Summary
L'
Abstract
Avec les progrès de la recherche en génomique de la dernière décennie, la biologie végétale a vu de nombreuses études à grande échelle présentant des analyses quantitatives de l'expression génique. Microarray et à côté des approches séquençage de nouvelle génération sont utilisées pour étudier les processus d'intervention de développement physiologique et le stress, épigénétique et décortiquer les petites voies d'ARN, et construire des réseaux de gènes de régulation de grandes 1-3. Bien que ces techniques facilitent l'analyse simultanée des ensembles de gènes importants, ils fournissent généralement une résolution très limitée spatio-temporelle des changements d'expression génétique. Cette limitation peut être partiellement résolu en utilisant soit la méthode de profilage en conjonction avec lasermicrodissection ou fluorescence-activated tri cellulaire 4-7. Cependant, pour comprendre pleinement le rôle biologique d'un gène, la connaissance de son modèle spatio-temporelle de l'expression à une résolution cellulaire est essentielle. En particulier, lorsque l'on étudie le développement ou les effets environnementaux des ISTmuli et mutants peuvent l'analyse détaillée de profil d'expression d'un gène est devenu indispensable. Par exemple, de subtiles différences quantitatives dans les niveaux d'expression de gènes clés de réglementation peuvent conduire à des phénotypes spectaculaires lorsqu'ils sont associés à la perte ou le gain d'expression dans des types cellulaires spécifiques.
Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour l'examen détaillé des profils d'expression génique. L'une est à travers l'analyse des lignes de journaliste transgéniques. Une telle analyse peut cependant devenir fastidieuse lorsque l'on analyse les gènes multiples ou travaillent dans des usines de transformation aux récalcitrants. Par ailleurs, une validation indépendante pour s'assurer que le profil d'expression des transgènes imite celle du gène endogène est généralement requis. Localisation de la protéine par immunohistochimie ou ARNm par hybridation in situ présenter des alternatives relativement rapide pour la visualisation directe de l'expression des gènes dans les cellules et les tissus. Ce dernier a l'avantage qu'il peut être facilement used sur n'importe quel gène d'intérêt. L'hybridation in situ permet la détection des ARNm dans les cellules cibles par hybridation avec un anticorps anti-sens sonde ARN obtenu par transcription in vitro du gène d'intérêt.
Nous exposons ici un protocole pour la localisation in situ de l'expression génique dans les plantes qui est hautement sensible et spécifique. Il est optimisé pour une utilisation avec fixes paraformaldéhyde et inclus en paraffine sections, qui donnent une excellente conservation de l'histologie et les sondes DIG-étiquetés qui sont visualisées par immuno-détection et la phosphatase alcaline réaction colorimétrique. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus à partir d'un large éventail d'espèces de plantes, et peut être utilisé pour analyser l'expression des ARNm ainsi que les petits ARN 8-14.
Protocol
1. La préparation des échantillons
Remarque: Toutes les étapes jusqu'à et y compris l'étape d'hybridation sont sensibles à l'activité RNAse. Il est donc essentiel de travailler dans des conditions propres. Il est également assez courant de faire toutes les solutions sans RNase en utilisant de l'eau traitée au DEPC et la verrerie cuite au four à 180 ° C pendant au moins 3 heures. Les récipients en plastique sont souvent nettoyées par traitement avec NaOH 0,2 N pendant 30 min. Cependant, aucune de ces précautions sont indispensables et nous utilisons habituellement nettoyage régulier milliQ H 2 O pour toutes les solutions. Nous gardons les réactifs séparés, les boîtes et verrerie pour les hybridations in situ et de les conserver dans une armoire propre.
- Fixation de l'échantillon
- Jour 1: Préparer une solution fraîche 4% de paraformaldéhyde (PFA) fixatif. Pour 500 ml, 400 ml chaude 1x PBS (130 mM de NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH 7,0) à 60 ° C et de dissoudre deux pastilles de NaOH. Dans une hotte, ajouter 20 g de paraformaldehyde et bien mélanger jusqu'à dissolution. Placer la solution sur la glace et lorsqu'il est refroidi, ajuster le pH à 7,2 avec H 2 SO 4 (1-2 gouttes pour 100ml). Puis ajuster le volume à 500 ml avec du PBS 1X.
Note: Ne pas utiliser HCl pour ajuster le pH car cela libère des fumées hautement toxiques. Paraformaldéhyde est toxique; cette solution devrait donc être préparé en une hotte et éliminés de façon appropriée. Aussi, le paraformaldéhyde est stocké à 4 ° C et doit être acheté neuf tous les 6 - 9 mois. - Récolte des échantillons de tissus et de les placer immédiatement dans 15 ml PFA fixateur frais sur la glace dans des flacons à scintillation en verre. Si la dissection des tissus est nécessaire, il est préférable de faire sur la glace dans un fixateur froid.
Note: Il est important d'utiliser un large excès de fixatif. Le rapport général est recommandé d'utiliser 10 volumes de fixateur pour 1 volume de tissu. - Appliquer un vide (~ 500 mm Hg) pour les échantillons tout sur la glace. Tenir un vide pendant 15-20 minutes; petites bulles devraient libérer de l'échantillons, mais le fixateur ne devrait pas venir à ébullition. Couper le vide lentement, et de renouveler le fixateur PFA pour assurer le fixateur reste à la bonne concentration. Répétez cette étape jusqu'à ce que les tissus couler après la libération du vide.
