Summary
“
Abstract
随着基因组学研究在过去十年的进步，植物生物学已经看到大量的研究，提出大型基因表达的定量分析。正在使用的芯片和下一代测序方法调查发育，生理应激反应过程，解剖后生和小RNA的途径，并建立大的基因调控网络1-3。虽然这些技术方便的大型基因组的同时分析，他们通常会提供一个非常有限的时空分辨率，基因表达的变化。这种限制可以通过使用分析方法结合lasermicrodissection或荧光激活细胞分选4-7部分克服。然而，要充分认识的一个基因的生物作用，在细胞决议，其表达的时空格局知识是必不可少的。特别是，当研究发展或环境STI影响木里和突变体的一个基因的表达模式的详细分析变得至关重要。例如，在微妙的关键调控基因的表达水平的定量差异可能导致在特定的细胞类型中表达的损失或收益时，戏剧性的表型。
有几种方法经常用于基因表达模式的详细检查。其一是通过转基因记者线的分析。 ，但是，这种分析可以成为耗时分析多个基因或植物顽抗转型工作。此外，一个独立的验证，以确保转基因表达模式模拟的内源性基因，通常是必需的。免疫组化蛋白定位或mRNA原位杂交中，目前基因表达的细胞和组织内的直接可视化的比较快的替代品。后者具有明显的优势，它可以很容易ü任何感兴趣的基因原位杂交。SED允许一个标记的反义RNA杂交细胞与靶mRNA的检测探头在体外感兴趣的基因的转录获得。
在这里，我们为协议大纲在原位定位基因在植物中的表达，是高度的敏感性和具体。它是使用多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，这给组织学的优秀保存，地高辛标记探针免疫检测和碱性磷酸酶比色法反应的可视化进行了优化。该协议已成功地应用于广泛的植物物种组织，可用于分析mRNA的以及小分子RNA 8-14表达。
Protocol
1。样品制备
注：所有步骤，并包括杂交步骤是敏感的RNase活性。因此，必须在清洁的条件下工作。它也相当普遍，使至少3个小时的使用DEPC处理的水和玻璃器皿烤在180 ° C无RNase的所有解决方案。往往通过30分钟的治疗0.2 N氢氧化钠清洗塑料容器。然而，这些预防措施没有，是必要的，我们通常使用的所有解决方案，定期清理 milliQ H 2 O。我们保持单独原位杂交试剂盒，玻璃器皿和存储在一个干净的内阁这些。
- 样品固定
- 第1天：准备新鲜的4％多聚甲醛（PFA）固定液。 500毫升，温暖400毫升1X PBS（氯化钠130毫米，7毫米的Na 2 HPO 4，3毫米的NaH 2 PO 4 pH7.0的）到60 ° C和溶于氢氧化钠颗粒。在通风橱中，添加20克的paraformaldehyDE调匀，直到溶解。解决方案，并置于冰上冷却时与H 2 SO 4（1-2滴为100ml）的pH值调整至7.2 。然后调节音量至500 ml 1X PBS。
注意：不要使用盐酸调整pH值，因为这会释放剧毒气体。多聚甲醛是有毒的，因此这个解决方案应该准备在通风橱和妥善处理。此外，多聚甲醛是储存在4 ° C，应该买新的，每6 - 9个月。 - 收获组织样本，并放置在15毫升新鲜煤灰固定液，他们立即在玻璃闪烁瓶冰。如果组织剥离是必需的，最好的做法是在寒冷的固定液冰。
注：重要的是要使用大量过剩的固定液。一般建议的比例是1体积的组织使用的固定液10卷。 - 应用真空的样品，而在冰（〜500毫米汞柱）。保持一个15-20分钟的真空小气泡从样品中释放但固定液不应该来烧开。慢慢释放真空，和更新的煤灰固定液，以确保固定液保持在合适的浓度。重复此步骤，直到组织下沉真空释放后。
