Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3328
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

و

Abstract

مع التقدم في أبحاث الجينوم في العقد الماضي ، شهدت العديد من الدراسات بيولوجيا النبات على نطاق واسع تقديم التحليلات الكمية في التعبير الجيني. ويجري استخدام ميكروأري وتسلسل الجيل المقبل النهج للتحقيق في عمليات الاستجابة التنموية والفسيولوجية والإجهاد ، وتشريح اللاجينية والصغيرة مسارات الحمض النووي الريبي ، وبناء شبكات الجينات التنظيمية 1-3 الكبيرة. في حين أن هذه التقنيات تسهيل تحليل الجينات في وقت واحد من مجموعات كبيرة ، لأنها توفر عادة القرار محدود جدا من التغييرات spatiotemporal التعبير الجيني. ويمكن التغلب على هذا القيد جزئيا باستخدام أسلوب التنميط بالتزامن مع lasermicrodissection أو مضان تنشيط الخلايا فرز 4-7. ومع ذلك ، ولكي نفهم تماما الدور البيولوجي للجين ، ومعرفة نمط spatiotemporal التعبير في القرار الخلوية الأساسية. ولا سيما عند دراسة تطوير أو آثار بيئية STIيمكن المولى والمسوخ تحليل مفصل لنمط التعبير الجين أصبح أساسيا. على سبيل المثال ، يمكن أن الاختلافات الكمية خفية في مستويات التعبير عن الجينات التنظيمية الرئيسية تؤدي إلى الظواهر الدرامية عندما يرتبط مع الخسارة أو الربح التعبير في أنواع معينة من الخلايا.

وتستخدم عادة عدة طرق لفحص تفصيلي لأنماط التعبير الجيني. هو واحد من خلال تحليل خطوط مراسل المعدلة وراثيا. ويمكن هذا التحليل ، ومع ذلك ، أصبحت تستغرق وقتا طويلا عند تحليل جينات متعددة أو يعملون في مصانع لتحويل المتمردة. علاوة على ذلك ، عادة ما هو مطلوب التحقق المستقل للتأكد من أن نمط التعبير الذي يحاكي التحوير من الجينات المحلية. المناعى توطين البروتين أو مرنا في التهجين الموضع الحالي بدائل سريعة نسبيا لرؤية مباشرة في التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة. هذا الأخير لديه ميزة واضحة أنه يمكن أن يكون بسهولة شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على أي من الجينات الفائدة. التهجين في الموقع تتيح الكشف عن mRNAs المستهدفة في الخلايا عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي لمكافحة الشعور المسمى التحقيق التي حصلت عليها في المختبر النسخ من الجينات في المصالح.

نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول للتوطين في الوضع الطبيعي في التعبير الجيني في النباتات التي هي حساسية عالية ومحددة. هو الأمثل للاستخدام مع بارافورمالدهيد الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من المقاطع ، والتي تعطي حماية ممتازة من الأنسجة ، وتحقيقات DIG ذات العلامات التي تصور من قبل المناعية للكشف عن والفوسفاتيز القلوية رد الفعل اللونية. وقد تم بنجاح تطبيق هذا البروتوكول إلى عدد من الانسجة من طائفة واسعة من الأنواع النباتية ، ويمكن استخدامها لتحليل التعبير عن mRNAs فضلا الرناوات الصغيرة 8-14.

Protocol

1. إعداد نموذج

ملاحظة : جميع الخطوات حتى وبما في ذلك التهجين خطوة حساسة للنشاط ريبونوكلياز. ولذلك فمن الضروري العمل في ظروف نظيفة. كما أنه من الشائع جدا لجعل كل الحلول ريبونوكلياز خالية DEPC باستخدام المياه المعالجة والأواني الزجاجية يخبز في 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل. غالبا ما يتم تنظيف الحاويات البلاستيكية من خلال المعاملة مع هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك ، فإن أيا من هذه الاحتياطات الضرورية ونحن عادة استخدام العادية النظيفة milliQ H 2 O للجميع الحلول. نحن لا تبقي منفصلة الكواشف ، وصناديق والأواني الزجاجية لالتهجين في الموقع وتخزين هذه في خزانة نظيفة.