Remarque: La fixation est nécessaire de fixer et de cross-link molécules d'ARN dans le tissu. Cette étape est essentielle, car les matériaux mal fixés donner un signal faible. Certains tissus ne tombent pas immédiatement, mais la plupart des finira couler toute la nuit. Pour améliorer l'infiltration du fixateur, les détergents suivants peuvent être ajoutés: Triton de 0,1% et / ou Tween à 0,1 - 0,3%. Alternativement, l'éthanol à base de fixateurs, tels que le formaldéhyde-alcool-acide acide (FAA), peut être utilisé pour des tissus qui sont autrement pas facilement infiltré 14,15. - Remplacer le fixateur PFA fois de plus et de garder les flacons à 4 ° C pendant la nuit.
- Jour 1: Préparer une solution fraîche 4% de paraformaldéhyde (PFA) fixatif. Pour 500 ml, 400 ml chaude 1x PBS (130 mM de NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH 7,0) à 60 ° C et de dissoudre deux pastilles de NaOH. Dans une hotte, ajouter 20 g de paraformaldehyde et bien mélanger jusqu'à dissolution. Placer la solution sur la glace et lorsqu'il est refroidi, ajuster le pH à 7,2 avec H 2 SO 4 (1-2 gouttes pour 100ml). Puis ajuster le volume à 500 ml avec du PBS 1X.
- Enrobage des tissus
- Jour 2: pré-refroidir 1x PBS et la série d'éthanol à 4 ° C.
- Rincez le twi échantillonsCE pour 30 minutes chacun dans du PBS 1X, sur la glace.
Remarque: Encore une fois, il est recommandé d'utiliser un large excès de chaque solution. - Déshydrater les échantillons en les prenant par une série d'éthanol, sur la glace, comme suit:
- 10% d'éthanol 30 min,
- 30% d'éthanol 30 min,
- 50% d'éthanol 1 heure,
- 70% d'éthanol 1 heure,
- 85% d'éthanol 1 heure,
- 1 heure 95% d'éthanol,
- 3 changements d'éthanol à 100% pour 1 heure de chaque
- A la fin de la journée, de remplacer l'éthanol par Eosine 0,1% dans l'éthanol à 100% pendant une nuit à 4 ° C. Taches Eosine la paroi cellulaire rendant les échantillons plus visible pendant l'enrobage et de sectionnement.
Notes: Les délais indiqués ici ont été optimisés pour des blocs de 3x3x3 mm, mais plus d'incubations peuvent être nécessaires pour les grands échantillons.
Les échantillons peuvent être conservés dans l'éthanol 70% à 4 ° C pendant plusieurs mois. Jour 3: Le lendemain matin, chaud les échantillons à température ambiante pendant une heure. Puis remplacez l'éthanol progressivement avec histoclear comme suit:
- A la fin de la journée, ajouter du volume 1 / 4 de Paraplast plus les puces et le lieu le flacon dans un four à 60 ° C. Remplissez également un bécher avec des frites et de reconstituer ce Paraplast fréquemment afin de toujours avoir de la cire fondue fraîche à portée de main.
Remarque: La température du four est de chauffage importante et prolongée du Paraplast-dessus de 60 ° C doivent être évitées. - Jour 4: remplacer progressivement les histoclear avec Paraplast en ajoutant régulièrement de puces de paraffine plus (chaque heure). A la fin de la journée, verser délicatement le mélange hors histoclear / cire et la remplacer immédiatement par la cire fondue pure. Laisser les échantillons à 60 ° C pendant la nuit.
- Jours 5 et 6: Changer les 3 Paraplast fois par jour, environ toutes les 4 heures, avec de la cire fondue fraîche gardant le sples à 60 ° C.
Note: Il est possible de changer la cire une fois par jour, mais la préparation des tissus prendrait quelques jours supplémentaires pour terminer, que la cire doit être changé au moins 5 ou 6 fois. Infiltration sous vide des échantillons de tissu lorsque ces derniers sont en 100% EtOH et / ou dans de la cire peut encore améliorer l'infiltration et enrobage des tissus. Infiltration sous vide des échantillons dans de la cire doit être fait à 60 ° C. - Jour 7: Changement de la cire une fois de plus. L'odeur de histoclear devrait maintenant être complètement disparu et les échantillons peuvent être intégrés plus tard dans la journée.
- Mettre en place une plaque chauffante grande à 60 ° C protégé par du papier aluminium.
- La méthode d'intégration varie selon le type de tissu à analyser. Le point le plus important à cette étape est de s'assurer que les échantillons sont correctement orientés pour la coupe plus tard. Une façon est d'utiliser des moules en plastique et des bagues. Réchauffer les moules sur la plaque chauffante et verser la cire fondue dans la partie inférieure du moule. Transfertun échantillon de tissu dans le moule avec une pince chauffée et l'orienter dans la position souhaitée. Placez l'anneau blanc sur le moule et ajouter de la cire fondue supplémentaires tels que les tissus sont complètement couverts. Soigneusement déplacer le moule de la plaque sur le banc. Laissez la cire refroidir graduellement.
Une autre possibilité est de distribuer tous les échantillons dans une boîte de Pétri contenant de la cire fondue (les échantillons doivent être entièrement recouverts par de la cire) tout en travaillant sur la plaque de 60 ° C réchauffée. Orienter les échantillons avec une pince au chaud. A la fin, éteindre la plaque. Lorsque la cire est solidifiée, la boîte de Pétri peut être déplacé vers le banc et ensuite stocker à 4 ° C. Lorsque vous êtes prêt pour la coupe, de petits blocs contenant un échantillon de tissu peut être coupé de la boîte de Pétri avec une lame chauffée et monté sur un support d'échantillon microtome avec une baisse supplémentaire de cire fondue. Laissez durcir l'échantillon pendant quelques minutes avant de sectionner.
Remarque: Les blocs peuventêtre conservés à 4 ° C pendant 1 an ou plus. Pour obtenir d'autres conseils utiles sur la fixation des tissus et d'incorporation, voir réf. 16
2. La préparation de la sonde
- Le clonage
Les sondes sont généralement générées à une ou plusieurs régions spécifiques du gène d'intérêt. Séquences hautement répétitives devraient être exclus de la sonde, mais les séquences correspondant aux domaines protéiques conservés, comme l'ADN dans les motifs de liaison des facteurs de transcription, typiquement donnera les modèles d'expression génique spécifiques 8,9,12,15 (Fig. 1). Ceci parce que la RNase Un traitement dans les étapes post-hybridation (voir ci-dessous) réduit le niveau de la sonde d'hybridation croisée entre les membres de la famille des gènes. RNAse A clive au niveau discordances dans un duplex ARN, les sondes hybridées à fragmenter les transcriptions avec une complémentarité imparfaite, qui sera lavé dans les étapes ultérieures.
En général, plusieurs sondes peuvent avoir besoin d'être testés pour chaque gène d'intérêt. Les sondes peuvent être aussi courts que 150 bases de longueur. Although il n'ya aucune limite à la longueur de la sonde, fragments plus courts, puis de 1,5 kb généralement transcrivent mieux. Des fragments d'ADN à transcrire sont clonées dans un vecteur contenant T3, T7 ou SP6 promoteurs (par exemple pCRII-TOPO, Invitrogen). Alternativement, T3, T7 ou SP6 séquences promotrices peuvent être inclus comme un 5'-queue sur l'amorce inverse utilisée pour amplifier la région de la sonde.
Dans chaque expérience en hybridation in situ, nous incluons une sonde contrôle positif pour lequel le schéma d'hybridation est connu et qui fonctionne de manière cohérente, ainsi que d'un contrôle négatif (figure 1D et H). Celle-ci pourrait être une sonde aléatoires d'ARN qui est connu pour ne pas s'hybrider avec les transcriptions dans le tissu d'intérêt. Bien qu'il soit courant d'utiliser la sonde sens du gène en cours d'analyse, ce n'est pas nécessaire et toute l'ARN non-hybridation sera fonction de l'objectif. Si disponibles, les tissus d'un allèle nul de transcription du gène d'intérêt serait un excellent contrôle négatif. - Linéariser le plasmide par digestion d'environ 5 ug d'ADN par une enzyme de restriction qui digère à la fin de l'insert en face du site du promoteur. Ne pas utiliser des enzymes de restriction qui laissent une 3'-faux. Cela peut conduire à des artefacts de transcription parce que la polymérase peuvent utiliser surplombent la 3 'en tant que substrat pour continuer la transcription. Sinon, la région de sonde dont le T3, T7 ou SP6 promoteur peut être amplifié par PCR pour générer la matrice d'ADN in vitro pour la réaction de transcription in.
- Vérifiez une aliquote sur un gel de vérifier que la réaction est allé à son terme.
- Extrait l'ADN avec du phénol / chloroforme, précipité avec l'éthanol et remettre le culot d'ADN dans les milliQ H 2 O à une concentration de 1μg/μl. Alternativement, l'ADN peut être nettoyée en utilisant la norme colonnes de purification d'ADN.
- Configurez la réaction de transcription in vitro en mélangeant:
- 1 microlitre PUrified ADN (1μg/μl)
- 2μl tampon de transcription 10x
- 2 ul 10x DIG ARN étiquetage mélangez
- 1 microlitre RNAse OUT
- 2μl T3, T7 ou SP6 ARN polymérase (20 U / pl)
- H 2 O à 20 pi.
Incuber à 37 ° C pendant 1 à 2 heures. Gardez 1 microlitre d'analyser sur un gel plus tard.
Remarque: Les sondes marquées par fluorescence sont préférés dans les systèmes animaux, mais en raison de la haute auto-fluorescence des tissus les plus centrale, dans les protocoles d'hybridation in situ les plantes utilisent des sondes radiomarquées 17 ou plus communément DIG-sondes marquées qui sont détectés par immunohistochimie. - Retirer la matrice d'ADN en ajoutant 75 uL MilliQ H 2 O et 5 pi RQ1 DNAse (1 U / pl) à la réaction de transcription et l'incubation de la réaction à 37 ° C pendant 10 min.
- Purifier la réaction dans la transcription in vitro afin d'éliminer les nucléotides non incorporés et les transcriptions de petite taille. Une posbilité est d'utiliser une taille d'exclusion Sephadex ® colonne, tel que le mini rapide Colonnes ARN Spin (Roche). Alternativement, la réaction de transcription peut être purifié par un procédé classique de LiCl / éthanol précipitations (voir réf. 14). Gardez 1 microlitre de vérifier sur un gel plus tard.