注：固定修复和交叉连接组织内的RNA分子。这一步是关键，不好固定材料产量低的信号。有些组织没有立即下沉，但大多数最终会下沉过夜。为了提高固定液的渗透，可以添加以下洗涤剂：TRITON 0.1％和/或吐温可达0.1 - 0.3％。另外，乙醇为基础的固定剂甲醛酒精酸的酸性物质，如美国联邦航空局（FAA），可用于在其他方面不容易渗透14,15组织。 - 替换的煤灰固定液一次，并保持在4 ° C过夜的小瓶。
- 第1天：准备新鲜的4％多聚甲醛（PFA）固定液。 500毫升，温暖400毫升1X PBS（氯化钠130毫米，7毫米的Na 2 HPO 4，3毫米的NaH 2 PO 4 pH7.0的）到60 ° C和溶于氢氧化钠颗粒。在通风橱中，添加20克的paraformaldehyDE调匀，直到溶解。解决方案，并置于冰上冷却时与H 2 SO 4（1-2滴为100ml）的pH值调整至7.2 。然后调节音量至500 ml 1X PBS。
- 组织包埋
- 第2天：预冷1X PBS和乙醇在4 ° C。
- 冲洗样品TWICE 30分钟1X PBS冰，。
注：又是推荐使用的每个解决方案的大量过剩。 - 脱水样品通过乙醇系列，冰上如下：
- 10％的乙醇30分钟，
- 30％的乙醇30分钟，
- 50％乙醇1小时，
- 70％的乙醇1小时，
- 85％的乙醇1小时，
- 95％乙醇1小时，
- 31小时每变化100％的乙醇
- 在这一天结束，取代0.1％曙红的乙醇，100％的乙醇过夜，4 ° C。曙红渍细胞壁使样品在嵌入和切片可见。
注：这里表示的时代已经过优化的3x3x3毫米，但较长的孵化，可能需要更大的样本块。
样品可以存储数个月在70％乙醇在4 ° C。 第3天：第二天早晨，温暖的一小时样品室温。然后逐步取代histoclear乙醇如下：
- 在这一天结束，加1 / 4量Paraplast Plus芯片，并将其放置在60 ° C烘箱的小瓶。同时填充Paraplast芯片烧杯中，这经常补充，才能始终有新鲜熔化的蜡在手。
注：烤箱温度是重要的和长期的Paraplast加热超过60 ° C应避免。 - 第4天：逐步取代Paraplast histoclear定期加入更多的石蜡芯片（每隔一小时）。在这一天结束，小心地倒出histoclear /蜡混合物，立即更换纯熔化的蜡。保留样本，在60 ° C过夜。
- 5天6：更改Paraplast 3次，每天，每4小时左右，与新鲜熔化的蜡保持的Samples在60 ° C。
注：这是可以改变蜡，每天只有一次，但组织准备采取一些额外的天才能完成，需要改变至少5或6次蜡。真空渗透的组织样本，当这些在100％的乙醇和/或蜡，可进一步提高组织的渗透和嵌入。真空渗透蜡样品应在60 ° C - 第7天：再次更改蜡。 histoclear气味，现在应该完全消失和样品可以嵌入在当天晚些时候。
- 设置一个大的气候变暖板在60 ° C保护铝箔。
- 埋线法将不同类型的组织进行分析而异。在这一步，最重要的一点是，以确保样品切片后的正确导向。一种方法是使用塑料模具和环。热身变暖板模具和熔化的蜡倒入模具底部的一部分。转让进入到所需的位置与温暖钳和东方，模具的组织样本。放置到模具的白环和添加额外熔化的蜡，这样的组织完全覆盖。小心从板凳板模具。让蜡逐渐降温。
另一种可能性是散布在培养皿的所有样品含有熔融蜡（样品应完全覆盖蜡），而在60 ° C的加热板工作。定位与温暖钳样品。最后，关掉板。当蜡凝固后，在培养皿可以移动的板凳，然后存放在4 ° C。小块，包含组织样本切片准备时，可以切出一个温暖的刀片培养皿，并安装到切片标本持有人额外的下降与熔化的蜡。让我们几分钟前切片样本变硬。
