Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Summary

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Abstract

Het identificeren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen OL ontwikkeling is niet alleen van cruciaal belang voor het bevorderen van onze kennis van OL biologie, maar heeft ook implicaties voor het begrijpen van de pathogenese van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose (MS). Ontwikkeling van de cellen wordt vaak bestudeerd met primaire celcultuur modellen. Primaire celcultuur vergemakkelijkt de evaluatie van een bepaald celtype door middel van een gecontroleerde omgeving, vrij van de externe variabelen die aanwezig zijn in vivo. Terwijl de OL culturen afkomstig van ratten hebben een grote hoeveelheid inzicht in de OL biologie, heeft vergelijkbare pogingen tot oprichting van OL culturen van muizen is voldaan met grote obstakels. Ontwikkelen van methoden om de cultuur van muizen primaire OLS is noodzakelijk om te profiteren van de beschikbare transgene muis lijnen.

Meerdere methoden voor de extractie van OPC's van knaagdieren weefsel zijn beschreven, variërend van neurosphere afleiding, differentiële hechting zuivering en immunopurification ^1-3. Hoewel veel methoden bieden succes, de meeste vereisen uitgebreide cultuur tijden en / of dure apparatuur / reagentia. Om dit te omzeilen, is zuiverend OPC's van muizen-weefsel met een aanpassing van de methode die oorspronkelijk beschreven door McCarthy & de Vellis ² de voorkeur. Deze methode houdt in het fysiek scheiden van OPC's uit een gemengde cultuur gliale afgeleid van neonatale knaagdieren cortex. Het resultaat is een gezuiverd OPC bevolking die kan worden onderscheiden in een OL-verrijkte cultuur. Deze aanpak is te wijten aan de relatief korte tijd de cultuur en de onnodige vereiste voor groeifactoren of immunopanning antilichamen aantrekkelijk.

Tijdens het verkennen van de mechanismen van OL ontwikkeling in een gezuiverde cultuur is informatief, is het niet de meest fysiologisch relevante omgeving voor de beoordeling van myelineschede formatie. Co-kweken OLS met neuronen zou geven inzicht in de moleculaire onderbouwing reguleren OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Voor veel OL / neuron co-cultuur studies, hebben dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs) bewezen dat het neuron soort keuze. Ze zijn ideaal voor co-cultuur met OLS vanwege hun gemak van de winning, minimale hoeveelheid van vervuilende cellen en de vorming van dichte neurieten bedden. Terwijl studies met rat / muis myelinating xenocultures zijn gepubliceerd ^4-6, een methode voor de afleiding van dergelijke OL / DRGN myelinating co-culturen van de post-natale murine weefsel is niet beschreven. Hier presenteren wij gedetailleerde methoden over hoe je effectief te produceren dergelijke culturen, samen met voorbeelden van de verwachte resultaten. Deze methoden zijn nuttig voor de aanpak van vraagstukken met betrekking tot OL ontwikkeling / myelinating functie en zijn nuttige instrumenten op het gebied van de neurowetenschappen.

Protocol

Ethiek Verklaring

De muizen die in dit werk werden verzorgd volgens de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen. Ethische goedkeuring voor de experimenten werd verkregen van de Universiteit van Ottawa Animal Care Committee onder protocol nummer OGH-119.

1. Dissectie - neonatale muis cortex voor de OPC-extractie

1. Sacrifice P0-P2 muis volgens de institutionele richtlijnen.
2. Ontleden van de hersenen en in een petrischaal met ijskoud MEM (antibioticum-vrij).
3. Breng de schotel naar een dissectie microscoop.
4. Met behulp van een scalpel met de hersenen dorsale kant naar boven, sagittally een ondiepe snede langs de meest mediale rand van elke cortex (figuur 1a). Deze incisie moet alleen door het meningeale laag om de verwijdering te vergemakkelijken.
5. Gebruik fijn getipt tang te pellen uit de hersenvliezen in een zijdelingse manier. Indien zorgvuldig gebeurt, kan deze laag verwijderd worden uit een stuk. Tijdens deze stap, verwijder de olfactorische bollen.
6. Met de hersenen ventrale zijde-up, maak een diepe sagittale snede waar de cortex aan de ventrale gebied van het diencephalon (afb. 1b).
7. Met de hersenen dorsale zijde-up, scheid de cortex van de middenhersenen door nieuwsgierige het weefsel in een mediaal naar lateraal fashion (afb. 1c, c '). Verwijder eventuele resterende hersenvliezen bij deze stap.
8. Dice elk cortex in ongeveer 4 stukken en zachtjes over te dragen aan een 15 ml conische buis met 350 ul van MEM per hersenen van muizen. Houd de buis op ijs totdat alle muizen zijn verwerkt.
9. Herhaal de stappen 1.1-1.8 voor de resterende muizen.