- Sondes plus de 250 bases de longueur sont habituellement partiellement hydrolysées pour obtenir des molécules d'ARN d'environ 150 nt et donc assez petit pour pénétrer efficacement les coupes de tissu. Ajouter un volume égal de tampon carbonate 2x (80 mM NaHCO 3, 120 mM de Na 2 CO 3) à la réaction de transcription purifiés et incuber à 60 ° C. Le temps d'incubation doit être calculée par la formule suivante:
= temps (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
où Li = longueur sonde initiale (en ko); Lf = longueur de sonde final (0.150 kb); K = 0,11 kb / minute. Gardez 2 uL de vérifier sur un gel. - Neutraliser la réaction d'hydrolyse en ajoutant du volume 1 / 20 de l'acide acétique à 10%.
- La sonde est ensuite puriFied en ajoutant 1 microlitre d'ARNt (100mg/ml), 1 / 10 du volume 3M NaAc pH 5,2, et 2,5 volumes d'éthanol froid à 100%, et l'incubation à -80 ° C pendant 30 min. Précipiter l'ARN par centrifugation à 13500 rpm pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et rincer le culot d'ARN avec de l'éthanol 500μl de 70%. Centrifuger de nouveau, laissez-le culot de l'air sec (généralement environ 15 min), et remettre l'ARN dans 50 pl de formamide désionisée 50%. La sonde doit être conservé à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Vérifiez régulièrement 1% TAE-gel d'agarose du produit final ainsi que des produits intermédiaires à partir des sections 2.2.4, 2.2.6 et 2.2.7 (figure 2A). Ceci permet le suivi de l'efficacité de la réaction de transcription in vitro.
Note: La réaction de transcription in vitro devrait produire environ 1 ug d'ARN par 1 ug du modèle. - Dot Blot Analyse
La concentration de la sonde et DIG-UTP incorporation peut être évaluée par l'analyse dot blot (figure 2B). Serial RDilutions NA sont déposés sur une membrane standard d'hybridation aux côtés d'un ARN de contrôle étiquetée de concentration connue. Par exemple, nous utilisons la DIG-UTP étiquetés de contrôle sonde ARN inclus dans le kit de transcription in vitro (Roche). Il est préférable de tester des dilutions multiples pour chaque sonde pour établir une concentration précise.- Préparer un tampon de blocage en dissolvant 0,5% de réactif de blocage dans le tampon TBS 1x (100 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM) à 70 ° C, puis laisser la solution refroidir à température ambiante.
- 1 microlitre spot de dilutions en série (typiquement 10 -1 à 10 -5) des sondes transcrit in vitro et de contrôle sur une membrane de nylon N +. Fixer l'ARN par réticulation UV.
Remarque: Une surface minimale de la membrane doit être utilisé pour réduire le volume de tampons nécessaires plus tard. - Equilibrer la membrane en 1x TBS pendant 5 min à température ambiante (TA) sur une table d'agitation.
- Bloc de la membrane en utilisant le blocagemémoire tampon pendant 30 min à température ambiante sur une table d'agitation.
- Rincer la membrane en 1x TBS pendant 5 min.
- Incuber la membrane avec anticorps anti-DIG, la dilution de 1 microlitre d'anti-digoxigénine-AP dans 10 ml de 1x SCT, pendant 45 min à température ambiante.
- Lavez la membrane à deux reprises en 1x TBS pendant 15 min chacune.
- Equilibrer la membrane dans un tampon TN 1x 100 mm (Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl) pendant 5 min.
- Tache de la membrane par une incubation avec le NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) en 1x TN tampon. La coloration peut prendre 5-10 min. Ensuite rincez la membrane avec de l'eau, il peut alors être séché et conservé comme un record.
Note: NBT / BCIP est un substrat pour la phosphatase alcaline conjuguée à l'anticorps anti-DIG que lors de l'hydrolyse produit un colorant bleu foncé.
3. Sectionnement
- Chauffer le bloque à la température ambiante. Si les blocs sont trop froids, des sections individuelles peuvent rouler sur sans former «ruban» de la cire. Coupez le bloc dans une trapeforme Zoid laissant environ 1mm de cire autour de l'échantillon.
- Warm up un grand toboggan chaud à 35-37 ° C.
Remarque: De nombreux protocoles faire cette étape à 42 ° C pour autant réduire la température à 35-37 ° C empêche la formation de bulles sous les sections. - Placez le bloc sur le microtome de telle sorte que le plus long des deux faces parallèles est en bas. Ramener ensuite avec précaution le bloc vers l'avant de la lame et assurez-vous que la surface du bloc est parallèle à la lame. Section à une épaisseur de 8 - 10 microns. Les rubans de cire peuvent être alignés sur une surface non collante, comme du papier d'aluminium ou de papier filtre, de sélectionner les sections d'intérêt. Ceci peut être évalué à l'aide d'un microscope à proximité de dissection.