注：块可以储存在4 ° C为1年或更长的时间。对于组织固定和嵌入额外的有用的提示，见文献。 16
2。探针制备
- 克隆
探头通常产生一个或多个感兴趣的基因的特定区域。应排除从探头高度重复序列，但序列对应保守的蛋白结构域转录因子的DNA结合的图案，如，通常会产生特定基因表达模式8,9,12,15（图1）。这是因为在核糖核酸酶A在治疗后的杂交步骤（见下文）降低探针基因家族成员之间的交叉杂交的水平。核糖核酸酶A切割的RNA双链的不匹配，不完善的互补性，这将在后续步骤中洗涤杂交成绩单碎片探测。
在一般情况下，几个探头，可能需要为每个感兴趣的基因测试。探头可短的长度为150基地。 Although探针的长度没有限制，片段较短，1.5 kb的通常转录更好。被转录的DNA片段克隆到含有T3，T7或SP6的促销员（例如pCRII - TOPO，Invitrogen公司）载体。另外，T3，T7或SP6的启动子序列可以包括一个用于放大探头区域的反向引物5' -尾巴。
我们在每一个原位杂交实验，包括阳性对照探针杂交模式是已知的作品始终，以及阴性对照（图1D和H） 。后者可能是随机的RNA探针，被称为杂交组织利益的任何笔录。虽然是很常见的使用感探头在分析基因，这是没有必要和任何非杂交RNA适应的目的。如果有的话，从一个感兴趣的基因的转录空等位基因组织，作为一个优秀的阴性对照。 - 线性化质粒插入对面的子网站摘要用限制性内切酶消化约5微克DNA。不要使用限制性内切酶，离开3' -悬。这可能会导致转录文物，因为可以利用聚合酶作为基材的3'悬继续转录。另外，包括了T3，T7或SP6的启动子探针地区可通过PCR扩增，DNA模板体外转录反应生成。
- 检查凝胶等份，以验证该反应已经完成。
- 用酚/氯仿提取DNA，用乙醇沉淀和悬浮在milliQ H 2 O的DNA沉淀的1μg/μl浓度。另外，DNA可以使用标准的DNA纯化柱清洗。
- 设置在混合体外转录反应：
- 加入1μlPUrified的DNA（1μg/μl）
- 2μL10X转录缓冲
- 2μL的10倍DIG RNA标记组合
- 加入1μl核糖核酸酶输出
- 2μLT3，T7或SP6 RNA聚合酶（20 U /μL）
- H 2 O至20μL。
在37 ° C为1至2小时。保持加入1μl凝胶分析后。
注：荧光标记的探针在动物系统的首选，但由于大多数植物组织自体荧光原位杂交植物的协议， 使用放射性探针17或更普遍地高辛标记探针免疫组织化学检测。 - 取出加入75μL的MilliQ H 2 O和5μLRQ1 DNA酶（1 U /μL）的转录反应和孵化，在37 ° C 10分钟的反应的DNA模板。
- 净化在体外转录反应，以消除非注册核苷酸和小成绩单。一个possibility是使用大小排斥葡聚糖®列，如迷你快速自旋RNA列（罗氏），。另外，转录反应可以纯化由传统的氯化锂/乙醇沉淀（见文献14）。保持加入1μl凝胶检查后。
- 长度超过250个基地的探头通常部分水解获得约150台币，因此，小到足以有效地渗透到组织切片的RNA分子。添加一个2X碳酸盐缓冲液等体积（碳酸氢钠3 80毫米，120毫米NA 2 CO 3）纯化的转录反应，并培育在60 ° C。培养时间应当按下列公式计算：
时间=（李 - LF）/（K x李献华LF）
其中Li =初始探针长度（KB）; LF =最终探针长度（0.150 KB），K = 0.11 KB /分钟。保持2μL凝胶上检查。 - 中加入1 / 20体积的10％醋酸的水解反应。