2. Dissociatie van neonatale cortex en het onderhoud van gemengde gliale culturen

Opmerking: De introductie van bellen in de cel suspensie moet worden vermeden tijdens de volgende stappen.

1. Voeg de 15 ml conische buis met het vers opengesneden hersenen om een ​​37 ° C waterbad gedurende 3 minuten.
2. Overdracht hersenen om een ​​steriele weefselkweek kap.
3. Voorzichtig gaan in blokjes gesneden cortex door middel van een P1000 pipet tip om kleinere fragmenten te genereren. Stop pipetteren zodra er geen hersenen stuk groot genoeg is om een ​​vlotte doorstroming van de schorsing door de pipetpunt verstoren.
4. Voeg 75 ul van OPC papaïne oplossing per hersenen in de conische buis. De OPC papaïne oplossing moet worden voorverwarmd bij 37 ° C gedurende 20 minuten voorafgaand aan gebruik.
5. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 20 minuten. Ongeveer elke 2 minuten, voorzichtig omkeren van de buis om weefsel aggregatie te voorkomen. Gedurende deze tijd, voeg 5 ml van de gemengde gliale cultuur media aan elke poly-L-lysine (PLL) coating (1 mg / ml) T25 fles (een fles per muis hersenen), en plaats in een 37 ° C weefselkweek incubator op 8,5% CO _2.
6. Na 20 min, terug het weefsel suspensie aan de steriele kap en voeg 2 ml van de gemengde gliale cultuur media per hersenen naar de buis. Laat zitten voor 10 min bij kamertemperatuur tot inactivatie van de OPC papaïne oplossing mogelijk te maken.
7. Aliquot het weefsel schorsing in 5 ml plastic buizen. Het aantal buizen moet overeenkomen met het aantal ontleed hersenen, wat resulteert in ongeveer 2,5 ml per buis.
8. Met behulp van een steriele vlam gepolijst glas Pasteur pipet voorzichtig vermaal het weefsel in elke buis. Vermaal eerst langzaam en geleidelijk te verhogen snelheid als stukken los. Vermaal circa 10-15 keer, maar dit aantal kan variëren, afhankelijk van de effectiviteit van de spijsvertering.

Opmerking: Onder-tritureren zal resulteren in een slechte dissociatie van het weefsel, terwijl de over-tritureren zal een negatieve impact op de levensvatbaarheid van de cellen. Het is belangrijk om niet bubbels te introduceren in de oplossing, omdat dit ernstige gevolgen voor levensvatbaarheid van de cellen.

9. Zodra er geen zichtbare weefsel klonten die nog in de opschorting, over te dragen aan een 50 ml conische buis met 4 ml van de gemengde gliale cultuur media per hersenen (dat wil zeggen, 4 hersenen = 16 ml gemengde gliale cultuur media).
10. Keer de 50 ml conische buis en herhaal voor de resterende 5 ml buizen.
11. Aliquot de gepoolde celsuspensie in 15 ml conische buizen (ongeveer 6,5 ml per 15 mL buis). Het aantal van 15 ml buizen moeten overeenkomen met het aantal ontleed hersenen.
12. Centrifugeer de buizen op 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 minuten.
13. Zorgvuldig aspireren het supernatans en voeg 1 ml warm gemengde gliale voedingsbodems voor elke 15 ml conische buis.
14. Langzaam resuspendeer de pellet met een P1000 pipet tip, zorg dat u bubbels te introduceren. Voeg de celsuspensie van elke buis naar een pre-evenwicht PLL-gecoate T25 fles, waardoor het totale volume van de cultuur media tot 6 ml.
15. Plaats de kolven in een weefselkweek incubator voor 3-4 uur om de cellen te hechten aan de PLL substraat. Voer een volledige media veranderen door pipetteren uit de media, en het toevoegen van 6 ml vers gemengde gliale cultuur media aan de kolven. Deze stap verwijdert een groot deel van het puinveroorzaakt door de trituratie, en bevordert de cultuur levensvatbaarheid. Als OL / DRGN co-culturen zijn gewenst, wordt verwezen naar paragraaf 3 van dit protocol.
16. Na 3 dagen van de cultuur, het uitvoeren van een 2 / 3 media wijzigen door het verwijderen van 4 ml van media, en het vervangen met 4 ml verse gemengde gliale cultuur media. Op dit punt moet een astrocyten monolaag te vormen op basis van de kolven.
17. Op dag 6, voer dan een andere 2 / 3 media veranderen en de kolven te vullen met een uiteindelijke concentratie van 5 ug / ml insuline. Op dit punt moet een astrocyten monolaag duidelijk zichtbaar, op de top van die OPC's zullen worden prolifererende.

3. DRGN isolatie

Opmerking: Voor de productie van OL / DRGNs co-culturen, DRGNs te worden vastgesteld op de dag na gemengde gliale cultuur generatie. Beide cultuur types zijn onafhankelijk van elkaar gegroeid, en samen na 9-10 dagen.