Note: La coloration à l'éosine du tissu donne une indication si les tissus ont été correctement infiltré pendant l'intégration. Si le centre du bloc n'est pas colorées à l'éosine cela indique généralement que le tissu est mal fixé. - Mark Probe-sur Plus SLides avec un crayon (la plupart des stylos ou marqueurs sont effacés lors de la au protocole d'hybridation in situ) et distribuer 1 ml d'eau propre milliQ H 2 O sur elle. Soigneusement flottent sections d'intérêt sur la surface de l'eau à température ambiante (il est plus facile de manipuler les sections sur l'eau lorsque l'on travaille à température ambiante). Assurez-vous que le côté brillant (le côté bas comme le ruban se détache du microtome) face à l'eau. Puis transférer le glisser lentement sur le réchauffement de diapositives. Chauffage aide les sections à se répandre sur la surface de l'eau. Après 5 min, versez l'eau avec soin mais dans un mouvement fluide, de sorte que le ruban est abaissée sur la lame. Laissez les diapositives sécher pendant au moins plusieurs heures ou une nuit à 37 ° C, de sorte que le tissu adhère.
Note: les tissus sectionnés peuvent être stockés dans une boîte avec de la silice déshydratant pour quelques jours à quelques semaines à 4 ° C, cependant, il est préférable d'utiliser les diapositives dès que possible.
4. Dans hybride situsation
- Section pré-traitement
Le volume requis pour chaque solution dépendra évidemment du nombre de diapositives à traiter et la taille du conteneur utilisé. Les sections doivent toujours être complètement immergé. Pour un rack de 25 diapositives et un récipient parfaitement raccord, 200-250 ml est suffisant. Parce que la plupart des étapes d'incubation est très courte, nous avons l'habitude de préparer toutes les solutions possibles en premier et ensuite lancer la lame pré-traitements. Cependant, la solution d'anhydride acétique devra être préparée immédiatement avant utilisation et la protéase est ajouté au moment de l'utiliser. Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante, sauf indication contraire. En outre, tous les tampons peuvent être préparées à une concentration 10x comme une solution stock.- Chauffer le tampon de la protéase (100 mM Tris pH 8,0, EDTA 50 mM) dans le récipient à 37 ° C.
- Déparaffiner et réhydrater les coupes de tissu comme suit:
- histoclear - 10 min (utiliser un plat en verre)
- histoclear - 10 min (utiliser unplat en verre)
- 100% d'éthanol - 1 min
- L'éthanol à 100% - 30 sec
- L'éthanol à 95% - 30 sec
- 85% d'éthanol - 30 sec
- L'éthanol à 70% - 30 sec
- 50% d'éthanol - 30 sec
- 30% d'éthanol - 30 sec
- 10% d'éthanol - 30 sec
- milliQ H 2 O - 1 min
- Incuber dans 1x PBS pendant 2 min.
- Mélanger 625μl de la protéase 50mg/ml dans 250 ml de tampon de protéase pré-chauffé à 37 ° C et incuber les lames pendant 20 min à 37 ° C.
Note: La protéase est nécessaire pour digérer les protéines fixes et accroître l'accès à la sonde ARN cellulaires. Il est essentiel de contrôler le temps d'incubation pour maximiser le signal d'hybridation sans dégradation des tissus, donc une certaine optimisation peut être requis pour chaque échantillon de tissu. - Neutraliser l'activité de la protéase dans 0,2% de glycine dans du PBS 1X pendant 2 min.
- Rincer les lames une fois dans du PBS 1x pendant 2 min.
- Traiter les diapositives in solution à 4% pendant 10 min PFA de re-fixer l'ARN qui pourraient être endommagés par le traitement de la protéase.
- Rincer les lames à deux reprises en 1x PBS pendant 2 min chacun.
- Alors que les lames sont dans le PBS lavages, forment 250 ml de 0,1 M pH 8,0 solution de triéthanolamine en mélangeant 12,5 ml de triéthanolamine 2M (29.8g dans 100ml milliQ H 2 O, pH 8,0 avec HCl) dans 236,25 ml H 2 O milliQ dans un plat en verre. Ajouter 1,25 ml d'anhydride acétique dans le tampon triéthanolamine immédiatement avant de mettre les lames dans, et bien mélanger. Après ajout de la glisse, continuer à remuer lentement pendant 10 minutes.
Cela nécessite que le support diapositive est élevée dans le récipient de triéthanolamine / anhydride acétique. Nous utilisons un système de serrage avec le stand de soutien.
Note: Dans cette étape, chargés positivement groupes amino qui peut conduire à une liaison non spécifique de la sonde sont acétylés. En outre, l'anhydride acétique est toxique; cette solution devrait donc être préparé en une hotte et éliminés de façon appropriée <./ Li> - Rincer les lames à deux reprises en 1x PBS pendant 2 min.
- Déshydrater les coupes de tissus à nouveau:
- H 2 O - 1 min
- 10% d'éthanol - 30 sec
- 30% d'éthanol - 30 sec
- 50% d'éthanol - 30 sec
- L'éthanol à 70% - 30 sec
- 85% d'éthanol - 30 sec
- L'éthanol à 95% - 30 sec
- L'éthanol à 100% - 30 sec
- L'éthanol à 100% - 30 sec
- Hybridation
- Chauffer un bloc chauffant à 85 ° C.
- Préparer le tampon d'hybridation. Pour 10 ml, mélanger dans un tube Falcon 1,25 ml en sels hybridation in situ (NaCl 3M, 100mm de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de phosphate de Na pH 6,8, EDTA 50 mM), 5 ml de formamide désionisée, 2,5 ml de sulfate de dextran à 50%, 250 ul 50x Denhardt, 125 pl 100mg/ml ARNt, et 875 ul de H 2 O. <br /> Remarque: le sulfate de dextran est très visqueux, il est donc préférable de préchauffer la solution à 60 ° C pour faire pipetage. Tampon d'hybridation peut être conserver à -20 ° C.