  1. عينة التثبيت
    1. اليوم 1 : إعداد الطازجة 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) مثبت. ل 500 مل ، 400 مل دافئ 1X PBS (كلوريد الصوديوم 130 ملم و 7 ملم نا 2 هبو 4 ، 3 مم ناه 2 ص 4 pH7.0) إلى 60 درجة مئوية ، وبتذويب كريات هيدروكسيد الصوديوم. في غطاء الدخان ، إضافة 20 غراما من paraformaldehyدي ومزيج دقيق حتى المنحل. وضع الحل على الجليد ، وعندما تبرد ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع H 2 SO 4 (1-2 قطرات ل100ML) ثم ضبط حجم إلى 500 مل مع PBS 1X.
      ملاحظة : عدم استخدام حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة حيث سيؤدي ذلك إلى إطلاق أدخنة سامة للغاية. بارافورمالدهيد غير سامة ، ولذلك ينبغي أن يكون هذا الحل أعد غطاء الدخان والتخلص منها بشكل صحيح. أيضا ، يتم تخزين لامتصاص العرق في 4 درجات مئوية ، وينبغي أن يكون اشترى جديدة كل 6-9 أشهر.
    2. عينات الأنسجة الحصاد ووضعها على الفور في 15 مل مثبت PFA جديدة على الجليد في قوارير الزجاج التلألؤ. إذا كان المطلوب تشريح الأنسجة ، من الأفضل القيام بذلك على الجليد في تثبيتي الباردة.
      ملاحظة : من المهم لاستخدام فائض كبير من تثبيتي. النسبة العامة أوصت لاستخدام وحدات التخزين من 10 إلى 1 تثبيتي حجم الأنسجة.
    3. تطبيق فراغ (~ 500 ملم زئبق) للعينات في حين على الجليد. عقد فراغ لمدة 15-20 دقيقة ، وينبغي الافراج عن فقاعات صغيرة من العينةولكن ينبغي ليالي لتثبيتي لم يأت ليغلي. الافراج عن فراغ ببطء ، وتجديد تثبيتي PFA لضمان تثبيتي يبقى في تركيز الحق. كرر هذه الخطوة حتى الأنسجة تغرق بعد الافراج عن فراغ.
      ملاحظة : مطلوب لإصلاح والتثبيت عبر ارتباط جزيئات الحمض النووي الريبي داخل الأنسجة. هذه الخطوة الهامة كمواد ثابتة العائد الضعيف إشارة منخفضة. بعض الأنسجة لا تغرق على الفور لكن معظم ستغرق في نهاية المطاف بين عشية وضحاها. لتحسين عمليات التسلل من تثبيتي ، ويمكن أن يضاف للمنظفات التالية : تريتون يصل إلى 0.1 ٪ و / أو توين تصل إلى 0،1-0،3 ٪. يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك ، الايثانول القائم على مثبتات ، مثل الفورمالدهايد ، الكحول الحمضية حمض (FAA) ، عن الأنسجة التي هي على خلاف ذلك ليس من السهل اختراق 14،15.
    4. استبدال تثبيتي PFA مرة أخرى والحفاظ على قنينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  2. الأنسجة التضمين
    1. يوم 2 : تمهيدي بارد 1X برنامج تلفزيوني وسلسلة الايثانول في 4 درجات مئوية.
    2. شطف عينات التويم لمدة 30 دقيقة في كل برنامج تلفزيوني 1X ، على الجليد.
      ملاحظة : مرة أخرى فمن المستحسن استخدام فائض كبير من كل حل.
    3. يذوى العينات التي أخذها من خلال سلسلة الإيثانول ، على الجليد ، على النحو التالي :
      • 10 ٪ من الإيثانول و 30 دقيقة ،
      • 30 ٪ من الإيثانول و 30 دقيقة ،
      • 50 ٪ من الإيثانول 1 ساعة ،
      • 70 ٪ من الإيثانول 1 ساعة ،
      • 85 ٪ من الإيثانول 1 ساعة ،
      • 95 ٪ 1hour الإيثانول ،
      • 3 تغييرات من الإيثانول بنسبة 100 ٪ عن كل 1hour
    4. في نهاية اليوم ، يحل محل الايثانول بحلول Eosine 0.1 ٪ في الإيثانول بنسبة 100 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. البقع Eosine جدار الخلية مما يجعل عينات أكثر وضوحا خلال دمج وsectioning.
      وقد تم تحسين والأوقات المبينة هنا للكتل 3x3x3 ملم ولكن قد تكون هناك حاجة اكبر لأطول حضانات عينات : مذكرات.
      ويمكن تخزين العينات في الايثانول 70 ٪ في 4 درجة مئوية لعدة أشهر. اليوم 3 : في صباح اليوم التالي ، دافئة العينات إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم استبدل تدريجيا مع الايثانول histoclear على النحو التالي :
      جدول
    5. في نهاية اليوم ، إضافة 1 / 4 حجم Paraplast بلس رقائق ومكان القنينة في فرن 60 درجة مئوية. أيضا ملء كوب مع رقائق Paraplast وتجديد هذا في كثير من الأحيان من أجل أن يكون دائما الشمع المنصهر الطازجة في متناول اليد.
      ملاحظة : درجة حرارة الفرن هو التدفئة مهمة وطويلة من Paraplast أعلى من 60 درجة مئوية يجب تجنبها.
    6. اليوم 4 : تحل تدريجيا محل histoclear مع Paraplast بانتظام عن طريق إضافة المزيد من رقائق البارافين (كل ساعة). في نهاية اليوم ، يصب الخليط بعناية قبالة histoclear / الشمع واستبدالها على الفور مع الشمع المنصهر النقي. ترك العينات عند 60 درجة مئوية خلال الليل.
    7. أيام 5 و 6 : تغيير Paraplast 3 مرات يوميا ، عن كل 4 ساعات ، مع الشمع المنصهر الطازجة حفظ قamples عند 60 درجة مئوية.
      ملاحظة : من الممكن لتغيير الشمع مرة واحدة فقط في اليوم ، ولكن إعداد الأنسجة سيستغرق بضعة ايام اضافية لاستكمال ، والشمع يحتاج إلى تغيير ما لا يقل عن 5 أو 6 مرات. يمكن التسلل من فراغ عينات الأنسجة عند هؤلاء في / و 100 ٪ EtOH أو الشمع في زيادة تحسين عمليات التسلل وتضمينها للأنسجة. وينبغي أن يتم التسلل من فراغ العينات في الشمع عند 60 درجة مئوية.
    8. يوم 7 : تغيير الشمع مرة أخرى. وينبغي الآن رائحة histoclear تكون اختفت تماما ، ويمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من العينات في وقت لاحق من ذلك اليوم.
    9. إعداد لوحة كبيرة في ارتفاع درجة حرارة 60 درجة مئوية يحميها رقائق الألومنيوم.
    10. سوف أسلوب التضمين تختلف تبعا لنوع من الأنسجة لتحليلها. أهم نقطة في هذه الخطوة هو التأكد من أن العينات موجهة بشكل صحيح لsectioning في وقت لاحق. طريقة واحدة هي استخدام قوالب بلاستيكية والخواتم. الاحماء قوالب على لوحة ظاهرة الاحتباس وصب الشمع المنصهر في الجزء السفلي من العفن. نقلعينة الأنسجة في القالب مع ملقط تحسنت وتوجيهه في الموضع المطلوب. وضع حلقة بيضاء على القالب وإضافة الشمع المنصهر إضافية بحيث تتم تغطية الأنسجة تماما. تحرك بحذر القالب من لوحة على مقاعد البدلاء. اسمحوا الشمع يبرد تدريجيا.

هناك احتمال آخر هو لتوزيع جميع العينات في طبق بتري تحتوي على الشمع المنصهر (يجب أن تكون مغطاة بالكامل عينات بواسطة الشمع) بينما كان يعمل على لوحة 60 درجة مئوية حرارة. توجيه العينات مع ملقط الدافئة. في النهاية ، فأغلق على طبق من ذهب. عندما توطد الشمع ، يمكن نقل طبق بتري على مقاعد البدلاء وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية. عندما تصبح مستعدة لsectioning ، يمكن قطع كتل صغيرة تحتوي على عينات الأنسجة من طبق بتري بشفرة تحسنت والتي شنت على صاحب العينة مشراح مع انخفاض اضافي من الشمع المنصهر. السماح لتتصلب نموذج لبضع دقائق قبل sectioning.