1. Sacrifice P5-P10 muis volgens de institutionele richtlijnen.
2. Pak de wervelkolom, en overbrengen in een schone petrischaal.
3. Trim weg zo veel spier-en bot van de wervelkolom als mogelijk (afb. 1d, d '), omdat dit de ontleding van de achterwortelganglia (DRG) te vergemakkelijken.
4. Breng de bijgesneden rug om een ​​nieuwe petrischaal buikzijde-up. Met behulp van dissectie schaar en het starten van caudaal, snijd mediaal door de wervelkolom in een longitudinale manier.
5. Gebruik van twee paar tang voorzichtig los te wrikken opent aan de wervelkolom en het ruggenmerg bloot te leggen.
6. DRG's kan worden gevonden onder en lateraal van het ruggenmerg. Met behulp van fijne getipt tang, verwijder voorzichtig de DRG's terwijl het vermijden van schade aan de ganglia (afb. 1e).
7. Breng de verwijderde DRG's te gebufferde zoutoplossing ijskoud Hank's (HBSS, antibiotica-vrij) in een nieuwe petrischaal. De dissector dient te streven naar 40 DRG's per muis (afb. 1f) extract.
8. Zodra de DRG's zijn uitgepakt, trim de DRG's van een te lange wortels (afb. 1 g, g ') aan de introductie van verontreinigende cellen in de cultuur (gliacellen, fibroblasten) te minimaliseren.
9. Overdracht van de DRG's met een 1,5 ml centrifuge buisje met 500 pL ijskoude HBSS.
10. Centrifugeer bij 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet de DRG's.
11. Breng de centrifuge buizen aan een steriele cultuur kap en verwijder het HBSS uit de buizen.
12. Voeg 500 ul van voorverwarmde (20 min bij 37 ° C) DRG papaïne oplossing, en de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten incuberen. Omkeren van de buizen om de 2 minuten om weefsel aggregatie te voorkomen.
13. Herhaal stap 3.10.
14. Verwijder de DRG papaïne oplossing en voeg 500 ul van de voorverwarmde (20 min bij 37 ° C) Collagenase Een oplossing. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 10 min, om te keren om de 2 minuten.
15. Herhaal stap 3.10.
16. Verwijder supernatant en voeg 1 ml DRGN media. Omgekeerde buis een paar keer.
17. Herhaal stap 3.10.
18. Herhaal stap 3.16.
19. Coat een steriele vlam gepolijst glas Pasteur pipet met bovine serum albumine (BSA) door pipetteren een oplossing van 0,25% BSA in HBSS meerdere malen. De coating met BSA-oplossing zal voorkomen dat de DRG's van zich te houden aan de wanden van de glazen pipet.
20. Vermaal het DRG's met de BSA-gecoate pipet eerst zachtjes, en met toenemende intensiteit eens klompen te beginnen dissociëren. Vermaal circa 10-15 keer, maar dit aantal is afhankelijk van de mate van de spijsvertering, en het aantal DRG's per buis.
21. Zodra dissociatie is bereikt, gaan de suspensie door een 50 um filter in een steriele petrischaal met 7 ml DRGN media. Filtratie kan elimineren veel van het puin van de celsuspensie, maar deze stap is niet kritisch.
22. Incubeer de petrischaal op 8,5% CO ₂ ongeveer 1.25 uur.
23. Vacht diverse 12 mm dekglaasjes met LN2 (10 ug / ml in PBS) in een 24-well schotel gedurende deze incubatietijd.
24. Zodra de incubatie is voltooid, acht de petrischaal onder helder veld. DRGNs worden geïdentificeerd als grote body, fase donkere cellen. Schud de petrischaal voorzichtig aan een gehandeld DRGNs lift.

Opmerking: Veel contaminerende cellen zullen sterk hebben gehandeld op grond van de petrischaal, zodat verrijken van uw celsuspensie voor DRGNs.

25. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis. Voorzichtig spoelen de schotel met 4 ml DRGN media om eventueel resterende DRGNs te verzamelen. Breng de extra 4 ml tot de conische buis.
26. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1200 rpm (~ 300 g).
27. Aspireren supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui van verse DRGN media.
28. Bereken het aantal leverde DRGNs met behulp van een hemocytometer. Zorg ervoor dat u alleen tellen de DRGNs, en niet voor andere celtypes. DRGNs kunnen worden geïdentificeerd door hun grote bolvormige cellichamen.
29. Seed 30.000-50.000 DRGNs aan elke LN2-gecoate dekglaasje in 1 ml DRGN media, en plaats in een 37 ° C weefselkweek incubator op 8,5% CO ₂ 's nachts.
30. De volgende ochtend, een volledige media veranderen door het vervangen van de DRGNmedia met OL media (minus CNTF) met een uiteindelijke concentratie van 1% Pen / Strep en 10 uM FuDR.
31. Op dag 3 en 5, voert u een 3 / 4 media veranderen met dezelfde media als in stap 3.30.
32. Op dag 7, een volledige media te veranderen met OL media (minus CNTF, Pen / Strep, FuDR).
33. Op dag 9, moet de DRGNs hebben gevormd een uitgebreide neurieten bed, en zijn nu klaar om te worden samen gekweekt met OPCs.