- 然后探头纯化fied通过加入加入1μl的tRNA（100mg/ml），1 / 10体积3M醋酸钠pH值5.2，加2.5倍体积的100％冷乙醇，于-80 ° C孵育30分钟。沉淀离心13500 rpm的20分钟，在4 ° C的RNA弃上清，用500μL70％的乙醇冲洗的RNA沉淀。离心机再次，让沉淀空气干燥（通常约15分钟），重悬的RNA50μL50％去离子甲酰胺。探头应存放于-80 ° C，直到使用。
- 定期检查1％TAE琼脂糖凝胶作为第2.2.4，2.2.6和2.2.7（图2A）中间产品以及最终产品。这允许的体外转录反应效率的监测。
注： 在体外转录反应应该产生约1微克的RNA模板，每1微克。 - 点杂交分析
探针浓度和DIG - UTP掺入可评估点杂交分析（图2B）。串行ř发现不适用稀释到旁边一个已知浓度的标记的对照RNA的标准杂交膜。例如，我们用DIG - UTP标记的RNA探针控制在体外转录试剂盒（罗氏） 。最好是测试每个探头的多个稀释，以建立一个准确的浓度。- 准备1X TBS缓冲液（100毫米的Tris -盐酸PH7.5，150 mM氯化钠）在70 ° C溶解在0.5％阻断剂封闭液，然后让解决方案降温至室温。
- 系列稀释的体外转录和控制探针在N +尼龙膜（通常为10 -1 10 -5）现货加入1μl 。修复UV交联的RNA。
注：一个极小曲面的膜应该使用，以减少以后需要的缓冲区的数量。 - 平衡1X TBS的膜在室温（RT）5分钟用颤抖的平台上。
- 膜的使用阻塞座缓冲区在室温下30分钟，用颤抖的平台上。
- 1X TBS的冲洗5分钟膜。
- 孵化膜与抗地高辛抗体，在室温为45分钟，稀释在10毫升的1X TBS的抗地高辛- AP的加入1μl。
- 洗膜两次，每次15分钟1X TBS的。
- 平衡1X TN缓冲区（100MM的Tris - HCl pH值9.5，氯化钠100MM）膜5分钟。
- 污点NBT / BCIP显1 / 50（V / V）的孵化1X的TN缓冲膜。染色5-10分钟。之后用清水冲洗膜;，然后就可以进行干燥处理，并作为记录保存。
注：NBT / BCIP底物为碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，水解后产生一种深蓝色染料。
3。切片
- 温暖块至室温。如果块过冷，个别路段可能翻转而形成蜡“剪彩”。修剪成trape块zoid形状的蜡留下约1mm左右样品。
- 热身大型幻灯片在35-37温暖° C。
注：许多协议，这一步在42 ° C但是降低温度35-37 ° C防止形成气泡下的部分。 - 放置到切片的两平行面的底部块。小心地把块刀片，确保块的表面是平行的刀片。第厚度在8 - 10微米。如铝箔或滤纸上非粘性表面，蜡色带可以对齐，选择感兴趣的部分。这可以使用附近的解剖显微镜进行评估。
注：伊红染色的组织提供了一个组织是否得到了妥善渗透在嵌入。如果块的中心，是不是与HE染色，这通常表明组织是很难固定。 - 标记探针，另加SL新娘与铅笔（钢笔或标记擦除在原位杂交协议），并分发到清洁milliQ H 2 O 1ML 。仔细浮动表面的水在室温下（很容易操纵在室温下工作时，在水面上的部分）的利息部分。确保有光泽的一面（色带的切片底部）面临水。然后慢慢转移幻灯片到幻灯片温暖。暖气帮助部分水面上传播。 5分钟后，倒入水仔细，但在一个平稳的运动，使色带降低到幻灯片。让幻灯片干燥至少几个小时或过夜，在37 ° C，所以组织坚持。
注：切片组织可以储存数天至数周在4 ° C，一箱用硅胶干燥剂，它是最好尽快使用幻灯片。