ملاحظة : يمكن للكتليتم تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة 1 سنة أو أكثر. للحصول على نصائح مفيدة إضافية على تثبيت الأنسجة والتضمين ، انظر المرجع. 16

2. إعداد التحقيق

  1. استنساخ
    يتم إنشاؤها عادة تحقيقات واحد أو أكثر مناطق محددة من الجينات في المصالح. ينبغي استبعاد متواليات تكرارية للغاية من التحقيق ، ولكن تسلسل المقابلة لبروتين الحفظ المجالات ، مثل الحمض النووي ملزم الزخارف في عوامل النسخ ، وعادة ما تسفر أنماط التعبير الجيني محددة 8،9،12،15 (الشكل 1). هذا لأن ريبونوكلياز والعلاج في الخطوات اللاحقة لالتهجين (انظر أدناه) يقلل من مستوى التهجين المتبادل بين أفراد الأسرة التحقيق الجينات. A ريبونوكلياز يشق على عدم التطابق في الدوبلكس RNA ، تحقيقات لتفكيك النصوص المهجنة التكامل مع الكمال ، والتي سيتم غسلها في الخطوات اللاحقة.
    بشكل عام ، قد تحقيقات عدة لا بد من اختبار لكل جينة من الفائدة. تحقيقات يمكن أن تكون قصيرة بقدر 150 قواعد في الطول. Althougح ليس هناك حد لطول التحقيق ، ثم أقصر شظايا 1.5 كيلوبايت تدوين عادة بشكل أفضل. يتم استنساخ شظايا الحمض النووي ليكون في كتب تحتوي على ناقل T3 ، T7 ، أو SP6 المروجين (مثل pCRII - TOPO ، Invitrogen). بدلا من ذلك ، يمكن إدراج T3 ، T7 أو تسلسل المروج SP6 بمثابة الذيل 5' على عكس التمهيدي تستخدم لتضخيم المنطقة التحقيق.
    في كل تجربة التهجين في الموقع ، ونحن تشمل تحقيق السيطرة الايجابية التي تعرف نمط التهجين والذي يعمل باستمرار ، فضلا عن السيطرة السلبية (الشكل 1D و H). يمكن لهذا الأخير أن يكون التحقيق RNA العشوائية التي لا يعرف لهجن على أي محاضر في الأنسجة من الاهتمام. على الرغم من أنه من الشائع استخدام التحقيق الشعور الجين قيد التحليل ، وهذا ليس ضروريا وأي الحمض النووي الريبي غير التهجين تلائم هذا الغرض. إذا كانت متاحة ، وأنسجة من أليل فارغة الترانسكربتي من الجينات ذات الاهتمام بمثابة سيطرة على السلبية ممتازة.
    2. في النسخ المختبر
    1. يصبح خطي من البلازميد بواسطة الحمض النووي هضم ما يقرب من 5 ميكروغرام مع انزيم التقييد الذي يساعد على هضم في نهاية المقابلة لإدراج موقع المروج. لا تستخدم إنزيمات التقييد الذي ترك 3' - المتراكمة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى التحف النسخ لأن بوليميريز يمكن الاستفادة من تراكم 3 'باعتبارها ركيزة لمواصلة النسخ. بدلا من ذلك ، يمكن تضخيم المنطقة بما في ذلك التحقيق T7 ، T3 أو مروج SP6 بواسطة PCR لإنشاء قالب الحمض النووي للتفاعل في النسخ المختبر.
    2. الاختيار an قسامة على هلام للتحقق من أن رد الفعل قد ذهب إلى الاكتمال.
    3. استخراج الحمض النووي مع كلوروفورم الفينول / ، يعجل مع الإيثانول وresuspend بيليه في الحمض النووي في milliQ O 2 H إلى تركيز 1μg/μl. بدلا من ذلك ، يمكن تنظيفها باستخدام الحمض النووي DNA تنقية الأعمدة القياسية.
    4. إعداد رد فعل في المختبر عن طريق خلط النسخ :
      • 1μl بوrified الحمض النووي (1μg/μl)
      • 2μl العازلة النسخ 10X
      • 2 ميكرولتر 10X DIG مزيج الحمض النووي الريبي الوسم
      • 1μl ريبونوكلياز OUT
      • 2μl T3 ، T7 أو SP6 بوليميريز الحمض النووي الريبي (20 U / ميكرولتر)
      • H 2 O حتى 20μl.

      احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات. إبقاء 1μl لتحليل على هلام في وقت لاحق.
      ملاحظة : يفضل تحقيقات الإسفار المسمى الحيوانية في النظم ولكن نظرا لارتفاع لصناعة السيارات في مضان من معظم أنسجة النبات ، وفي البروتوكولات التهجين الموضع للنباتات استخدام مجسات radiolabeled 17 أو أكثر شيوعا DIG المسمى تحقيقات التي يتم الكشف عنها من قبل المناعية.
    5. إزالة القالب الحمض النووي عن طريق إضافة 75 ميكرولتر MilliQ H 2 O و 5 ميكرولتر RQ1 الدناز (1 يو / ميكرولتر) للتفاعل واحتضان النسخ رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    6. تنقية النسخ المختبر في رد فعل للقضاء على عدم إدراج النيوكليوتيدات والنصوص الصغيرة. واحد possiبيليتي هو استخدام الحجم استبعاد العمود ® Sephadex ، مثل أعمدة صغيرة سريعة سبين الحمض النووي الريبي (روش). بدلا من ذلك ، يمكن تنقية رد فعل من قبل هطول الأمطار النسخ LiCl / الايثانول التقليدي (انظر المرجع 14). إبقاء 1μl للاطمئنان على هلام في وقت لاحق.
    7. وعادة ما تكون التحقيقات أكثر من 250 قواعد في طول hydrolized جزئيا للحصول على جزيئات الحمض النووي الريبي لحوالي 150 الإقليم الشمالي ، وبالتالي صغيرة بما يكفي لاختراق بكفاءة المقاطع الأنسجة. إضافة حجم مساو من كربونات 2X العازلة (80 NaHCO 3 ملم ، 120 ملم نا 2 CO 3) للتفاعل النسخ المنقى واحتضان عند 60 درجة مئوية. ينبغي أن تحسب فترة حضانة بواسطة الصيغة التالية :
      الوقت = (لي -- LF) / (س ك س لى LF)
      حيث لى = طول التحقيق الأولي (في كيلوبايت) ؛ المندفة = طول التحقيق النهائي (0،150 كيلو) ؛ K = 0.11 كيلو بايت / دقيقة. 2 الاحتفاظ ميكرولتر للاطمئنان على هلام.
    8. تحييد رد فعل التحلل وذلك بإضافة 1 / 20 من حجم حمض الخليك 10 ٪.
    9. التحقيق ومن ثم بوريfied بإضافة 1μl من الحمض الريبي النووي النقال (100mg/ml) ، 1 / ​​10 حجم 3M NaAc درجة الحموضة 5.2 ، بالإضافة إلى وحدات التخزين البارد 2.5 الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، وتفرخ في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ترسيب الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي في 13500 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف بيليه وشطف الحمض النووي الريبي مع 500μl الايثانول 70 ٪. الطرد المركزي مرة أخرى ، والسماح للهواء الجاف بيليه (عادة حوالي 15 دقيقة) ، وresuspend الحمض النووي الريبي منزوع الأيونات في formamide 50μl 50 ٪. يجب أن يتم تخزينها في التحقيق -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    10. الاختيار على ٪ 1 العادية تاي agarose هلام المنتج النهائي فضلا عن منتجات وسيطة من أبواب 2.2.4 ، 2.2.6 و 2.2.7 (الشكل 2A). وهذا يسمح رصد كفاءة في رد فعل النسخ المختبر.
      ملاحظة : في رد فعل النسخ المختبر ينبغي ان تسفر عن ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل 1 ميكروغرام من القالب.
  2. نقطة لطخة تحليل
    ويمكن تقدير تركيز التحقيق وإدماج DIG - UTP بواسطة نقطة لطخة تحليل (الشكل 2B). المسلسل Rورصدت التخفيفات NA على غشاء تهجين الحمض النووي الريبي القياسية إلى جانب التحكم المسمى التركيز معروفة. على سبيل المثال ، فإننا نستخدم DIG - UTP المسمى التحكم RNA التحقيق شملت في عدة نسخ في المختبر (روش). فمن الأفضل لاختبار التخفيفات متعددة لكل التحقيق لإنشاء تركيز دقيقة.
    1. إعداد عازلة تمنع عن طريق إذابة 0.5 ٪ من الحظر الكاشف في 1X TBS العازلة (100 ملي تريس - pH7.5 حمض الهيدروكلوريك ، 150 مم كلوريد الصوديوم) في 70 درجة مئوية ، ثم ترك الحل يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. 1μl بقعة من التخفيفات التسلسلية (عادة ما بين 10 إلى 10 -5 -1) من تحقيقات في المختبر كتب والسيطرة على N + غشاء النايلون. إصلاح الحمض النووي الريبي بواسطة الأشعة فوق البنفسجية عبر الارتباط.
      ملاحظة : يجب استخدام الحد الأدنى من سطح الغشاء للحد من حجم المخازن اللازمة في وقت لاحق.
    3. يوازن في الغشاء TBS 1X لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) على منصة الاهتزاز.
    4. كتلة الغشاء باستخدام حظرالعازلة لمدة 30 دقيقة في RT على منصة الاهتزاز.
    5. شطف الغشاء في TBS 1X لمدة 5 دقائق.
    6. احتضان الغشاء المضادة للDIG الأضداد ، تمييع 1μl المضادة للdigoxigenin - AP في 10 مل من TBS 1X ، لمدة 45 دقيقة في RT.
    7. يغسل الغشاء مرتين في TBS 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    8. يوازن في الغشاء 1X TN العازلة (100mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 9.5 ، 100mM كلوريد الصوديوم) لمدة 5 دقائق.
    9. وصمة عار في الغشاء عن طريق احتضان مع NBT / BCIP 1 / 50 (V / V) في تينيسي 1X العازلة. يمكن تلوين اتخاذ 5-10 دقيقة. بعد شطف الغشاء بالماء ، ويمكن بعد ذلك أن تجفف وتحفظ كسجل.
      ملاحظة : NBT / BCIP هو الركيزة لالفوسفاتيز القلوية مترافق مع الأضداد المضادة للDIG أنه عند التحلل وتنتج صبغة زرقاء داكنة.

3. Sectioning

  1. الحارة الكتل إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كانت الكتل الباردة جدا ، قد المقاطع الفردية يتدحرج دون تشكيل "الشريط" من الشمع. تقليم كتلة في trapeشكل zoid ترك حوالي 1MM من الشمع حول العينة.
  2. الاحماء شريحة كبيرة دفئا في 35-37 درجة مئوية.
    ملاحظة : العديد من البروتوكولات القيام بهذه الخطوة في الحد من 42 درجة مئوية ولكن درجة الحرارة إلى 35-37 درجة مئوية يمنع تشكيل فقاعات تحت الأبواب.
  3. مكان للكتلة على مشراح بحيث يعد من الوجوه خطين متوازيين هو في القاع. جلب بعناية كتلة قدما إلى النصل ، وتأكد من أن سطح كتلة موازية للشفرة. المقطع في سماكة 8 -- 10μm. يمكن محاذاة شرائط الشمع على سطح غير لزجة ، مثل رقائق الألومنيوم أو الورق مرشح ، لتحديد قطاعات من الفائدة. ويمكن تقييم ذلك باستخدام مجهر تشريح القريبة.
    ملاحظة : تلطيخ يوزين من النسيج مؤشرا عما إذا كانت قد تسللوا بشكل صحيح أنسجة خلال التضمين. إذا لم تكن ملطخة وسط كتلة مع يوزين هذا يشير عادة سيئة أن يتم إصلاح الأنسجة.
  4. دقق على اساس علامة زائد SLايديس مع قلم رصاص (تم محو معظم الأقلام أو علامات خلال التهجين في بروتوكول الموقع) وتوزيع 1mL من milliQ نظيفة O 2 H على ذلك. تعويم بعناية أبواب الفائدة على سطح الماء في درجة حرارة الغرفة (من الأسهل التعامل مع المقاطع على الماء عند العمل في درجة حرارة الغرفة). تأكد من أن الجانب اللامع (الجانب السفلي كما يأتي الشريط الخروج من مشراح) تواجه المياه. ثم نقل الشريحة ببطء على الشريحة الأكثر دفئا. التدفئة يساعد على نشر المقاطع على سطح الماء. بعد 5 دقائق ، صب الماء قبالة بعناية ولكن في حركة واحدة على نحو سلس ، بحيث يتم خفض الشريط أسفل على الشريحة. السماح للشرائح الجافة على الأقل عدة ساعات أو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، لذلك تتمسك الأنسجة.
    ملاحظة : يمكن تخزينها في الأنسجة مقطوع مربع المجففة مع السيليكا لبضعة أيام إلى أسابيع عند 4 درجة مئوية ، ومع ذلك ، فمن الأفضل استخدام الشرائح في أقرب وقت ممكن.