4. Zuivering van OPC's uit gemengde gliale culturen voor de oprichting van OL-verrijkte culturen of OL / DRGN co-culturen

1. Op dag 9 van de gemengde gliale cultuur, overdracht van de kolven om een rondschudapparaat in een 5% CO ₂ weefselkweek incubator. Plaats de kolven op de top van lege T25 flessen aan een warmte gegenereerd uit de schudapparaat voorkomen dat schadelijke gevolgen voor het gemengd gliale culturen. Laat de culturen om dit nieuwe incubator equilibreren gedurende 1 uur.
2. Zodra de kolven zijn evenwicht, schudden de kolven bij 50 rpm gedurende 45 minuten. Het doel van deze shake is het verwijderen van alle losse aanhanger vervuilende cellen van de monolaag.
3. Verhuizen cellen om een ​​weefselkweek kap en verwijder alle media van de kolven. Vervangen met 4 ml verse gemengde gliale cultuur media, aangevuld met 5 ug / ml insuline.
4. Plaats de kolven weer op de shaker, om de temperatuur voor ongeveer 3 uur.
5. Zodra de kolven zijn evenwicht, stevig te bevestigen ze aan de orbitale shaker en schud de kolven gedurende ongeveer 16 uur bij 220 rpm ('s nachts).
6. De volgende ochtend, als OLS worden gekweekt in de afwezigheid van DRGNs (dat wil zeggen, OL-verrijkte cultuur), laag aantal steriele 12 mm dekglaasjes met LN2 (10 ug / ml in PBS) gedurende 1 uur. Overdracht van de dekglaasjes tot 24-well gerechten, wassen met PBS, gevolgd door een OL media wassen. Voeg 1 mL van OL media aan elk putje en evenwicht op 8,5% CO _2.
7. Equilibreren 10 cm weefselkweek gerechten op 5% CO ₂ gedurende 30 minuten. Een gerecht is vereist voor elke 2 flessen. Deze zullen worden gebruikt voor de differentiële adhesie-verrijking van de geschorste OPCs.
8. Zodra de 30 min equilibreren periode voorbij is, overdracht van de media uit de geschud kolven aan de gerechten. Elk gerecht moeten krijgen media van twee flessen, gelijk aan ongeveer 8 ml celsuspensie per 10 cm schotel.
9. Incubeer de gerechten bij 5% CO ₂ gedurende 30 minuten, terwijl een zacht duwtje in de 15 min. te markeren. Dit duwtje zal helpen voorkomen dat OPC's van zich te houden aan de 10 cm schotel.
10. Zodra de incubatietijd is voltooid, gaan de gerechten onder helder veld. OPC's zijn geïdentificeerd als kleine cel groepjes, meestal van 3-5 cellen, maar soms vormen grote aggregaten die lijkt op neurospheres. Veel niet-OL lijn cellen moeten stevig worden gehandeld op grond van de onderkant van de plaat. Zwenk de platen op een losjes aangehouden OPCs los, en breng de celsuspensie van elke plaat in een 15 ml conische buis.
11. Centrifugeer bij 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 minuten.
12. Resuspendeer de pellet in 1 ml van OL media met een P1000 pipetpunt, gevolgd door resuspensie met een P200 pipetpunt.
13. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
14. Voor verrijkte-OL culturen, zaad 25.000 - 50.000 OPC's voor elke 12 mm LN2-gecoate dekglaasje in een eindvolume van 1 ml OL media.
15. Voor OL / DRGN co-culturen, een volledige OL media (minus CNTF) te wijzigen uit te voeren op de DRGNs van sectie [3], en zachtjes toe te voegen 50.000 cellen van de OPC-verrijkte celsuspensie. Zorg ervoor dat de DRGN neurieten bed niet te verstoren tijdens de toevoeging van OPCs.
16. Plaats culturen in een 37 ° C incubator op 8,5% CO _2, en voorkoming van de verwijdering tot fixatie. Murine OPCs zijn gevoelig voor veranderingen in pH, en verwijdering uit de incubator zal veranderen de pH van de OL media. Ook te worden opgemerkt, zal de toevoeging van dH ₂ O naar de lege waterputten rond de celculturen te voorkomen dat de verdamping van de cultuur media, dus het minimaliseren van fluctuaties in de concentraties van opgeloste stoffen in de OL media. Dit zal zorgen voor een meer consistente omgeving voor de OPCs.

5. Verwerking van culturen voor immunofluorescentie microscopie

1. Fix culturen met 100% methanol bij -20 ° C gedurende 10 min, of 3% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
2. Permeabilize coverslips met 0,1% Triton-X-100 gedurende 10 min, wassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en blokkeren voor een uur in 10% geit serum.
3. Incubeer coverslips met primaire antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing overnacht bij 4 ° C.
4. Was coverslips drie keer met PBS, en incubeer met Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen (Invitrogen) verdund in het blokkeren oplossing gedurende 45 minuten.
5. Achtergrondkleuring met 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en was coverslips meerdere malen met PBS.
6. Mount coverslips in DAKO fluorescerende montage medium.
7. Analyseren van dia's via immunofluorescentie microscopie. In dit protocol werden dia's geanalyseerd met ofwel een Zeiss Axiovert 200M omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een Zeiss LSM 510 META laser scanning confocale microscoop.

6. Hele cel proteïne extractie uit OL-verrijkte culturen

1. Verwijder de 24-well culturen uit incubator en koel op ijs gedurende 3 minuten.
2. Verwijder voorzichtig de media, en voeg 10-20 ul lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% Triton-X-100, met 0,1% pepstatine, aprotinine, PMSF, leupeptin, natrium orthovanadate) aan elk putje (een minimum van 8 wells per monster wordt gesuggereerd).
3. Schraap putten met behulp van een breed boring P1000 pipetpunt, en breng het lysaat naar een 1,5 ml centrifugebuis.
4. Passeren het lysaat door middel van een 30 ½-gauge spuit ongeveer 15 keer, en zet op ijs gedurende 30 minuten.
5. Centrifugebuis bij 14.000 rpm (~ 20.000 g) gedurende 15 min bij 4 ° C.
6. Overdracht supernatans om nieuwe centrifuge buizen, en bewaar bij -80 ° C.

7. SDS-PAGE analyse van verrijkte-OL cultuur eiwit

1. Resolve 30 ug eiwit per monster in het verminderen van buffer door SDS-PAGE op standaard 12% poly-acrylamide gels.
2. Semi-droge overdracht gels op PVDF-membranen.
3. Block membranen voor 1 uur in 5% magere melkpoeder in TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
4. Incubeer membranen met primaire antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing gedurende 1 uur.
5. Was membranen drie keer met TBST gedurende 10 minuten.
6. Incubeer de membranen met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 45 minuten in het blokkeren van oplossing.
7. Was membranen meerdere keren met TBST en incubeer met Amersham ECL Plus western blotting detectie reagens (GE Healthcare) gedurende 5 minuten.
8. Detecteren eiwit banden met standaard wetenschappelijke beeldvorming film.

8. Representatieve resultaten:

In dit protocol zijn OPC's uitgebreid op een astrocyten monolaag binnen een gemengde glia-cultuur. Dit gemengde gliale cultuur is afgeleid van P0-P2 neonatale muis cortex. Op dag een in vitro (div1), de gemengde gliale cultuur bevat cellen met verschillende morfologie zoals gezien door de fase-contrast-microscopie (afb. 2a). Op DIV3, een astrocyten monolaag begint te vormen op basis van de kolf, en bij DIV8, OPC's kan duidelijk worden waargenomen op de monolaag oppervlak. Op DIV9 zijn de prolifererende OPCs bereikt voldoende dichtheid te worden gezuiverd door 's nachts met hoge snelheid orbital schudden. Zodra het zuiveringsproces is voltooid, is het resultaat een OPC-verrijkte celpopulatie. Op div1-post zuivering, OPC's hebben eenvoudige morfologie, uitbreiding van enkele processen (afb. 2b). Op DIV3 na zuivering, hebben cellen een uitgebreid complex meshwork van processen, die doen denken aan onvolwassen OLS. Op DIV6 na zuivering, hebben het gezuiverde OLS afgeplat en geprojecteerd brochure-achtige membraan structuren. Deze morfologische ontwikkeling is typerend voor de in vitro rijping van OLS.

Immunofluorescentie microscopie geeft aan dat het gezuiverde cellen van de OL-stam (afb. 3a). Geplaatste OPC's in eerste instantie te uiten chondroïtinesulfaat proteoglycanen (NG2), en zich ontwikkelen tot myeline-geassocieerd glycoproteïne (MAG) positief onvolwassen OLS binnen drie dagen na zaaien (afb. 3b). Op DIV6 veel OLS express myeline basic protein (MBP), en bezitten typische volwassen OL morfologie. Procent OL-lijn cellen werden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen aan de zuiverheid van de OL-verrijkte culturen (afb. 3c) te bepalen. Op div1 na zuivering, culturen zijn 50 ± 14% NG2 ^{+ ve} OPCs, zonder MAG ^{+ ve} of MBP ^{+ ve} OLS. Dit geeft het gezuiverde OL-lijn cellen in het voorstadium te zaaien tijd, met een verwaarloosbare aantallen van gedifferentieerde OLS. Op DIV3, veel OLS hebben onderscheiden in MAG ^{+ ve-cellen} (24 ± 5,9%) terwijl sommige behoudt de voorloper fenotype, en blijven NG2 + (13 ± 8,0%). Op DIV3, zijn een klein deel van de MAG ^{+ ve} cellen (3,2 +1,2%) ook uiten MBP. Op DIV6, 20 ± 5,9% van het OLS zijn MAG ^{+ ve,} terwijl 12 ± 7,3% aanhouden als NG2 ^{+ ve} OPCs. Daarnaast, 21 ± 9,3% van de cellen in de cultuur zijn MBP ^{+ ve} OLS op dit tijdstip. SDS-PAGE analyse toont de gesorteerde expressie van 2'3'-cyclische nucleotide-3'-fosfodiësterase (CNP) en MBP over de periode van 6 dagen cultuur, hetgeen opnieuw aantoont vermogen van OPCs in de cultuur aan terminale differentiëren tot rijpe OLS (Fig 3d ). Tezamen zijn deze gegevens stelt deze methode als een middel van het produceren van een OL-verrijkte cultuur systeem dat geschikt is voor de studie van OL rijping van OPCs.

Dit protocol beschrijft ook methoden om OL / DRGN co-culturen met behulp van muis-only weefsel bronnen kan worden vastgesteld. Echter, om de co-cultuur te produceren, moet DRGNs eerst alleen worden gekweekt om een ​​adequaat netwerk van neurieten produceren. Deze post-natale murine neuron culturen worden gekweekt voor 9 dagen in een lage serum media met 10 uM FuDR aanvulling om de verspreiding van verontreinigende fibroblasten en gl te voorkomen ial cellen. In de loop van negen dagen in vitro, geïsoleerde DRGNs produceren een dichte neurieten bed (afb. 4a). Deze neurieten bed is immunopositive voor de neuronale markers neurofilament 200 (NF) en Tuj1 (afb. 4b). Op dit punt kan gezuiverd OPC's worden toegevoegd aan de neurieten bedden en gekweekt voor een extra 6 dagen te produceren myelinating co-culturen.

Op DIV6 van OL / DRGN co-cultuur, veel MBP ^{+ ve} OLS kan worden waargenomen bij de NF ^{+ ve} DRGN neurieten (afb. 5a). Bij nader onderzoek zijn OLS blijkt om contact te maken met tal van DRGN neurieten, vaak ensheathing ze met een MBP ^{+ ve} membraan (figuur 5b, c).

Figuur 1. Dissectie microscoop beelden van bepaalde aspecten van neonatale muis cortex en DRG isolatie. (A) Dorsaal uitzicht op een vers gewonnen neonatale hersenen van muizen. De gestippelde lijnen geven het gebied waar incisies moeten worden geleverd om het verwijderen van de meningeale laag mogelijk te maken. (B) Ventraal uitzicht van de hersenen, stippellijnen het gebied waar de cortex aan de ventrale diencephalon te geven. Diepe insnijdingen worden gemaakt langs de stippellijn om het isolement van de cortex hulp. (C-c '), visuele voorstelling van hoe de cortex weg te wrikken van de rest van de hersenen. (D) Een vers geïsoleerde P5-P10 muis rug voorafgaand aan de weg te trimmen overtollige spier-en bot (d '). (e) Locatie van DRG's in de wervelkolom. (f) Het geschatte aantal DRG's die moeten worden geïsoleerd van een muis. (g) een DRG met lange wortels die nodig trimmen voorafgaand aan de enzymatische spijsvertering. De gestippelde lijn geeft de regio waar de wortels moeten worden ontdaan. (G ') DRG na de root-trimmen.

Figuur 2. OPC's zijn uitgebreid in een gemengde gliale cultuur, gezuiverd, en vervolgens gedifferentieerd als een OL-verrijkte cultuur. (A) Fase contrast beelden van mixed gliale culturen in verschillende stadia van ontwikkeling. Op div1, cellen blijken ronde met weinig afgeplatte cellen. Stratificatie van gemengde gliale cultuur begint bij DIV3, waar astrocyten vormen een uniform monolaag aan de voet van de kolf, waarop OPCs vermenigvuldigen. Veel OPC's worden waargenomen bij DIV8 (pijlen) gehandeld op grond van het oppervlak van de astrocyte monolaag. (B) Als gezuiverd uit de gemengde gliale cultuur, div1 OPCs verlengd met nog een paar processen. Op DIV3, hebben cellen uitgebreid vele processen, die doet denken aan intermediaire fase OLS. Op DIV6, afgeplatte OLS (asterisk) lijken te hebben geproduceerd vliezig vel (stippellijn). Schaal van bars, 50 urn.