原位杂交种4 。化
- 科前处理
每个解决方案所需的体积显然将取决于来对待和使用的容器大小的幻灯片的数量。部分应始终被完全淹没。 25幻灯片机架和整齐配件的容器，200-250毫升就足够了。因为许多的孵化步骤很短，通常我们准备所有可能的解决方案，然后开始滑动前处理。然而，醋酸酐的解决方案，使用前和蛋白酶是在使用时间的增加，需要立即准备。除非另有说明，所有步骤都在室温下进行。此外，所有的缓冲区，可作为原液的10倍浓度的准备。- 温暖在容器中的蛋白酶缓冲液（100毫米的Tris pH值8.0，50 mM的EDTA）至37 ° C。
- Deparaffinize和如下补充水分的组织切片：
- histoclear - 10分钟（使用玻璃盘）
- histoclear - 10分钟（使用玻璃盘）
- 100％的乙醇 - 1分钟
- 100％的乙醇 - 30秒
- 95％的乙醇 - 30秒
- 85％的乙醇 - 30秒
- 70％的乙醇 - 30秒
- 50％的乙醇 - 30秒
- 30％的乙醇 - 30秒
- 10％的乙醇 - 30秒
- milliQ H 2 O - 1分
- 在1X PBS孵育2分钟。
- 50mg/ml蛋白酶625μl混合250毫升蛋白酶缓冲液预热至37 ° C孵育20分钟的幻灯片，在37 ° C。
注：蛋白酶消化固定的蛋白质和增加细胞的RNA的探针访问。控制孵化时间，最大限度地无击穿组织的杂交信号，这一点至关重要，因此一些优化可能需要为每个组织样本。 - 中为2分钟的1X PBS在0.2％甘氨酸的蛋白酶活性。
- 2分钟一次1X PBS冲洗幻灯片。
- 对待我的幻灯片N 4％PFA解决方案，10分钟重新修复这可能是由蛋白酶处理损坏的RNA。
- 幻灯片1X PBS冲洗两次，每次2分钟。
- 虽然幻灯片在PBS洗，弥补由236.25毫升milliQ H 2 O 12.5毫升2M三乙醇胺（29.8克于100ml milliQ H 2 O，用HCl pH8.0）混合成250毫升0.1 M的三乙醇胺溶液的pH值8.0在一个玻璃盘。立即敷上幻灯片中加入三乙醇胺缓冲1.25毫升醋酸酐，并炒匀。添加的幻灯片后，继续慢慢搅拌10分钟。
这就要求，三乙醇胺/醋酸酐的容器高架滑动机架。我们用夹紧系统支持的立场。
注：在这一步，带正电荷的氨基酸组，可能会导致非特异性探针结合乙酰化的。此外，醋酸酐是有毒的，因此这个解决方案应该准备在通风橱和妥善处理<。/ LI> - 在1X PBS冲洗两次的幻灯片为2分钟。
- 再次脱水组织切片：
- H 2 O - 1分
- 10％的乙醇 - 30秒
- 30％的乙醇 - 30秒
- 50％的乙醇 - 30秒
- 70％的乙醇 - 30秒
- 85％的乙醇 - 30秒
- 95％的乙醇 - 30秒
- 100％的乙醇 - 30秒
- 100％的乙醇 - 30秒
- 杂交
- 温加热块到85 ° C。
- 准备杂交缓冲。 10毫升，混合在一个猎鹰管原位杂交盐1.25毫升（3M氯化钠，100MM的Tris - HCl pH值8.0，100MM娜pH6.8磷酸盐，50MM EDTA），5毫升去离子甲酰胺，2.5毫升50％硫酸葡聚糖，250登哈特μL50X，125μL100mg/ml的tRNA，875μLH 2 O <BR />注：硫酸葡聚糖是非常粘稠，所以最好是预热至60℃使移液更容易。杂交缓冲液可在-20 ° C存储
- 准备不同的探头。为每个幻灯片，9μLmilliQ H 2 O和10μL去离子甲酰胺混合1μL探头。探头的温度在85 ° C为2-3分钟，立即在冰上，短暂离心，80μl杂交缓冲每张幻灯片添加探头的寒意。拌匀吹打，但要避免使气泡。