4. المختلطة في الموقعسعودة

  1. المقطع ما قبل المعالجة
    فإن حجم المطلوبة لكل حل يعتمد بوضوح على عدد من الشرائح إلى أن تعامل واستخدام حجم الحاويات. وينبغي دائما أن تكون المقاطع مغمورة تماما. عن رف من 25 شريحة وحاوية المناسب بدقة ، 200-250 مل كافية. لأن العديد من الخطوات حضانة قصيرة جدا ، ونحن نستعد عادة كل الحلول الممكنة أولا ، ثم تبدأ الشريحة قبل العلاج. ومع ذلك ، فإن الحل أنهيدريد الخل ابد أن نكون مستعدين على الفور قبل أن يتم استخدام والبروتيني وأضاف في وقت الاستخدام. يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. أيضا ، يمكن أن يكون مستعدا في كل مخازن تركيز 10X كحل الأسهم.
    1. تدفئة العازلة البروتيني (100 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي EDTA) في حاوية إلى 37 درجة مئوية.
    2. Deparaffinize وترطيب أنسجة المقاطع على النحو التالي :
      • histoclear -- 10 دقيقة (استخدام صحن الزجاج)
      • histoclear -- 10 دقيقة (استخدامصحن الزجاج)
      • الايثانول 100 ٪ -- 1 دقيقة
      • 100 ٪ الايثانول -- 30 ثانية
      • 95 ٪ من الايثانول -- 30 ثانية
      • 85 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 70 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 50 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 30 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 10 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • milliQ H 2 O -- 1 دقيقة
    3. في برنامج تلفزيوني 1X احتضان لمدة 2 دقيقة.
    4. مزيج من 625μl 50mg/ml البروتيني في 250 مل العازلة البروتيني قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية ، واحتضان الشرائح لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة : مطلوب لهضم البروتينات البروتيني الثابتة وزيادة فرص تحقيق لالرناوات الخلوية. فمن الأهمية بمكان للتحكم في وقت الحضانة لتعظيم إشارة التهجين دون انهيار الأنسجة ، وبالتالي قد تكون هناك حاجة بعض التحسين لكل عينة الأنسجة.
    5. تحييد نشاط الأنزيم البروتيني في جليكاين 0.2 ٪ في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 دقيقة.
    6. شطف الشرائح مرة واحدة في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 دقيقة.
    7. علاج الشرائح طن حل PFA 4 ٪ لمدة 10 دقيقة لإعادة إصلاح الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تتضرر من جراء المعاملة البروتيني.
    8. شطف شرائح مرتين في برنامج تلفزيوني عن 1X 2 دقيقة لكل منهما.
    9. في حين أن الشرائح الموجودة في برنامج تلفزيوني يغسل ، ويشكلون 250 مل من 0.1 م 8.0 درجة الحموضة حل ثلاثي إلإيثانولامين بمزج 12.5 مل من ثلاثي إلإيثانولامين 2M (29.8g في milliQ 100ML O 2 H ، pH8.0 مع حمض الهيدروكلوريك) إلى 236.25 مل milliQ O 2 H في صحن الزجاج. إضافة 1.25 مل أنهيدريد الخليك ثلاثي إلإيثانولامين في المخزن المؤقت فورا قبل وضع الشرائح في ويقلب جيدا. بعد إضافة الشرائح ، والاستمرار في تحريك ببطء لمدة 10 دقيقة.
      هذا يتطلب أن يرتفع رف الشريحة في حاوية للثلاثي إلإيثانولامين / أنهيدريد الخل. نحن نستخدم نظام التثبيت مع موقف الدعم.
      ملاحظة : في هذه الخطوة ، والمجموعات الأمينية موجبة الشحنة التي قد تؤدي الى غير محددة وملزمة لجنة التحقيق هي الأسيتيل. أيضا ، أنهيدريد الخليك غير سامة ، ولذلك ينبغي أن يكون هذا الحل أعد غطاء الدخان والتخلص منها بشكل صحيح <./ لى>
    10. شطف شرائح مرتين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 دقيقة.
    11. يذوى المقاطع الأنسجة مرة أخرى :
      • H 2 O -- 1 دقيقة
      • 10 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 30 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 50 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 70 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 85 ٪ من الإيثانول -- 30 ثانية
      • 95 ٪ من الايثانول -- 30 ثانية
      • 100 ٪ الايثانول -- 30 ثانية
      • 100 ٪ الايثانول -- 30 ثانية
      ملاحظة : يمكن تخزين الشرائح في وعاء مع كمية صغيرة من الإيثانول بنسبة 100 ٪ في الجزء السفلي لمدة تصل إلى عدة ساعات في 4 درجات مئوية.
  2. تهجين
    1. كتلة دافئة التدفئة إلى 85 درجة مئوية.
    2. إعداد العازلة التهجين. لمدة 10 المزيج ، مل مل في أنبوب فالكون 1.25 في أملاح التهجين الموضع (3M كلوريد الصوديوم ، حمض الهيدروكلوريك 100mM تريس - 8.0 درجة الحموضة ، فوسفات الصوديوم 100mM pH6.8 ، 50mM EDTA) ، و 5 مل formamide منزوع الأيونات ، 2.5 مل كبريتات ديكستران 50 ٪ ، 250 ميكرولتر دينهارت 50x ، 125 ميكروليتر 100mg/ml الحمض الريبي النووي النقال ، و 875 ميكرولتر H 2 O. <ر /> ملاحظة : كبريتات ديكستران هو لزج جدا ، لذلك فمن الأفضل لتسخين المحلول إلى 60 درجة مئوية لجعل pipetting أسهل. يمكن أن يكون مخزن العازلة التهجين في -20 درجة مئوية.
    3. اعداد تحقيقات مختلفة. لكل شريحة ، مزيج 1 ميكروليتر التحقيق مع 9 ميكرولتر milliQ O 2 H و 10 ميكرولتر formamide منزوع الأيونات. التحقيق في الحرارة 85 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة ، والبرد على الفور على الجليد ، لفترة وجيزة الطرد المركزي ، وإضافة إلى التحقيق العازلة التهجين 80μl لكل شريحة. مزيج جيد من قبل pipetting ، ولكن تجنب الوقوع في فقاعات.
      ملاحظة : مقدار التحقيق التي يمكن ان تضاف لكل شريحة بد من اختباره تجريبيا. عموما ، تستخدم في تحقيقات تركيز النهائي من 0.5 تعقيد التحقيق نانوغرام / كيلو / ميكروليتر. وتجرى منذ التهجين مع 100 ميكروليتر لكل شريحة ، لا بد من ما يقرب من 25 نانوغرام لكل شريحة من التحقيق للتحقيقات التي هي 0.5 كيلو بايت في طول و 50 نانوغرام لكل شريحة من التحقيق للتحقيقات التي هي 1 - KB طويلة. عن البساطة ، ونحن نحاول في كثير من الأحيان 0.5 ، 1 ، و 4 المسبار ميكروليتر لكل شريحة.
    4. ضع الشرائح علىتنظيف السطح والسماح لهم الهواء الجاف تماما عن 5-10 دقيقة. الماصة المزيج العازلة المسبار / التهجين على الحافة اليمنى من الشريحة. انخفاض تدريجي ساترة على الشريحة ؛ التأكد من أن حل التهجين يغطي جميع قطاعات دون أي فقاعات. اضغط على ساترة بخفة بإصبعك حيث شكل فقاعات لتشريدهم من جميع أقسام الأنسجة. لا سحب الغطاء ينزلق باتجاه آخر ، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف أجزاء.