- Préparer les différentes sondes. Pour chaque lame, mélanger 1 sonde ul avec 9 ul milliQ H 2 O et 10 ul de formamide désionisée. La chaleur de la sonde à 85 ° C pendant 2-3 min, immédiatement refroidir sur glace, centrifuger brièvement et ajouter la sonde à 80μl de tampon d'hybridation par lame. Mélangez bien à la pipette, mais éviter de faire des bulles.
Remarque: Le montant de la sonde d'être ajoutée par diapositive doit être testée empiriquement. Généralement, les sondes sont utilisées à une concentration finale de 0,5 complexité sonde ng / kb / ul. Depuis hybridations sont réalisées avec 100 pi par diapositive, environ 25 ng de sonde est nécessaire par diapositive pour les sondes qui sont de 0,5 kb de longueur et 50 ng de la sonde par diapositive pour les sondes qui sont 1-kb de long. Pour plus de simplicité, nous essayons souvent de 0,5, 1 et 4 sondes ul par diapositive. - Placer les lames sur unesurface propre et laissez-les sécher à l'air complètement pendant 5-10 min. Déposer le mélange de tampon sonde / hybridation sur le bord droit de la diapositive. Peu à peu inférieure d'une lamelle sur la lame; s'assurer que la solution d'hybridation couvre toutes les sections sans bulles. Appuyez sur le lamelle légèrement avec le doigt là où des bulles se forment à les déplacer de toutes les sections de tissu. Ne tirez pas la couverture de glisser, car cela endommagerait les sections.
Remarque: Une autre méthode couramment utilisée pour cette étape est de préparer les «sandwichs» de deux lames qui sont incubées avec la même sonde. Pour plus de détails sur cette méthode, voir réf. 14. - Préparer une chambre d'humidité dans une boîte en plastique parfaitement plat. Couvrir le fond de la boîte avec du papier Whatman imbibé d'eau milliQ, couvert du papier avec du parafilm laissant les coins découvert; placer les diapositives dans la boîte en plastique et fermez la boîte hermétiquement.
- Incuber les lames à la température d'hybridation désirée, généralement 50 - 55 ° C, Fou 16-20 heures.
- Pour utiliser le lendemain matin, préparer 1 litre 0,2 x SSC et stocker ce à 55 ° C. En outre, de préparer une mémoire tampon NTE litre (0,5 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8,0) et conserver à 37 ° C.
- Post-traitement de l'hybridation
- Retirez les lamelles avec soin pour ne pas endommager les sections. Placer les lames dans un rack et les laver deux fois dans 0,2 x SSC à 55 ° C pendant une heure.
Note: Lamelles souvent tomber facilement quand les lames sont placées debout. Si la lamelle reste attaché, plongez la lame dans 0,2 x SSC chaude pour 1 ou 2 min pour laver la lamelle hors tension. Évitez de tirer sur la lamelle de la diapositive, car cela peut causer des dommages aux sections. - En attendant, préparer 500 ml de tampon de lavage (1% de BSA, le triton de 0,3% en tampon TBS) et 100 ml de solution de blocage (0.5% réactif de blocage dans un tampon TBS). Incorporer la poudre de blocage dans le SCT qui est lentement chauffé à 70 ° C et laisser refroidir à température ambiante une fois dissolvéd.
Remarque: Les volumes de tampon de lavage et de solution de blocage nécessaire varie selon la taille de la boîte de plastique plat utilisé dans les étapes 4.3.8 -11. Il faudra quelque temps pour dissoudre complètement Triton, afin de préparer suffisamment de solution à l'avance. - Equilibrer les diapositives de NTE 1x pendant 2 min.
- Passez à la RNAse Un traitement par le transfert des diapositives en 1x tampon NTE à laquelle 20μg/ml RNAse A est ajoutée juste avant utilisation, incuber à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque: la RNAse A clive gratuitement à ARN simple brin ainsi qu'à discordances dans un duplex ARN. Cette étape permet de réduire le niveau de la liaison non spécifique de la sonde, comme des fragments clivés sondé sont lavés dans le lave dernière 0,2 x SSC (voir 4.3.6). - Rincer les lames à deux reprises en 1x NTE pendant 2 min chacun.
- Laver les lames dans l'eau douce 0,2 x SSC à 55 ° C pendant une heure.
- Equilibrer les diapositives de 1x PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Placer les lames de la crémaillère sur ebas e d'une boîte de plastique plat et les couvrir avec un volume minimal de solution de blocage. Bloquer les diapositives pendant 45 min sur une plateforme secouant lentement.
- Placer les lames dans une seconde boîte en plastique plane et propre et lavez-les pendant 45 min avec du tampon de lavage sur une table d'agitation.
- Passez à l'incubation d'anticorps. Diluer l'anticorps anti-digoxigénine dans le tampon de lavage (1:5 v / v) et soit appliquer un volume minimal directement sur chaque diapositive ou le lieu de la glisser dans une boîte plate en plastique et les couvrir avec un volume minimal de solution d'anticorps. Incuber les lames dans l'obscurité pendant 2-3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Laver les lames 4 fois pendant 15 min chacun avec un tampon de lavage sur le secouant plateforme. Utiliser un volume minimal de tampon de lavage et une boîte en plastique plat. Nettoyer la boîte en plastique entre chacun des lavages.
Remarque: Le nettoyage de la boîte entre les lavages seront réduits au contexte général de la diapositive. Pour simplifier, nous utilisons deux identiques boîtes plateset le transfert de la glisse dans une boîte propre après chaque lavage. - Transférer les lames dans 1x TBS pendant 2 min.
- Equilibrer les lames dans un tampon TN à deux reprises pour deux minutes chacun.
- Préparer une solution de coloration immédiatement avant usage par addition de 20 ul NBT / BCIP pour 1 ml de tampon TN. Verser la solution de coloration dans un plat en plastique petite pesée. Sandwich deux diapositives avec les sections se font face. Trempez un côté long du sandwich dans la solution, permettant une action capillaire de remonter la solution. Égoutter les lames sur une Kimwipe et remplissez les lames avec une solution d'anticorps à nouveau. Vous pouvez avoir besoin pour exploiter les diapositives en tant que solution de flux pour éviter les bulles. Placer les lames dans une boîte en plastique et conserver à température ambiante dans l'obscurité.
- Jour 10 à Jour 15: Actualiser la solution de coloration fois par jour pendant 1-5 jours en rinçant les diapositives de TN tampon et la préparation des sandwiches contenant de nouvelles solution de coloration douce.
Remarque: Remplacement de la solution de coloration à l'int régulièreervals permettra d'améliorer le rapport signal à fond. Développement du signal peuvent être suivis dans le cadre d'un composé ou stéréo-microscope. Il est possible de photographier les sections alors qu'ils sont dans le tampon TN entre les deux tours de coloration ou une fois qu'ils sont transférés dans l'eau juste avant le montage permanent.
- Retirez les lamelles avec soin pour ne pas endommager les sections. Placer les lames dans un rack et les laver deux fois dans 0,2 x SSC à 55 ° C pendant une heure.
- Montage
- Une fois que le signal est évident, rincer les lames dans milliQ H 2 O et les déshydrater rapidement à travers une série d'éthanol:
- 10% d'éthanol - 10 s
- 30% d'éthanol - 10 s
- L'éthanol à 50% - 10 s
- 70% d'éthanol - 5 s
- 80% d'éthanol - 5 s
- L'éthanol à 95% - 5 s
- L'éthanol à 100% - 5 s
- histoclear - 2 min
- histoclear - 2 min
- Monter les préparations en plaçant un ou deux gouttes de base de toluène milieu de montage sur chaque glissée et lentement abaisser la lamelle sur la lame en évitant la formation de bulles. Laissez le milieu de montage durcir nuit avant d'analyser le résultat sous un microscope composé. Une fois monté, les diapositives peuvent être stockées pendant des années à température ambiante.
- Une fois que le signal est évident, rincer les lames dans milliQ H 2 O et les déshydrater rapidement à travers une série d'éthanol:
5. Les résultats représentatifs:
Après 1-5 jours, un signal rouge-pourpre se développera dans ces cellules où la sonde s'est hybridée aux transcriptions complémentaires (figure 1). Le signal de couleur fournit ainsi une visualisation directe à une résolution cellulaire de modèle de l'expression du gène d'intérêt. Une coloration plus faible de fond peuvent aussi se développer, résultant de la liaison non-spécifique de la sonde ou la coloration des tissus végétaux (figure 3). Signal de fond telle pourrait être relativement plus prononcée dans les petites cellules moins déterminé du tissu, mais la coloration de fond serait également observée dans les sections hybridées à des sondes de contrôle positif et négatif et ne serait pasêtre reproductible entre les expériences.
Figure 1. Les résultats représentatifs obtenus avec différentes sondes sur les tissus d'Arabidopsis et le maïs. Hybridations in situ d'Arabidopsis (AD) et le maïs (EH) avec des tissus distincts de gènes sondes spécifiques illustrant le type de résultats qui peuvent être attendus après la réussite du protocole décrit. (A) Localisation des SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) dans l'apex Arabidopsis tournage végétative; noter la présence du signal bleu violet dans les cellules du méristème indéterminée et l'absence de signal dans les feuilles environnantes. (BD) Sections d'Arabidopsis embryons au stade torpille montrant CLAVATA3 (B) l'expression dans les cellules souches embryonnaires quelques, AtML1 (C) l'expression dans la couche épidermique, et l'absence de signal dans les sections sondé avec un échantillon aléatoire de contrôle négatif d'ARN (D). (E) La localisation de la STM knotted1 homologue chez l'embryon de maïs en développement; noter le signal fort en particulier dans le méristème embryonnaire et la racine. (FH) Des sections longitudinales à travers les apex du maïs montrant distinctes dans les modes d'hybridation in situ arf3a (F) et ocl4 (G) et aucun signal d'hybridation de la sonde de contrôle négatif (H). arf3a est exprimée sur la surface des feuilles abaxiale / bas, tandis que le ocl4 AtML1 homologue est exprimé spécifiquement dans l'épiderme.
Les fragments de gènes suivants ont été utilisés comme sonde: STM: la région d'ADNc comprenant les acides aminés 81 à 382, ce qui inclut l'homéodomaine conservé; CLV3: l'ADNc pleine longueur; AtML1: le troisième exon; kn1: le cadre de lecture ouvert toute; arf3a: nucléotides 9-225 du clone d'ADNc HM004539; ocl4: 1,7 3 'kb de l'ADNc de pleine longueur, qui comprend plusieurs domaines protéiques conservés.
Figure 2. Vérification des points tout en faisant des sondes de transcription in vitro. (A) des sondes d'hybridation in situ sont vérifiés sur une norme gel d'agarose après transcription in vitro (a), après traitement à la DNase et la purification ultérieure de la réaction de transcription in vitro (b), après l'hydrolyse du carbonate-si nécessaire-(c) et quand prêt à l'emploi (d). Pour les sondes de plus de 250 pb de longueur, tels que la sonde 1, l'hydrolyse du carbonate donnera une gamme de petits fragments de sonde (support). (B) la quantification colorimétrique des sondes par analyse dot blot. Dilutions allant de 10 -1 à 10 -5 d'une sonde de contrôle à 100 ng / pl (1) et de trois nouveaux DIG-sondes marquées (2-4) sont déposés sur une membrane de transfert, incubées avec des anticorps anti-DIG, et dosés utilisant le dosage colorimétrique décrite dans la section 2.3 du protocole. L'analyse suggèreles concentrations estimées suivantes: la sonde 2, ~ 100 ng / pl; sonde 3, ~ 10 ng / ul sonde 4, ~ 1 ng / ul. Sonde 4 est peu probable pour donner un bon signal d'hybridation in situ.
Figure 3. Comparaison d'une sonde non-spécifique à une sonde qui fonctionne bien. Des sections longitudinales à travers les apex du maïs montrant un signal de fond non spécifique (A) et un spécifique signal d'hybridation in situ pour la sonde OCL5 dans la couche cellulaire externe (B).
Figure 4. Schéma montrant la chronologie des étapes du protocole de l'hybridation in situ. Enrobage des tissus étapes sont indiquées en vert, sonde-étapes de préparation en orange, et les étapes de l'hybridation in situ en bleu. Cette chronologie estime que l'ADN de template pour la transcription in vitro de la sonde est disponible. Blocs de tissus paraffine-incorporés et DIG-sondes marquées peuvent être préparées à l'avance et stocké à 4 ° C et -80 ° C, respectivement, jusqu'à ce que le temps d'utilisation. Le protocole de l'hybridation in situ peut alors être complété en aussi peu que quatre jours.
Discussion
L'hybridation in situ dans la méthode décrite ici permet la visualisation directe du patron d'expression spatio-temporelle d'un gène d'intérêt avec une résolution cellulaire grande, haute sensibilité et spécificité. Le protocole ne permet pas une comparaison quantitative des niveaux d'expression entre les gènes. Toutefois, une haute sensibilité de la méthode et la résolution peut révéler des gradients de l'expression des gènes dans un tissu 8, 18, qui n'est pas possible avec la plupart des autres méthodes d'analyse de l'expression génique.
Le protocole comprend de nombreuses étapes, ce qui peut rendre le dépannage des problèmes. Les étapes les plus critiques du protocole sont la fixation du tissu et de la sélection et l'étiquetage de la sonde. Les tissus infiltrés et des sondes mal avec l'incorporation DIG faible donnera des signaux très faibles qui pourraient être difficiles à détecter dessus du fond. Pour chaque nouveau gène d'intérêt, il est conseillé d'essayer quelques sondes distinctes provenant diffélocation régions de la transcription. Parfois, deux ou trois sondes ciblant différentes petites régions du gène peut être nécessaire de combiner pour obtenir un fort signal d'hybridation et spécifiques. En outre, les conditions d'hybridation, comme la température et la composition du tampon d'hybridation, peut être optimisé pour chaque gène ou d'un tissu à la baisse ou l'augmentation de la rigueur d'hybridation. Aussi l'étape de traitement de la protéase est une variable et peut être modifié pour adapter le protocole pour différentes espèces de plantes ou pour la détection des transcrits avec très peu abondante. L'inclusion de deux sondes de contrôle positif et négatif sera utile pour identifier les points problématiques du protocole.
La procédure est optimisé pour paraffine des coupes de tissus végétaux, mais avec des modifications mineures peuvent être utilisées aussi pour l'ensemble de montage hybridation in situ. Bien que largement utilisé dans la recherche animale 19, monter toute l'hybridation in situ sera limited aux tissus de la plante qui peut être facilement infiltré, tels que les embryons, les racines ou les jeunes tissus méristématiques 20,21. Le protocole peut également être facilement modifié pour détecter simultanément deux ARNm distincts ou localiser les transcriptions aux côtés de protéines 15,22,23. Enfin, il est possible d'étendre l'application de cette méthode pour la visualisation des petits modèles d'expression ARN dans les plantes. les modèles d'expression de miRNA ont été déterminés en utilisant ce protocole dans les deux maïs et Arabidopsis 8,14. Plus récemment, le transcrit in vitro dans les sondes ont été remplacées par commercialement disponibles DIG-étiqueté d'acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes oligo que la sensibilité du signal augmentation de 18, 24.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
La recherche dans le laboratoire de MT est soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DBI-0820610-1022102 et IOS) et le ministère de la Santé York (NYSTEM-C024308). CM ont reçu des bourses postdoctorales du ministère espagnol de l'Education et des Sciences (2007-0937) et la Fondation Rafael del Pino, Espagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
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