glc, que están presentes en uno o más de las enzimas comerciales. GENPLAT puede sered para identificar estos componentes.

Figura 1. No solo la preparación enzimática comercial es óptimo para todos los sustratos y pretratamientos todos. Cinco sustratos y tratamientos previos tres se compararon en las mismas condiciones de la molienda (0,5 mm de tamaño de partícula), la carga de la enzima (15 mg / g glucano), y las condiciones de hidrólisis (48 h, 50 ° C). A. La digestión de los diferentes sustratos pretratados AFEX con Accellerase 1000. digestión B. de rastrojo de maíz pretratadas con tres métodos diferentes con Accellerase 1000 (ver Banerjee et al., 2010c).

Figura 2. Proporciones óptimas de 11 enzimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados con el rastrojo de maíz (AFEX-CS), alcalinas de peróxido de hidrógeno pretratados con el rastrojo de maíz (AHP-CS), o AFEX pretratados secos destilargranos de res "(AFEX-DDG). Los datos proceden de Banerjee et al. (2010c). Números en la parte superior de las barras son los rendimientos Glc como un porcentaje del total de Glc en la muestra de la biomasa.

Figura 3. A. El uso de GENPLAT para producir una mezcla optimizada de los cuatro preparados enzimáticos comerciales para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG. Multifect xilanasa hecho la contribución más pequeña (4%) y por lo tanto, se omitió en este diagrama ternario. Glc B. rendimientos de AFEX-DDG con tratamientos de enzimas diferentes en condiciones de hidrólisis idénticos (15 mg / g enzima glucano, 48 h, 50 ° C) . "Cuatro componentes comerciales" tiene las proporciones determinadas a partir del experimento se muestra en la fig. 3A.

Discussion

Es ampliamente reconocido que la reducción del costo de las enzimas es importante para el desarrollo de una industria de etanol lignocelulósico económica. Cócteles comerciales disponibles en la actualidad las enzimas son mezclas complejas y mal definido de muchas proteínas (Nagendran et al., 2009), y están adaptados principalmente para el uso de ácido pretratados con el rastrojo de maíz. Con el fin de acelerar el desarrollo de un cóctel de enzimas mejor, varios laboratorios han desarrollado plataformas de alto rendimiento para el descubrimiento y caracterización de enzimas. Los esfuerzos en esta área han incorporado uno o más de las siguientes propiedades también se encuentra en GENPLAT: robot de dispensación de las enzimas y lodos de la biomasa, el diseño estadístico de experimentos, y / o determinación automática de Glc y XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT extiende estos primeros esfuerzos, lo más importante en la complejidad de las mezclas de enzimas que pueden ser analizados desde un máximo de 6 componentes enlos estudios anteriores de más de 16 años en nuestros últimos trabajos (Banerjee et al., 2010c). Otras funciones clave de GENPLAT son el uso de una cámara de mezcla de bolas (depósito de remo) que puede mantener el rastrojo lodos suspendidos durante la distribución, mezcla suave durante la digestión de extremo a extremo de rotación, y la determinación colorimétrica automatizado de Glu y XYL.