Figuur 3. Karakterisering van de OL-verrijkte cultuur. (A) confocale beelden van geïsoleerd OLS in verschillende stadia van ontwikkeling. NG2 ^{+ ve} OPC's hebben een eenvoudige morfologie, terwijl de MAG ^{+ ve} OLS bezitten meerdere arborous processen. MBP ^{+ ve} OLS hebben uitgebreid membraneuze myeline-achtige platen. Schaalbalk, 50 pm. (B) Gezuiverd OL-lijn cellen ontstaan ​​als OPCs, en differentiëren in MAG ^{+ ve,} MBP ^{+ ve} OLS op 6 DIV. Op div1, alle OPCs zijn NG2 ^{+ ve,} terwijl niemand zijn MAG ^{+ ve} of MBP ^{+ ve.} Op DIV3, MAG ^{+ ve} en weinig MBP ^{+ ve} OLS zijn nu duidelijk. De meerderheid van de OLS zijn MAG en MBP ^{+ ve} op DIV6, met weinig overgebleven NG2 ^{+ ve} OPCs. Schaal bar, 100 micrometer. (C) Gemiddelde waarden ± SD van het percentage OL-lijn cellen in verschillende stadia van ontwikkeling meer dan 6 DIV. Op div1, alle OL-lijn cellen zijn NG2 ^{+ ve,} goed voor 50 ± 14% van het totaal cellen in de cultuur. Op DIV3 en DIV6, OL-lijn cellen respectievelijk verantwoordelijk voor 36 ± 6,8% en 32 ± 8,4% van het totaal cellen, bestaande uit verschillende verhoudingen van NG2 ^{+ ve,} MAG ^{+ ve} en MBP ^{+ ve} OLS. (D) SDS-PAGE uitgevoerd op de eiwitten die afkomstig zijn verrijkt OL-culturen waaruit de gesorteerde expressie van OL-markers CNP en MBP over de 6 DIV cultuur periode.

Figuur 4. Karakterisering van de DRGN cultuur pre-OPC zaaien. (A) Fase contrast beelden van DRGNs over de 9 DIV cultuur periode van pre-OPC zaaien. DRGNs ontstaan ​​als grote-bodied cellen met enkele processen, en produceren een steeds complexer neurieten netwerk. Schaal bar, 100 micrometer. (B) confocale beelden van DRGN culturen vastgesteld op DIV9 (pre-OPC seeding) en gekleurd voor neuron-specifieke merkers Tuj1 en NF200. DRGNs hebben een neurieten netwerk waarop OPC's kunnen worden gezaaid voor de productie van OL / DRGN myelinating co-culturen. Schaalbalk, 50 urn.

ENT ">
Figuur 5. OLS co-gekweekt met DRGNs resulteren in OL-gemedieerde verpakking van DRGN neurieten met MBP ^{+ ve} membraan. (A) Een 4-veld confocale image montage van een DIV6 OL / DRGN co-cultuur. Veel MBP ^{+ ve} OLS kan worden gezien in wisselwerking met de onderliggende DRGN neurieten bed. Schaal bar, 100 micrometer. (B) Een vergroot confocale uitzicht op MBP ^{+ ve} OLS-wrapping meerdere DRGN neurieten. Schaalbalk, 50 pm. (C) Digitale vergroting van het gebied aangeduid in (b) wanneer een DRGN neurieten wordt omwikkeld met OL membraan. Schaalbalk, 25 pm.

Discussion

Dit rapport beschrijft een methode voor het isoleren van muizen-OPC's voor differentiatie in de OL-verrijkte culturen of OL / DRGN co-culturen. Wanneer alleen gekweekt, de OPCs differentiëren tot MBP ^{+ ve} OLS, het produceren van myeline-achtige membraneuze vellen. Wanneer toegevoegd aan neurieten bedden DRGN, OLS omhullen de DRGN neurieten met MBP ^{+ ve} membraan. Dit biedt voordelen voor de onderzoek naar de complexe onderbouwing voor OL-gemedieerde axonale ensheathment.

Terwijl van grote waarde, de oprichting van dergelijke culturen is technisch gezien een uitdaging. In het bijzonder veeleisende aspecten omvatten een efficiënte spijsvertering weefsel / dissociatie, het onderhoud van een evenwichtige cultuur media pH en DRGN media veranderingen. Het is belangrijk om te oordelen dat de lengte van de spijsvertering, de hoeveelheid weefsel worden verteerd en de hoeveelheid van fijnwrijving invloed op de effectiviteit en eindresultaat van het weefsel dissociatie. Het is niet ongebruikelijk voor ervaren onderzoekers om een ​​lage cellulaire rendement te verkrijgen uit gedissocieerd zenuwstelsel weefsels. Daarnaast, muizen OPC's zijn vaak gevoelig voor veranderingen in de pH van de cultuur media, met name onder alkalische omstandigheden. Het onderhoud van culturen op 8,5% CO ₂ heeft tot doel dit te voorkomen, omdat OPC's lijken beter te licht zure omstandigheden tolereren meer dan basic. Met betrekking tot het voeden DRGNs-, media-aanpassingen moeten snel worden uitgevoerd als om niet de neuronen uitdrogen, moet echter worden voorzichtig om niet de zich ontwikkelende neurieten bed verstoren. Abrupte media veranderingen kunnen verjagen de neurieten bed van het substraat, en waarschijnlijk resulteren in de volledige dissociatie van het dekglaasje.

De potentiële verdienste van dit model systeem overschaduwt sterk zijn technisch veeleisend karakter. Een voordeel van dit systeem is het gebruik van postnatale muizen voor celkweek afleiding, omzeilen de noodzaak om de voedsters te offeren aan embryonaal weefsel oogst. Een ander voordeel is het ontbreken van een vereiste voor de groei factoren (SBO) voor de uitbreiding van OPCs. Gemengde gliale culturen zorgen voor een omgeving die de verspreiding van OPCs, waarschijnlijk door de aanwezigheid van astrocyte afgeleide trofische factoren ondersteunt. Andere methoden, zoals afleiding via neurospheres ^7,8, vertrouwen op de mitogene eigenschappen van GFS, zoals basic fibroblast groeifactor (bFGF), epidermale groeifactor (EGF) en platelet-derived growth factor (PDGF) voor OPC expansie. Op dezelfde manier, met behulp van postnatale (P5-10) muizen voor DRGNs vermijdt de eis van aanvulling van de cultuur media met een zenuw groeifactor (NGF), een neurotrofe factor die nodig is voor de in vitro embryonale overleving van DRGNs ^{9, 10.} Het is van belang om te voorkomen dat met behulp van NGF als het negatief van invloed op de capaciteit van myelinating OLS bij gekweekt met DRGNs ^4. Vermijden van het gebruik van de GF-aangevuld met de media ook economische voordelen heeft, omdat deze reagentia worden kostbaar bij gebruik op grote schaal.

Misschien wel het belangrijkste voordeel van deze cultuur model is de afleiding van de muis alleen weefsels, en zo de kansen af ​​te leiden zowel de OPC's en DRGNs uit de grote verscheidenheid van transgene muis lijnen. Dit maakt voor de studie van zowel DRGN en / of OPC-specifieke eigenschappen die myelinisatie regeren. Dit zal vooral van belang voor het ophelderen van de receptor / ligand-interacties reguleren van OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Met al deze techniek is van grote waarde met betrekking tot neurowetenschappelijk onderzoek als gevolg van de applicaties naar het begrijpen van de moleculaire signalen die ten grondslag liggen myelinisatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Multicell	319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112
Minimum Essential Media (MEM)	GIBCO, by Life Technologies	12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO, by Life Technologies	10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Human merosin purified protein (LN2)	EMD Millipore	CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF)	PeproTech Inc	450-50
L-thyroxine	Biochemika	89430
Holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T0665
B27 supplement	GIBCO, by Life Technologies	0080085-SA
Bovine insulin	Sigma-Aldrich	I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	I6634
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR)	Sigma-Aldrich	F0503
Papain solution	Worthington Biochemical	LS003126
DNaseI	Roche Group	1010159001
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
24-well tissue culture dishes	Cellstar	662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap	Corning	430639
10 cm tissue culture dishes	Corning	430167
10 cm petri dish	Fisher Scientific	0875713
Collagenase A	Roche Group	103578
CellTrics 50 μm filter (optional)	PARTEC	04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody	AbD Serotec	MCA409S
NG2 antibody	EMD Millipore	AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody	EMD Millipore	MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody	Covance	SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody	Fitzgerald	10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody	Sigma-Aldrich	N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody	EMD Millipore	MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Bio-Rad	170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Media Recipes 100X OL-Supplement* Ingredient Amount to add DMEM 100 mL BSA 1.02 g Progesterone 0.6 mg Putrescine 161 mg Sodium Selenite 0.05 mg 3,3',5-Triiodo-L-thyronine 4 mg *Store at -80 °C in 250 μL aliquots OL media Ingredient Amount to add DMEM 23.75 mL 100X OL-Supplement 250 μL Bovine insulin (from 1 mg/mL stock) 125 μL GlutaMAX 250 μL Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock) 37.5 μL B27 Supplement 500 μL FBS 125 μL CNTF (from 50 ng/μL stock) 25 μL Mixed glial culture media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (0.33% from stock) 33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin GlutaMAX 1% DRGN media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (1% from stock) 100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin Digestion Solution Recipes: OPC papain solution (made up in MEM) Ingredient Final concentration Papain solution 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DNaseI 60 μg/mL DRG papain solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Papain 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DRG Collagenase A solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Collagenase A 4 mg/mL