注：每张幻灯片添加量探头需要实证检验。一般来说，探头用于在终浓度为0.5纳克/ KB /μL探针复杂。由于100μL每张幻灯片进行杂交，需要约25探头吴为0.5 - kb的长度和1 kb的长探头50每张幻灯片的探头吴的探针，每张幻灯片。为了简单起见，我们经常尝试0.5，1，4μL探针每张幻灯片。 - 放置在一个幻灯片干净的表面，让他们的空气完全干燥5-10分钟。吸管上的幻灯片的右边缘的探针/杂交缓冲组合。逐步降低一个盖玻片上的幻灯片;确保杂交的解决方案涵盖的所有部分，没有任何气泡。气泡的形式，以取代他们从所有组织切片用手指轻轻点击盖玻片。不要拉盖滑开，因为这将损坏的部分。
注：这一步常用的另一种方法是准备两个相同的探针孵育的幻灯片的“三明治”。对于这种方法的更多细节，请参阅文献。 14。 - 准备一个完全平坦的塑料盒中湿度室。封面的Whatman纸框底部milliQ水浸湿，盖上纸封口膜离开角落发现;放置在塑料盒中的幻灯片，并紧紧密封的盒。
- 孵育的幻灯片所需的杂交温度，一般为50 - 55 ° C，F或16-20小时。
- 使用第二天早上，准备1公升0.2X SSC和存储这在55 ° C此外，准备1公升的NTE缓冲液（0.5 M氯化钠，10毫米的Tris - HCl PH7.5，1毫米EDTA pH8.0）和存储在37 ° C。
- 杂交后处理
- 取出盖玻片小心不损坏的部分。放置在机架的幻灯片和洗两次在0.2X SSC在55 ° C一小时。
注：盖玻片往往容易脱落的幻灯片时直立放置。如果盖玻片保持连接1或2分钟，沉浸在温暖的0.2X SSC的幻灯片冲洗盖玻片。避免拉扯盖玻片的幻灯片，因为这可能会造成损坏的部分。 - 在此期间，准备500毫升的洗涤液（1％BSA的TBS缓冲液，0.3％TRITON）和100毫升封闭液（0.5％阻塞在TBS缓冲液试剂）。搅拌到TBS的阻塞粉末，慢慢加热至70℃，让它冷却到室温，一旦溶解编辑。
注：洗涤液和阻塞会有所不同的解决方案需要在步骤4.3.8 -11中使用的平面塑料框的大小取决于卷。这将需要一些时间完全溶解海神，所以提前准备足够的解决方案。 - 1X新界东2分钟平衡的幻灯片。
- 核糖核酸酶继续治疗转移到1X的NTE缓冲20μg/ml核糖核酸酶A加前使用，37 ° 30分钟的彗星。幻灯片
注：核糖核酸酶A切割免费的单链RNA的RNA双链的不匹配以及。此步骤有助于减少非特异性探针结合的水平，作为最后0.2X SSC洗（见4.3.6）被冲裂探测片段。 - 幻灯片冲洗两次，每次2分钟，在1X新界东。
- 在55 ° C一小时，洗净新鲜0.2X SSC的幻灯片。
- 在室温下5分钟的平衡1X PBS的幻灯片。
- 日从机架上传输幻灯片发送一个单位的塑料盒的底部，并用最小的封闭液量覆盖。座慢慢晃动平台上的45分钟的幻灯片。
- 幻灯片转移到第二个干净平坦的塑料盒，洗为45分钟，洗涤用颤抖的平台上的缓冲区。
- 继续抗体孵育。在洗涤液（1:5 V / V）稀释抗地高辛抗体，并申请一个最小的体积，直接到每张幻灯片或放置到一个平面的塑料盒中的幻灯片，并覆盖它们的抗体溶液的最小体积。在黑暗中的幻灯片在室温下2-3小时或过夜孵育4 ° C。
- 清洗洗衣机摇动平台的缓冲区每15分钟的幻灯片的4倍。使用的洗涤液和一个单位的塑料盒的最小量。之间的每个洗清洁的塑料盒。
注：清洁洗箱之间将减少在幻灯片上的大背景下。为了简化此，我们使用两个相同的扁平盒子每次冲洗后转移到一个干净的框的幻灯片。 - 2分钟，转移到1X TBS的幻灯片。