      ملاحظة : أسلوب بديل استخداما لهذه الخطوة هو إعداد "السندويشات" اثنين من الشرائح التي يتم تحضين مع التحقيق نفسه. لمزيد من التفاصيل حول هذا الأسلوب ، انظر المرجع. 14.
    5. تعد الغرفة الرطوبة في علبة بلاستيكية مسطحة تماما. مبلل تغطية الجزء السفلي من مربع مع ورقة المياه مع whatman milliQ ، غطت الورقة مع parafilm ترك زوايا كشفت ؛ وضع الشرائح في مربع من البلاستيك وختم مربع بإحكام.
    6. احتضان الشرائح في درجة الحرارة المرغوبة التهجين ، و 50 في العادة -- 55 درجة مئوية ، وأو 16-20 ساعة.
    7. للاستخدام في صباح اليوم التالي ، وإعداد 1 لتر 0.2x وتخزين هذه المؤسسة في 55 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد 1 العازلة NTE لتر (0.5 M كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس - pH7.5 حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم pH8.0 EDTA) وتخزينها في 37 درجة مئوية.
  3. بعد التهجين العلاج
    1. إزالة coverslips بعناية حتى لا تلحق الضرر المقاطع. ضع الشرائح في الرف وغسلها مرتين في محكمة أمن الدولة في 0.2x 55 درجة مئوية لمدة ساعة.
      ملاحظة : كثيرا ما تقع قبالة Coverslips بسهولة عندما توضع الشرائح في وضع مستقيم. إذا كان لا يزال يعلق ساترة ، غمر الشريحة في SSC 0.2x دافئ لمدة 1 أو 2 دقيقة لغسل قبالة ساترة. تجنب سحب ساترة من الشريحة ، وهذا يمكن أن يسبب الضرر للأقسام.
    2. في غضون ذلك ، وإعداد 500 مل العازلة الغسيل (1 ٪ جيش صرب البوسنة ، تريتون 0.3 في المئة في المخزن TBS) و 100 مل حل حجب (0.5 ٪ في حجب كاشف العازلة TBS). تحريك مسحوق الحجب في TBS أن يسخن ببطء الى 70 درجة مئوية ، وندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة مرة واحدة dissolvأد.
      ملاحظة : حجم غسل العازلة وعرقلة الحل اللازم سوف تختلف تبعا لحجم علبة بلاستيكية تستخدم في شقة الخطوات 4.3.8 -11. الامر سيستغرق بعض الوقت لتذوب تماما تريتون ، وإعداد ما يكفي من ذلك الحل مقدما.
    3. يوازن الشرائح في NTE 1X لمدة 2 دقيقة.
    4. انتقل إلى ريبونوكلياز والعلاج عن طريق نقل الشرائح في NTE 1X العازلة التي 20μg/ml ريبونوكلياز ويضاف فقط استخدام السابقة ، ويحضن في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.
      ملاحظة : A ريبونوكلياز يشق مجانا المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي وكذلك في عدم التطابق في الدوبلكس الحمض النووي الريبي. هذه الخطوة تساعد على خفض مستوى غير محددة وملزمة للجنة التحقيق ، كما يتم غسلها المشقوق قبالة شظايا بحث في غسل مشاركة SSC 0.2x (انظر 4.3.6).
    5. شطف شرائح مرتين في 1X NTE لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    6. تغسل الشرائح في SSC 0.2x جديدة على 55 درجة مئوية لمدة ساعة.
    7. يوازن الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. نقل الشرائح من رف على ال(ه) من أسفل مربع من البلاستيك المسطحة وغطاء لهم مع حجم الحد الأدنى من الحل حظر. كتلة الشرائح لمدة 45 دقيقة على منصة تهز ببطء.
    9. نقل الشرائح للمرة الثانية نظيفة مربع من البلاستيك المسطحة وغسلها لمدة 45 دقيقة مع الغسيل العازلة على منصة الاهتزاز.
    10. انتقل إلى حضانة الأضداد. تمييع الأضداد المضادة للdigoxigenin في غسل العازلة (1:5 V / V) وتطبيق الحد الأدنى من حجم إما مباشرة على كل شريحة أو مكان الشريحة في علبة بلاستيكية مسطحة وغطاء لهم مع حجم الحد الأدنى من حل الأجسام المضادة. احتضان الشرائح في الظلام لمدة 2-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    11. تغسل الشرائح 4 مرات لمدة 15 دقيقة مع كل غسل عازلة على هز النظام الأساسي. استخدام الحد الأدنى من حجم غسل العازلة والبلاستيك مربع مسطح. تنظيف علبة بلاستيكية بين كل من يغسل.
      ملاحظة : تنظيف مربع بين يغسل سوف يخفض خلفية عامة على الشريحة. لتبسيط هذا ، ونحن نستخدم مربعي شقة مماثلةونقل الشرائح في مربع نظيفة بعد كل غسل.
    12. نقل الشرائح في TBS 1X لمدة 2 دقيقة.
    13. يوازن الشرائح العازلة في تينيسي مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    14. يعد حل تلطيخ على الفور قبل استخدامه وذلك بإضافة 20 NBT ميكروليتر / 1 في BCIP العازلة TN مل. من أجل حل تلطيخ في صحن بلاستيكي صغير وزنها. شطيرة شريحتين مع المقاطع التي تواجه بعضها البعض. تراجع جانب واحد طويل من الساندويتش في الحل ، مما يسمح للعمل شعري لسحب ما يصل إلى الحل. استنزاف الشرائح على Kimwipe وملء الشرائح الحل مع الأجسام المضادة مرة أخرى. قد تحتاج للاستفادة من الشرائح هو الحل لتجنب التدفقات في فقاعات. ضع الشرائح في علبة بلاستيكية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    15. يوم 10 الى يوم 15 : تحديث الحل تلطيخ مرتين يوميا لمدة 1-5 أيام من قبل الشطف الشرائح العازلة في تينيسي ، وإعداد السندويشات الطازجة جديدة تحتوي على حل تلطيخ.
      ملاحظة : استبدال الحل في تلطيخ كثافة العمليات العاديةسوف ervals تحسين إشارة إلى نسبة الخلفية. يمكن رصد تطور إشارة تحت المجهر المركب أو ستيريو. فمن الممكن لتصوير المقاطع أثناء وجودهم في تينيسي في العازلة بين جولات تلطيخ أو حالما يتم تحويلها إلى مياه قبل تصاعد دائم.
  4. متزايد
    1. مرة واحدة في إشارة واضحة ، شطف الشرائح في milliQ O 2 H ويذوى عليها بسرعة من خلال سلسلة الايثانول :
      • 10 ٪ من الإيثانول -- 10 ق
      • 30 ٪ من الإيثانول -- 10 ق
      • 50 ٪ من الإيثانول -- 10 ق
      • 70 ٪ من الإيثانول -- 5 ليالي
      • 80 ٪ من الإيثانول -- 5 ليالي
      • 95 ٪ من الإيثانول -- 5 ليالي
      • الإيثانول بنسبة 100 ٪ -- 5 ليالي
      • histoclear -- 2 دقيقة
      • histoclear -- 2 دقيقة
      ملاحظة : تأكد للحفاظ على كل من هذه الأوقات حضانة قصيرة ، وكانت الإشارة الإيثانول القابل للذوبان.
    2. تحميل الشرائح من خلال وضع واحد أو اثنين قطرات من التولوين مقرها المتوسطة المتزايدة على كل تراجعه وخفض ببطء ساترة على الشريحة تجنب تشكيل فقاعات. اسمحوا المتوسطة تصاعد التشدد بين عشية وضحاها قبل تحليل النتيجة تحت المجهر المركب. شنت مرة واحدة ، يمكن تخزين الشرائح لسنوات في درجة حرارة الغرفة.