- 在TN缓冲液平衡的幻灯片两次，每次2分钟。
- 准备立即使用前加入20μL的NBT / BCIP每1毫升的TN缓冲染色的解决方案。倒在一个小塑料称重菜的染色溶液。夹心两个一起面对对方的部分幻灯片。 DIP的一个解决方案中的“三明治”的长边，使毛细作用向上拉的解决方案。漏Kimwipe幻灯片，再次填补抗体溶液的幻灯片。您可能需要挖掘作为解决方案，以避免气泡流动的幻灯片。放置在室温在黑暗中的塑料盒和存储的幻灯片。
- 第10天到15天：刷新两次为1-5天，每天在TN缓冲液冲洗的幻灯片，并准备新的三明治，含有新鲜的染色溶液的染色溶液。
注：更换定期INT染色解决方案ervals将改善的信号背景比。化合物或立体显微镜下可以监视信号的发展。它可以拍摄的部分，而他们在TN缓冲间发染色，或一旦被转移到水之前永久安装。
- 取出盖玻片小心不损坏的部分。放置在机架的幻灯片和洗两次在0.2X SSC在55 ° C一小时。
- 安装
- 一旦信号是显而易见的，在milliQ H 2 O冲洗幻灯片，他们迅速通过乙醇脱水：
- 10％的乙醇 - 10秒
- 30％的乙醇 - 10秒
- 50％的乙醇 - 10秒
- 70％的乙醇 - 5秒
- 80％的乙醇 - 5秒
- 95％的乙醇 - 5秒
- 100％的乙醇 - 5秒
- histoclear - 2分钟
- histoclear - 2分钟
- 放置在每一个或两个滴甲苯为基础的安装介质装入幻灯片下滑E和避免形成泡沫的幻灯片缓慢地降低到盖玻片。让的安装介质变硬之前分析的复合显微镜下的结果一夜之间。一旦安装，幻灯片，可存放在室温下年。
- 一旦信号是显而易见的，在milliQ H 2 O冲洗幻灯片，他们迅速通过乙醇脱水：
5。代表性的成果：
经过1-5天，一个紫红色的信号将发展在这些细胞探针杂交互补成绩单（图1）。彩色信号，从而提供直接可视化感兴趣的基因表达模式的蜂窝解决。疲软的背景染色也可能发展，从而导致从非特异性结合的探针或植物组织染色（图3）。在这样的背景下信号可能是比较显着小的，不太确定的组织细胞，但背景染色阴性和阳性对照探针杂交的部分也可以观察到，不会实验重复性之间。
图1。代表取得的成果对拟南芥和玉米组织不同的探头 。 原位杂交拟南芥 （AD）和玉米（EH）的组织与不同的基因的具体说明的上述协议的成功完成后，可预期的结果类型的探头。 （一）SHOOTMERISTEMLESS1在拟南芥植物的茎尖（STM）的本地化;注意紫色蓝色信号的分生组织和缺乏的信号在周围的树叶不确定细胞的存在。 （BD）第显示CLAVATA3在为数不多的胚胎干细胞（二）表达拟南芥的鱼雷阶段胚胎，AtML1（三）在表皮细胞层的表达，而缺乏的部分信号探测与随机阴性对照RNA （四）。 （五）在发展玉米胚STM同源knotted1本地化;注意，特别是在胚胎分生组织和根的强烈信号。通过显示arf3a（F）和ocl4（G）的原位杂交模式不同的营养茎尖玉米和没有杂交信号探针（H）为阴性对照（FH）的纵向部分。 arf3a表示的背面/底部的叶面上，而AtML1同源ocl4特别表现在表皮。
下面的基因片段为探针：STM：地区包括81个氨基酸的cDNA - 382，其中包括保守的同源 ; CLV3：全长cDNA; AtML1：第三外显子 ; KN1：整个开放阅读框 ; arf3a： 9 - 225核苷酸，cDNA克隆HM004539; ocl4：3'1.7 kb的全长cDNA，其中包括一些保守的蛋白结构域。
图2。检查点，而在体外转录探针。 （一） 在原位杂交探针进行检查后，在体外转录在一个标准的琼脂糖凝胶（A），后DNA酶在体外转录反应（B）的治疗和后续的纯化后，碳酸水解，如果需要（C），当准备使用（D）。对于长度超过250个基点，如探头1，探头，碳酸水解会产生一个更小的探针片段（支架）的范围。 （二）比色法定量探针斑点杂交分析。稀释上发现一个转膜与抗地高辛抗体孵育，范围从10 -1 10 100 ng /μL的控制探头（1）-5和三个新高辛标记的探针（2-4），并测定使用协议2.3条所述的比色法。分析表明估计浓度如下：探头2〜100纳克/μL;探头3〜10 ng /μL的探头4〜1 ng /μL的。探头4是不可能产生一个良好的原位杂交信号。
图3。非特异性探针的比较良好的工作探头。通过纵向部分玉米的营养枝先端显示一个非特定的背景信号（A）和外细胞层（二）OCL5探针的原位杂交信号的具体。
图4。图表显示原位杂交协议中的步骤的时间表。组织包埋步骤表示绿色，探头准备在橙色的步骤，并在蓝色的原位杂交步骤。这时间轴认为的DNA templa探头在体外转录TE是可用的。石蜡包埋组织块和地高辛标记的探针，可以事先准备和保存于4 ° C和-80℃，分别，直到使用时间。 原位杂交协议，然后可以在短短4天完成。
Discussion
这里列出的原位杂交方法允许任何感兴趣的基因的时空表达模式的直接可视化的伟大细胞高分辨率，高灵敏度和特异性。该协议不允许之间的基因表达水平的定量比较。然而，该方法的高灵敏度和分辨率，可以揭示一个组织8，18，这是不与其他方法分析基因表达的最可能的基因表达梯度。
该协议包括许多步骤，它可以使故障排除问题。该协议的最重要的步骤是固定的组织和探头的选择和标签。低渗透组织和辛掺入低探头将产生非常微弱的信号，可能很难检测到上述背景。为每个感兴趣的新基因，它是明智的尝试从diffe派生的几个不同的探头租金地区的成绩单。有时候，可能需要两个或三个探测器，针对不同的小区域的基因结合，以获得一个强大的和特定的杂交信号。此外，杂交条件，如温度和杂交缓冲液组成，，可以优化每个基因或组织，以降低或增加杂交紧缩。蛋白酶处理步骤是一个变量，可以改变，以适应不同植物物种或成绩单非常低丰度的检测协议。列入正反两方面的控制探头将有助于查明问题的协议。
石蜡包埋植物组织切片，但稍作修改， 可以在原位杂交用于整个安装过程优化。虽然广泛用于原位杂交动物研究19日 ，整装将升imited到植物组织中，可以很容易地渗透，如胚胎，根或年轻的分生组织20,21。该协议还可以很容易地修改，同时检测两种截然不同的mRNA或本地化一起蛋白 15,22,23的成绩单。最后，它有可能延长这种方法的应用，小分子RNA在植物中的表达模式的可视化。 miRNA表达模式已经确定使用在玉米和拟南芥8,14本议定书。最近， 在体外转录探头已经取代市售高辛标记的锁核酸（LNA），寡核苷酸探针，提高信号灵敏度18，24。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在实验室吨的研究是由国家科学基金会（DBI - 0820610和IOS - 1022102）和纽约州卫生署（NYSTEM C024308）的赠款支持。 CM收到来自西班牙教育和科学部（2007-0937）和基金会拉斐尔 - 皮诺，西班牙部博士后。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
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