5. ممثل النتائج :

بعد 1-5 أيام ، وسوف إشارة حمراء اللون الارجواني تطوير في تلك الخلايا حيث ان التحقيقات لم المهجنة إلى النصوص التكميلية (الشكل 1). إشارة اللون يوفر بالتالي التصور المباشر على القرار الخلوية من نمط التعبير عن الجينات في المصالح. ويجوز للتلوين الخلفية أيضا تطوير الأضعف ، نتيجة الربط غير محددة من التحقيق أو تلطيخ الأنسجة النباتية (الشكل 3). قد تكون هذه إشارة الخلفية نسبيا أكثر وضوحا في زنازين صغيرة واقل تصميما من الأنسجة ، ولكن أيضا تلطيخ تكون الخلفية التي لوحظت في أقسام المهجنة للتحقيقات السيطرة السلبية والإيجابية ، وسوف لايمكن استنساخه بين التجارب.

الشكل 1
الشكل 1. النتائج التي تم الحصول عليها مع ممثل تحقيقات مختلفة على أنسجة Arabidopsis والذرة. التهجين في الموقع من Arabidopsis (AD) والذرة الأنسجة (EH) مع تحقيقات منفصلة محددة الجينات التي توضح نوع النتائج التي يمكن توقعها عند الانتهاء الناجح للبروتوكول المبينة. (أ) من SHOOTMERISTEMLESS1 الأقلمة (STM) في تبادل لاطلاق النار قمة Arabidopsis الخضري ، لاحظ وجود إشارة الأزرق الأرجواني في الخلايا غير محدد من النسيج الإنشائي وعدم وجود إشارة في الأوراق المحيطة بها. (BD) مقاطع من Arabidopsis الأجنة مرحلة نسف تظهر CLAVATA3 (B) في التعبير عن الخلايا الجذعية الجنينية قليلة ، بحث AtML1 (C) التعبير في طبقة البشرة ، وعدم وجود إشارة في الفروع مع الحمض النووي الريبي السيطرة السلبية العشوائي (D ). (E) التعريب من STM knotted1 homolog في جنين الذرة النامية ؛ نلاحظ إشارة قوية على وجه التحديد في النسيج الإنشائي الجنينية والجذر. (FH) المقاطع الطولية من خلال تبادل لاطلاق النار قمة النباتي من الذرة تظهر واضحة في أنماط التهجين الموضع لarf3a (F) وocl4 (G) وعدم وجود إشارة التهجين لتحقيق السيطرة السلبية (H). وأعرب عن arf3a على سطح ورقة مجافي المحور / القاع ، في حين أعرب ocl4 homolog AtML1 تحديدا في البشرة.

واستخدمت الأجزاء التالية كما هو جين التحقيق : STM : المنطقة التي تشمل الأحماض الأمينية [كدنا] 81-382 ، والذي يتضمن homeodomain الحفظ ؛ CLV3 : طول كامل [كدنا] ؛ AtML1 : لاكسون الثالثة ؛ kn1 : كامل الإطار القراءة المفتوحة ؛ arf3a : النيوكليوتيدات 9-225 من استنساخ [كدنا] HM004539 ؛ ocl4 : 3 '1.7 كيلوبايت من طول كامل [كدنا] ، والذي يتضمن العديد من المجالات البروتين الحفظ.

معشوقة = "jove_content"> الشكل 2
الشكل 2. فحص نقطة ، في حين صنع في تحقيقات النسخ المختبر. (أ) في تحقيقات التهجين الموضع يتم التحقق على agarose هلام القياسية بعد النسخ في المختبر (أ) ، بعد المعالجة والتنقية الدناز اللاحقة للكرد فعل النسخ المختبر (ب) ، بعد كربونات المائي ، إذا لزم الأمر ، (ج) وعندما جاهزة للاستخدام (د). لتحقيقات أكثر من 250 سنة مضت في الطول ، مثل مسبار 1 ، فإن العائد المائي كربونات مجموعة من شظايا أصغر المسبار (قوس). (ب) القياس الكمي للتحقيقات اللونية من خلال تحليل لطخة نقطة. ورصدت التخفيفات تتراوح بين 10 إلى 10 -5 -1 من تحقيق السيطرة 100 نانوغرام / ميكروليتر (1) وثلاث حديثا DIG المسمى تحقيقات (2-4) على غشاء نقل ، حضنت المضادة للDIG الأضداد ، ويعاير باستخدام مقايسة اللونية المبينة في القسم 2.3 من البروتوكول. ويشير التحليلالتركيزات التالية المقدرة : المسبار 2 ، ~ 100 نانوغرام / ميكروليتر ؛ المسبار 3 ، ~ 10 نانوغرام / ميكروليتر التحقيق 4 ، ~ 1 نانوغرام / ميكروليتر. 4 التحقيق من غير المرجح أن تسفر عن جيد في إشارة التهجين الموقع.

الشكل 3
الشكل 3. مقارنة التحقيق غير محددة لتحقيق عمل جيد. المقاطع الطولية من خلال تبادل لاطلاق النار قمة النباتي من الذرة تظهر إشارة الخلفية غير محددة (A) والمحددة في إشارة التهجين الموضع للمسبار OCL5 في طبقة الخلية الخارجي (B).

الشكل 4
الشكل 4. رسم تخطيطي يبين الجدول الزمني للخطوات في بروتوكول التهجين في الموقع. يشار إلى خطوات دمج الأنسجة في خطوات التحقيق لتحضير الأخضر ، والبرتقال ، وعلى الخطوات التهجين في الموقع في الزرقاء. هذا الخط يعتبر أن الحمض النووي templaالشركة المصرية للاتصالات للنسخ في المختبر لجنة التحقيق هو متاح. يمكن أن تكون على استعداد كتل الأنسجة Parafin جزءا لا يتجزأ من وحفر المسمى تحقيقات مسبقا وتخزينها في 4 -80 درجة مئوية ودرجة مئوية ، على التوالي ، وحتى وقت الاستخدام. ويمكن بعد ذلك في البروتوكول الموقع التهجين تستكمل في أقل من أربعة أيام.

Discussion

في أسلوب التهجين في الموضع المذكورة هنا يسمح للرؤية مباشرة للنمط التعبير الجيني spatiotemporal أي اهتمام لقرار الخلوية كبيرة وحساسية عالية وخصوصية. البروتوكول لا يسمح بالمقارنة الكمية للمستويات التعبير بين الجينات. ومع ذلك ، يمكن للحساسية العالية والأسلوب القرار تكشف التدرجات في التعبير الجيني داخل أنسجة 8 ، 18 ، وهو غير ممكن مع معظم وسائل أخرى للتحليل التعبير الجيني.

البروتوكول يتضمن العديد من الخطوات ، التي يمكن أن تجعل حل المشاكل مشاكل. أهم الخطوات للبروتوكول هي تثبيت للأنسجة واختيار ووضع العلامات على التحقيق. سوف الأنسجة تسلل سيئة وتحقيقات مع إدماج DIG منخفضة الغلة اشارات ضعيفة جدا التي قد يكون من الصعب الكشف عن الخلفية أعلاه. لكل جين جديد لسعر الفائدة ، فمن المستحسن لمحاولة تحقيقات قليلة متميزة مستمدة من diffeاستئجار مناطق نسخة. أحيانا ، قد اثنين أو ثلاثة تحقيقات تستهدف مختلف مناطق أصغر من الجينات يمكن الجمع بين الحاجة إلى الحصول على إشارة قوية التهجين ومحددة. بالإضافة إلى ذلك ، الشروط التهجين ، مثل درجة الحرارة وتكوين العازلة التهجين ، يمكن أن يكون الأمثل لكل جينة أو أنسجة لخفض أو زيادة التشدد التهجين. أيضا الخطوة العلاج البروتيني هو متغير ويمكن تغييرها لتكييف بروتوكول للأنواع النباتية المختلفة أو للكشف عن النصوص مع وفرة منخفضة جدا. سيتم إدراج كل من تحقيقات الرقابة الإيجابية والسلبية تكون مفيدة في تحديد نقاط إشكالية البروتوكول.

هو الأمثل لإجراء البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة النباتية ولكن يمكن استخدامها مع تعديلات طفيفة أيضا في جبل لكامل الموقع التهجين. وعلى الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في البحوث الحيوانية 19 ، جبل بأكمله في الموقع التهجين يكون لimited إلى الأنسجة النباتية التي يمكن أن تكون مخترقة بسهولة ، مثل الأجنة ، والجذور أو الأنسجة meristematic الشباب 20،21. ويمكن أيضا أن يتم تعديل البروتوكول بسهولة اكتشاف وقت واحد اثنين mRNAs مميزة أو توطين النصوص جنبا إلى جنب مع بروتينات 15،22،23. أخيرا ، فمن الممكن لتوسيع نطاق تطبيق هذا الأسلوب على تصور أنماط التعبير RNA الصغيرة في النباتات. وقد تم تحديد أنماط التعبير ميرنا باستخدام هذا البروتوكول في كل من الذرة وArabidopsis 8،14. في الآونة الأخيرة ، تم استبدال تحقيقات في كتب من قبل المختبر المتاحة تجاريا DIG المسمى الحمض النووي مؤمن (LNA) والتي تزيد بنسبة ضئيلة تحقيقات حساسية إشارة 18 ، 24.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم البحوث في مختبر طن متري من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية (DBI - 0820610 و 1022102 IOS) ونيويورك وزارة الصحة (NYSTEM - C024308). تلقى CM زمالات ما بعد الدكتوراه من وزارة التربية والتعليم الإسبانية والعلوم (2007-0937) ورافائيل ديل بينو مؤسسة واسبانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytoseal 60 4oz Fisher Scientific 23-244-256 Toluene-based 8310-4
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus Fisher Scientific 23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL Invitrogen 10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl Promega Corp. M6101
DIG-labeled Control RNA Roche Group 11585746910
DIG RNA labeling mix Roche Group 11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10881767001
RNase-A Roche Group 109142 dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent Roche Group 1 096 176 Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U Roche Group 1 093 274
NBT/BCIP stock solution Roche Group 1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns Roche Group 11814427001
tRNA from E. coli Roche Group 109541
Triton®X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV Sigma-Aldrich P5147 Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279 Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride Sigma-Aldrich A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate Sigma-Aldrich D2532
Albumin from bovine serum - ≥98% Sigma-Aldrich A7906
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds Electron Microscopy Sciences 62352-15
Embedding rings Fisher Scientific 22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps VWR international 66020-326
Probe-on-plus slides Fisher Scientific 22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm VWR international 48404-452
Whatman paper 3mm VWR international 89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack Electron Microscopy Sciences 71420-25 Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers Electron Microscopy Sciences 71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes Help handing wax ribbons
Microtome Leica
Self-cleaning dry vacuum system Welch Allyn 2025
Slide warmer Fisher Scientific
Heating block needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C Fisher Scientific For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C Fisher Scientific Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
  2. Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
  3. Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
  4. Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
  5. Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
  6. Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
  7. Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
  8. Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
  9. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
  10. Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
  11. Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
  12. Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
  13. Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
  14. Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
  15. Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
  16. Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
  17. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
  18. Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
  19. Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
  20. Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
  21. Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
  22. Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
  23. Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
  24. Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).

Tags

علم الأحياء النباتية ، العدد 57 ،
<em>في الموقع التهجين</em> لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Javelle, M., Marco, C. F.,… More

Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328, doi:10.3791/3328 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter