Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3328
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

Abstract

עם ההתקדמות במחקר הגנום של העשור האחרון, ביולוגיה צמח ראה מחקרים רבים מציגים בקנה מידה גדול ניתוחים כמותיים של ביטוי גנים. Microarray וליד רצף גישות דור נמצאים בשימוש כדי לחקור תהליכים התפתחותיים בתגובה, פיזיולוגיים מתח, לנתח epigenetic קטנים מסלולים RNA, ולבנות רשתות גנים רגולטוריים גדולים 1-3. טכניקות אלה להקל על ניתוח סימולטני של קבוצות גנים גדולים, הם בדרך כלל מספקים רזולוציה spatiotemporal מצומצם מאוד של שינויים בביטוי הגנים. מגבלה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי או באמצעות פרופיל השיטה בשיתוף עם lasermicrodissection או הקרינה המופעל תא מיון 4-7. עם זאת, כדי להבין את התפקיד הביולוגי של גן, הידע של דפוס spatiotemporal הביטוי שלה ברזולוציה הסלולר הוא חיוני. במיוחד, כאשר לומדים פיתוח או את ההשפעות של STI הסביבהמולי ו מוטנטים ניתוח מפורט של דפוס הביטוי של גנים יכול להיות חיוני. למשל, הבדלים כמותיים עדין ברמות הביטוי של גנים רגולטוריים מפתח יכול להוביל פנוטיפים דרמטי כאשר הקשורים לאובדן או רווח הביטוי סוגי תאים ספציפיים.

מספר שיטות משמשות דרך שגרה לבחינה מפורטת של דפוסי ביטוי גנים. האחד הוא באמצעות ניתוח של קווי כתב מהונדס. ניתוח כזה יכול, לעומת זאת, להפוך זמן רב בעת ניתוח גנים מרובים או עובדים במפעלים הסרבן לשינוי. יתר על כן, אימות עצמאי כדי להבטיח את דפוס הביטוי transgene מחקה כי הגן אנדוגני הוא נדרש בדרך כלל. לוקליזציה חלבון ה-mRNA immunohistochemical או הכלאה באתרו להציג חלופות מהיר יחסית עבור להדמיה ישירה של ביטוי גנים בתוך תאים ורקמות. האחרון יש יתרון מובהק שזה יכול להיות בקלות used הגן על כל העניין. הכלאה In situ מאפשר זיהוי של mRNAs היעד בתאים על ידי הכלאה עם תחושת אנטי RNA שכותרתו בדיקה מתקבל על ידי ב שעתוק במבחנה של הגן של עניין.

כאן מתאר פרוטוקול עבור בלוקליזציה באתרו של ביטוי גנים בצמחים כי הוא מאוד רגישות ספציפית. הוא מותאם לשימוש עם paraformaldehyde קבוע, פרפין, משובצים קטעים, אשר נותן שימור מעולה של היסטולוגיה, ולאחר בדיקות DIG שכותרתו כי הם דמיינו ידי איתור-חיסונית ובסיסי-phosphatase התגובה colorimetric. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר רקמות ממגוון רחב של מיני צמחים, וניתן להשתמש בו כדי לנתח את הביטוי של mRNAs כמו גם RNA קטנים 8-14.

Protocol

1. לדוגמה הכנה

הערה: כל השלבים עד וכולל שלב הכלאה רגישים לפעילות RNAse. לכן זה חיוני כדי לעבוד בתנאים נקיים. זה גם די נפוץ כדי להפוך את כל פתרונות RNase חינם באמצעות DEPC שטופלו מים זכוכית אפוי על 180 ° C למשך לפחות 3 שעות. מיכלי פלסטיק מנקים לעתים קרובות באמצעות טיפול עם 0.2 N NaOH למשך 30 דקות. עם זאת, אף של אמצעי זהירות אלה חיוניים, ואנחנו בדרך כלל שימוש קבוע נקי milliQ H 2 O עבור כל פתרונות. אנחנו עושים לשמור ריאגנטים נפרד, קופסאות זכוכית עבור ב הכלאות באתרו ולאחסן אלה בארון נקי.

  1. לדוגמה קיבוע
    1. יום 1: הכן טרי 4% (PFA) מקבע paraformaldehyde. עבור 500 מ"ל, 400 מ"ל חם 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 מ"מ לאא 2 PO 4 pH7.0) עד 60 ° C ו לפזר two כדורי של NaOH. במנדף קטר, להוסיף 20 גרם של paraformaldehyדה ומערבבים היטב עד מומס. מניחים את הפתרון על הקרח כאשר התקררו להתאים את pH עד 7.2 עם H 2 SO 4 (1-2 טיפות 100 מ"ל). ואז להתאים את עוצמת הקול עד 500 מ"ל עם 1x PBS.
      הערה: אין להשתמש HCl כדי להתאים את pH כמו זה יהיה לשחרר אדים רעילים. Paraformaldehyde רעיל, הפתרון הזה ולכן צריך להיות מוכנים במנדף קטר ו להיפטר כראוי. כמו כן, Paraformaldehyde מאוחסן 4 ° C ויש קנה חדש בכל 6-9 חודשים.
    2. דגימות רקמה קציר ולמקם אותם מיד מקבע 15 מ"ל PFA טריים על קרח בקבוקוני זכוכית הנצנץ. אם לנתיחה רקמות נדרשת, זה נעשה הכי טוב על קרח מקבע קר.
      הערה: חשוב להשתמש עודף גדול של מקבע. יחס מומלץ הכללית היא להשתמש 10 כרכים של מקבע את נפח הרקמה 1.
    3. החלת ואקום (~ 500 מ"מ כספית) על דגימות בעוד על הקרח. החזק ואקום במשך 15-20 דקות; בועות קטנות צריך לשחרר מן המדגםזה אך מקבע לא צריך להגיע לרתיחה. לשחרר את הוואקום לאט, לחדש את מקבע PFA כדי להבטיח מקבע נשאר בריכוז הנכון. חזור על פעולה זו עד לרקמות את הכיור לאחר שחרורו של ואקום.
      הערה: קיבוע נדרש לתקן צולבות קישור מולקולות RNA בתוך הרקמה. שלב זה הוא קריטי כמו חומרים קבועים גרוע תשואה אות נמוך. רקמות מסוימות אינן לשקוע מיד אבל רוב בסופו של דבר בכיור במשך הלילה. כדי לשפר את חדירת מקבע, דטרגנטים הבא ניתן להוסיף: טריטון של עד 0.1% ו / או Tween עד 0.1-0.3%. לחלופין, אתנול מבוסס fixatives, כמו חומצה פורמלדהיד, אלכוהול חומצי (FAA), ניתן להשתמש ברקמות כי הם לא חדרו בקלות אחרת 14,15.
    4. החלף את מקבע PFA פעם נוספת לשמור על בקבוקונים ב 4 ° C למשך הלילה.
  2. רקמות הטבעה
    1. יום 2: טרום מגניב 1x PBS ואת סדרת אתנול ב 4 ° C.
    2. שוטפים את טווי דגימותce למשך 30 דקות כל אחד 1x PBS, על הקרח.
      הערה: גם כאן מומלץ להשתמש עודף גדול של כל פתרון.
    3. מייבשים את הדגימות על ידי לקיחת אותם באמצעות סדרה אתנול, על הקרח, כדלקמן:
      • 10% אתנול, 30 דקות,
      • 30% אתנול, 30 דקות,
      • 50% אתנול 1 שעה,
      • 70% אתנול 1 שעה,
      • 85% אתנול 1 שעה,
      • 95% אתנול 1hour,
      • 3 שינויים של אתנול 100% עבור כל 1hour
    4. בסוף היום, להחליף את אתנול על ידי Eosine 0.1% באתנול 100% בין לילה ב 4 ° C. כתמים Eosine את דופן התא ביצוע הדגימות גלוי יותר במהלך הטבעה ואת חתך.
      הערות: פעמים הצביעו כאן מוטבו עבור בלוקים של 3x3x3 מ"מ אבל incubations יותר עשויות להידרש דגימות גדולות יותר.
      דוגמאות ניתן לאחסן אתנול 70% ב 4 ° C למשך מספר חודשים. יום 3: בבוקר שלמחרת, לחמם את דגימות לטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. ואז להחליף את אתנול בהדרגה עם histoclear כדלקמן:
      שולחן
    5. בסוף היום, להוסיף 1 / 4 בנפח של Paraplast פלוס צ'יפס במקום את הבקבוקון בתוך תנור 60 מעלות צלזיוס. כמו כן למלא כוס עם שבבי Paraplast ומלאו זה לעתים קרובות על מנת תמיד יש שעווה מותכת טרי בהישג יד.
      הערה: הטמפרטורה של התנור מתחמם חשוב Paraplast ממושכת של מעל 60 מעלות צלזיוס יש להימנע.
    6. יום 4: בהדרגה להחליף את histoclear עם Paraplast באופן קבוע על ידי הוספת שבבים פרפין יותר (כל שעה). בסוף היום, בזהירות לשפוך את התערובת histoclear / שעווה מיד להחליף אותו עם שעווה מותכת טהור. השאירו את דגימות ב 60 ° C למשך הלילה.
    7. ימים 5 ו 6: שינוי Paraplast 3 פעמים ביום, על כל 4 שעות, עם שעווה מותכת טרי לשמור את זהamples ב 60 ° C.
      הערה: אפשר לשנות את השעווה רק פעם ביום, אבל הכנה רקמות ייקח עוד כמה ימים כדי להשלים, כמו השעווה צריך להיות שונה לפחות 5 או 6 פעמים. חדירת אבק של דגימות רקמה, כאשר אלה הם 100% EtOH ו / או שעווה יכולים לשפר את חדירת והטבעה של רקמות. חדירת אבק של דגימות בשעווה צריך להיעשות על 60 ° C.
    8. יום 7: שינוי שעווה פעם נוספת. הריח של histoclear כעת אמור להיות נעלם לגמרי את הדגימות יכול להיות מוטבע מאוחר יותר באותו יום.
    9. הגדרת הצלחת ההתחממות גדול ב 60 ° C מוגן על ידי רדיד אלומיניום.
    10. השיטה של ​​הטבעה ישתנה בהתאם לסוג הרקמה להיות מנותח. הנקודה החשובה ביותר בשלב זה היא להבטיח כי דגימות מכוונים כראוי עבור חתך מאוחר יותר. דרך אחת היא להשתמש תבניות פלסטיק וטבעות. לחמם את תבניות בצלחת ההתחממות ויוצקים שעווה מותכת לתוך החלק התחתון של התבנית. להעבירדגימת רקמה לתוך התבנית עם מלקחיים התחמם לכוון אותו למיקום הרצוי. מניחים את הטבעת לבן על גבי התבנית ולהוסיף שעווה מותכת נוספים כגון כי רקמות מכוסים לגמרי. בזהירות להזיז את התבנית מן הצלחת אל הספסל. בואו השעווה להתקרר בהדרגה.

אפשרות נוספת היא לחלק את כל דגימות בצלחת פטרי המכילות שעווה מותכת (דגימות צריך להיות מכוסה כולו על ידי שעווה) תוך כדי עבודה על הצלחת 60 מעלות צלזיוס התחמם. להתמצא דגימות עם מלקחיים חמים. בסוף, לכבות את הצלחת. כאשר הוא ביסס את השעווה, צלחת פטרי ניתן להעביר את הספסל ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C. כאשר מוכן חתך, בלוקים קטנים המכילים דגימת רקמה ניתן לגזור מתוך צלחת פטרי עם להב חימם ועלה על בעל הדגימה microtome עם ירידה נוספת של שעווה מותכת. בואו המדגם להקשיח במשך כמה דקות לפני חתך.

הערה: בלוקים יכוליםלהיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שנה 1 או יותר. לקבלת עצות מועילות נוספות על קיבעון רקמה והטבעה, ראה השופט. 16

2. בדיקה הכנה

  1. שיבוט
    בדיקות נוצרות בדרך כלל אחד או יותר לאזורים ספציפיים של הגן של עניין. רצפים חוזרים מאוד צריך להיות מחוץ בדיקה, אבל רצפים המתאים תחומים חלבון משומר, כגון ה-DNA מחייבת מוטיבים גורמי שעתוק, בדרך כלל תניב דפוסי ביטוי גנים ספציפיים 8,9,12,15 (איור 1). זה בגלל RNAse טיפול שלאחר הכלאה צעדים (ראה להלן) מפחיתה את רמת הכלאה בדיקה צולבת בין בני המשפחה גן. RNAse cleaves על אי התאמות בתוך דופלקסים RNA, בדיקות פיצול הכלאה אל תעתיקי עם השלמה לא מושלם, אשר יהיה לשטוף בצעדים הבאים.
    באופן כללי, מספר בדיקות ייתכן שיהיה צורך להיבדק על כל גן של עניין. בדיקות יכול להיות קצר ככל 150 בסיסים באורך. Althougשעות אין הגבלה על אורך של החללית, שברי קצר לאחר מכן 1.5 kb בדרך כלל לתעתק טוב יותר. שברי DNA להיות עיבד הם משובטים לתוך וקטור המכיל T3, T7, או SP6 היזמים (למשל pCRII-Topo, Invitrogen). לחלופין, T3, T7 או SP6 רצפים האמרגן ניתן לכלול כ 5'-tail על פריימר הפוך המשמש הגברה באזור בדיקה.
    בתוך כל ניסוי הכלאה באתרו, אנו כוללים בדיקה בקרה חיובית עבורו את התבנית הכלאה ידוע אשר פועל באופן עקבי, כמו גם בקרה שלילית (איור 1D ו-H). זו האחרונה יכולה להיות בדיקה אקראית RNA כי ידוע שלא להכליא את כל תמלילי ברקמות של עניין. אמנם מקובל להשתמש בדיקה תחושה של הגן תחת ניתוח, זה לא הכרחי וכל שאינו והכלאה רנ"א יתאים את המטרה. אם זמין, רקמות מן האלל ריק תעתיק של הגן של עניין תשמש שליטה שלילי מעולה.
    2. ב שעתוק במבחנה
    1. Linearize הפלסמיד על ידי לעכל כ 5 מיקרוגרם DNA עם אנזים הגבלה מעכל כי בסוף הכנס את ההיפך האתר של האמרגן. אין להשתמש אנזימי הגבלה, כי להשאיר 3'-הסככה. זה יכול להוביל חפצים שעתוק כי פולימראז יכול לנצל את הסככה של 3 כמו מצע להמשיך שעתוק. לחלופין, באזור בדיקה כולל T3, T7 או SP6 היזם יכול להיות מוגבר על ידי ה-PCR על מנת ליצור את תבנית ה-DNA על התגובה במבחנה ב שעתוק.
    2. בדוק aliquot על ג'ל כדי לוודא כי התגובה הלכה סיום.
    3. חלץ את ה-DNA עם כלורופורם פנול /, המשקע עם אתנול resuspend גלולה דנ"א milliQ H 2 O ריכוז של 1μg/μl. לחילופין, ה-DNA ניתן לנקות באמצעות תקן טיהור עמודות ה-DNA.
    4. הגדרת בתגובה שעתוק במבחנה על ידי ערבוב:
      • 1μl puדיד DNA (1μg/μl)
      • 2μl שעתוק 10x חיץ
      • 2 μL 10x DIG-RNA לערבב תיוג
      • 1μl RNAse OUT
      • 2μl T3, T7 או SP6 RNA פולימראז (20 U / μl)
      • H 2 O עד 20μl.

      לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. שמור 1μl לנתח את הג'ל לאחר מכן.
      הערה: בדיקות הקרינה שכותרתו עדיפים במערכות החי אך עקב גבוה פלואורסצנציה אוטומטי של רקמות הצמח ביותר, פרוטוקולים הכלאה באתרו לצמחים להשתמש בדיקות radiolabeled 17 או יותר נפוץ DIG שכותרתו בדיקות כי הם מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה.
    5. מוציאים את תבנית ה-DNA על ידי הוספת 75 μL MilliQ H 2 O ו - 5 μL RQ1 DNAse (1 U / μl) לתגובה שעתוק דוגרים התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    6. לטהר את מבחנה ב שעתוק התגובה לחסל שאינם משולבים נוקלאוטידים וגיליון ציונים קטן. אחת possibility היא להשתמש בגודל הדרה Sephadex טור ®, כגון עמודות מיני סיבוב מהיר RNA (Roche). לחלופין, התגובה שעתוק יכולים להיות מטוהר על ידי משקעים LiCl / אתנול קונבנציונלי (ראו נ"צ. 14). שמור 1μl לבדוק ג'ל מאוחר יותר.
    7. בדיקות מעל 250 בסיסים אורך בדרך כלל hydrolized חלקית להשיג מולקולות RNA של כ 150 nt ולכן קטנה מספיק כדי לחדור ביעילות בסעיפים רקמות. הוסף נפח שווה של חיץ קרבונט 2x (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na 2 CO 3) לתגובה שעתוק מטוהרים לדגור על 60 ° C. זמן הדגירה צריך להיות מחושב על ידי הנוסחה הבאה:
      זמן = (Li - LF) / (K x לי x LF)
      שם Li = אורך בדיקה ראשונית (ב KB); אורך LF = בדיקה סופית (0.150 קילו); K = 0.11 kb / דקה. שמור 2 μL כדי לבדוק את הג'ל.
    8. לנטרל את התגובה הידרוליזה על ידי הוספת 1 / 20 נפח של חומצה אצטית 10%.
    9. החללית אז פוריfied ידי הוספת 1μl של tRNA (100mg/ml), 1 / 10 נפח 3M NaAc pH 5.2, בתוספת 2.5 כרכים 100% אתנול קר, דוגרים ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לזרז את הרנ"א על ​​ידי צנטריפוגה בסל"ד 13,500 עבור 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם אתנול 500μl 70%. צנטריפוגה שוב, את האוויר היבש גלולה (בדרך כלל כ -15 דקות), ו resuspend רנ"א לפוראמיד 50μl deionized 50%. החללית צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C עד השימוש.
    10. בדוק על 1% קבוע Tae-agarose ג'ל את המוצר הסופי, כמו גם מוצרי ביניים בין הסעיפים 2.2.4, 2.2.6 ו 2.2.7 (איור 2A). זה מאפשר ניטור של היעילות של בתגובה שעתוק במבחנה.
      הערה: בתגובה שעתוק במבחנה אמור להניב כ 1 מיקרוגרם של RNA לפי תבנית של 1 מיקרוגרם.
  2. דוט ניתוח כתם
    ריכוז החללית ולחפור-UTP ההתאגדות ניתן להעריך על ידי נקודה כתם ניתוח (תרשים 2B). טורי Rדילולים NA הם הבחינו על קרום הכלאה רגילה לצד RNA לשלוט שכותרתו ריכוז ידוע. למשל, אנו משתמשים DIG-UTP שכותרתו לשלוט RNA בדיקה כלול בערכה שעתוק במבחנה (Roche). מומלץ לבדוק דילולים מרובים עבור כל בדיקה להקים ריכוז מדויק.
    1. הכן חיץ חסימת ידי המסת 0.5% ב מגיב חסימת 1x כפות חוצץ (100 מ"מ טריס-HCl pH7.5, 150 mM NaCl) בשעה 70 ° C, ואז לתת פתרון להתקרר לטמפרטורת החדר.
    2. ספוט 1μl של דילולים סדרתי (בדרך כלל 10 עד 10 -1 -5) של בדיקות במבחנה עיבד שליטה על N + קרום ניילון. תקן ה-RNA על ידי UV cross-linking.
      הערה: שטח מינימלי של קרום אמור לשמש כדי להפחית את עוצמת הקול של מאגרים צורך מאוחר יותר.
    3. לאזן את הממברנה ב 1x TBS 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמה רועדת.
    4. חסום את הממברנה באמצעות חסימתחיץ למשך 30 דקות ב RT על פלטפורמה רועדת.
    5. יש לשטוף את הממברנה ב 1x כפות דקות 5.
    6. דגירה הממברנה עם נוגדן אנטי לחפור, דילול 1μl של Anti-digoxigenin-AP ב 10 מ"ל של 1x TBS, במשך 45 דקות ב RT.
    7. לשטוף את הממברנה פעמיים 1x כפות במשך 15 דקות כל אחד.
    8. לאזן את הממברנה ב 1x TN חיץ (100mm טריס-HCl pH 9.5, NaCl 100mm) במשך 5 דקות.
    9. הכתם הממברנה על ידי דוגרים עם NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) במאגר TN 1x. מכתים יכול לקחת 50-10 דקות. לאחר מכן לשטוף את הממברנה עם מים, זה יכול להיות יבשים והמשיך כעדות.
      הערה: NBT / BCIP הוא המצע עבור phosphatase אלקליין מצומדות כדי נוגדן אנטי DIG כי על הידרוליזה מייצרת צבע כחול כהה.

3. חתך

  1. חם אבני לטמפרטורת החדר. אם בלוקים הם קרים מדי, חלקים בודדים עשוי להתהפך ללא יצירת "סרט" שעווה. חתוך את הבלוק לתוך trapeצורה zoid עוזב על 1mm של שעווה סביב המדגם.
  2. חימום שקופיות גדולות חם ב 35-37 ° C.
    הערה: פרוטוקולים רבים לעשות את הצעד הזה על 42 מעלות צלזיוס לעומת זאת לצמצם את הטמפרטורה ל 35-37 ° C מונע היווצרות של בועות לפי סעיפים.
  3. מניחים את גוש על microtome כזה עוד שני פרצופים במקביל הוא בתחתית. בזהירות להביא את קדימה כדי לחסום את הלהב וכן לוודא כי פני השטח של גוש מקביל הלהב. סעיף ב עובי של 8 - 10μm. סרטים השעווה ניתן ליישר על פני השטח הלא דביק, כגון נייר אלומיניום או נייר פילטר, כדי לבחור חלקים של עניין. זה ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ לנתח הסמוך.
    הערה: מכתים eosin של הרקמה מספק אינדיקציה אם הרקמות כבר הסתננו כראוי במהלך הטבעת. אם את מרכז הבלוק אינו מוכתם eosin זה בדרך כלל מצביע על כך רקמות קבוע גרוע.
  4. Mark-Probe Plus על slides בעיפרון (רוב עטים או סמנים נמחקים במהלך בפרוטוקול הכלאה באתרו) ולהפיץ 1mL נקי של milliQ H 2 O על זה. בזהירות לצוף קטעים של עניין על פני השטח של המים בטמפרטורת החדר (קל יותר לתמרן את החלקים על פני המים כאשר עובדים בטמפרטורת החדר). ודא כי הצד המבריק (הצד התחתון כמו הסרט יורד של microtome) הפנים את המים. ואז להעביר את השקופית לשקופית לאט חם. חימום מסייע הסעיפים להתפשט על פני השטח של המים. לאחר 5 דקות, יוצקים את המים בזהירות, אך בתנועה חלקה אחת, כך הוא הוריד את הסרט לשקופית. בואו השקופיות יבש לפחות כמה שעות או לילה בשעה 37 ° C, ולכן דבק רקמות.
    הערה: רקמה מחולק ניתן לאחסן בתוך קופסה עם יבוש סיליקה במשך כמה ימים עד שבועות 4 ° C, לעומת זאת, עדיף להשתמש שקופיות בהקדם האפשרי.

4. היברידי באתרושנפלו על הקרקע הפורייה

  1. סעיף טרום טיפול
    נפח נדרש פתרון לכל יהיה ברור תלוי במספר שקופיות שיתייחסו ואת גודל המיכל בשימוש. סעיפים תמיד צריך להיות שקוע לחלוטין. עבור מדף 25-שקופית ואת מיכל מתאים בצורה מסודרת, 200-250 מ"ל מספיק. מכיוון שרבים הם צעדים הדגירה קצר מאוד, אנחנו בדרך כלל להכין את כל הפתרונות האפשריים הראשון ולאחר מכן להתחיל את השקופית מראש טיפולים. עם זאת, הפתרון אנהידריד אצטית צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש פרוטאז נוסף בזמן השימוש. כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. כמו כן, כל החוצצים יכול להיות מוכן בריכוז 10x כפתרון המניות.
    1. חם החיץ פרוטאז (100 מ"מ טריס pH 8.0, 50 mM EDTA) במיכל עד 37 ° C.
    2. Deparaffinize רעננותם ואת הסעיפים רקמות כדלקמן:
      • histoclear - 10 דקות (להשתמש צלחת זכוכית)
      • histoclear - 10 דקות (להשתמשצלחת זכוכית)
      • 100% אתנול - 1 דקות
      • אתנול 100% - 30 שניות
      • אתנול 95% - 30 שניות
      • אתנול 85% - 30 שניות
      • אתנול 70% - 30 שניות
      • אתנול 50% - 30 שניות
      • אתנול 30% - 30 שניות
      • אתנול 10% - 30 שניות
      • milliQ H 2 O - 1 דקות
    3. דגירה של 1x PBS דקות 2.
    4. מערבבים 625μl של פרוטאז 50mg/ml במאגר 250 מ"ל פרוטאז מראש לחמם 37 ° C ו דגירה את השקופיות עבור 20 דקות בשעה 37 ° C.
      הערה: פרוטאז נדרש לעכל חלבונים קבוע לשפר את הנגישות בדיקה RNAs הסלולר. זה קריטי כדי לשלוט על זמן של דגירה על מנת למקסם את האות הכלאה ללא פירוט של הרקמה, ובכך אופטימיזציה כמה עשויות להידרש מדגם רקמות.
    5. לנטרל את פעילות הפרוטאז של גליצין 0.2% ב 1x PBS דקות 2.
    6. יש לשטוף את השקופיות פעם 1x PBS דקות 2.
    7. פנקו את השקופיות in 4% PFA פתרון עבור 10 דקות מחדש לתקן את RNA אשר יכול להיפגע הטיפול פרוטאז.
    8. יש לשטוף את השקופיות פעמיים 1x PBS עבור 2 דקות כל אחד.
    9. בעוד השקופיות נמצאים PBS שוטף, איפור 250 מ"ל של pH 0.1 triethanolamine פתרון M 8.0 ידי ערבוב 12.5 מ"ל של triethanolamine 2M (29.8g ב 100 מ"ל milliQ H 2 O, pH8.0 עם HCl) לתוך 236.25 מ"ל milliQ H 2 O בכלי זכוכית. הוסף 1.25 אנהידריד אצטית מ"ל לתוך המאגר triethanolamine מיד לפני שהכניס את השקופיות, ומערבבים היטב. לאחר הוספת שקופיות, ממשיכים לבחוש לאט במשך 10 דקות.
      פעולה זו דורשת מתלה שקופית גבוהות במיכל של triethanolamine / אנהידריד אצטית. אנו משתמשים במערכת clamping עם מעמד תמיכה.
      הערה: בשלב זה, קבוצות אמינו בעלי מטען חשמלי חיובי שעלולות להוביל מחייב הלא ספציפית של החללית הם acetylated. כמו כן, אנהידריד אצטית הוא רעיל, הפתרון הזה ולכן צריך להיות מוכנים במנדף קטר ו להיפטר כהלכה <./ Li>
    10. יש לשטוף את השקופיות פעמיים 1x PBS דקות 2.
    11. מייבשים את הסעיפים רקמות שוב:
      • H 2 O - 1 דקות
      • אתנול 10% - 30 שניות
      • אתנול 30% - 30 שניות
      • אתנול 50% - 30 שניות
      • אתנול 70% - 30 שניות
      • אתנול 85% - 30 שניות
      • אתנול 95% - 30 שניות
      • אתנול 100% - 30 שניות
      • אתנול 100% - 30 שניות
      הערה: שקופיות ניתן לאחסן במיכל עם כמות קטנה של אתנול 100% בחלק התחתון של עד מספר שעות בבית 4 ° C.
  2. הכלאה
    1. חם בלוק חימום עד 85 ° C.
    2. הכן את החיץ הכלאה. עבור לערבב 10 מ"ל, ב 1.25 מ"ל צינור פלקון ב מלחים הכלאה באתרו (3M NaCl, 100mm טריס-HCl pH 8.0, 100mm פוספט Na pH6.8, 50mm EDTA), 5 מ"ל לפוראמיד deionized, 2.5 מ"ל 50% סולפט dextran, 250 μl 50x Denhardt, 125 μl 100mg/ml tRNA, ו 875 μl H 2 O. <br /> הערה: סולפט dextran היא צמיגה מאוד, ולכן עדיף מחממים את הפתרון 60 ° C כדי להפוך pipetting קל. חיץ הכלאה ניתן לאחסן ב -20 ° C.
    3. הכן את בדיקות שונות. עבור כל שקופית, לערבב 1 בדיקה μl עם 9 μl milliQ H 2 O ו - 10 לפוראמיד deionized μl. מחממים את החללית על 85 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות, מיד צמרמורת על הקרח, בקצרה צנטריפוגות, ולהוסיף בדיקה למאגר 80μl הכלאה לכל שקופית. מערבבים היטב על ידי pipetting, אך להימנע בועות.
      הערה: כמות בדיקה להוסיף לכל שקופית צריך להיבדק באופן אמפירי. באופן כללי, בדיקות משמשים בריכוז הסופי של המורכבות ng / kb / μl 0.5 בדיקה. מאז הכלאות מבוצעים עם 100 μl לכל שקופית, כ -25 ננוגרם של בדיקה נחוצה לכל שקופית עבור בדיקות כי הם 0.5 קילו באורך של 50 נ"ג של בדיקה לכל שקופית עבור בדיקות כי הם 1-kb ארוך. לשם הפשטות, לעתים קרובות אנו מנסים 0.5, 1, ו 4 בדיקה μl לכל שקופית.
    4. מניחים את השקופיות עלמשטח נקי ולתת להם אוויר יבש לגמרי 5-10 דקות. Pipet בדיקה / הכלאה חיץ לערבב על הקצה הימני של השקופית. בהדרגה נמוך coverslip לשקופית; לוודא כי הפתרון הכלאה מכסה את כל החלקים ללא כל בועות. הקש על coverslip קלות עם האצבע היכן בועות טופס לעקור אותם מכל הסעיפים רקמות. אל תמשוך לכסות את להחליק, כמו זה יהיה נזק הסעיפים.
      הערה: שיטה חלופית נפוץ של שלב זה היא להכין "סנדוויצ'ים" של שתי שקופיות מודגרת עם בדיקה זהה. לפרטים נוספים על שיטה זו, ראה השופט. 14.
    5. הכינו תא לחות בקופסת פלסטיק שטוח לחלוטין. מכסים את תחתית הקופסה עם whatman נייר טבולה במים milliQ, כיסו את הנייר עם parafilm להשאיר פינות חשפו; במקום שקופיות בתיבת פלסטיק לאטום את התיבה בחוזקה.
    6. דגירה השקופיות בטמפרטורה הכלאה הרצוי, בדרך כלל על 50-55 ° C, Fאו 16-20 שעות.
    7. לשימוש בבוקר, להכין 1 ליטר 0.2x SSC ולאחסן זה ב 55 ° C. בנוסף, להכין חוצץ NTE 1 ליטר (0.5 M NaCl, 10 mM טריס-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) ולאחסן ב 37 ° C.
  3. פוסט הכלאה טיפול
    1. הסר את coverslips בזהירות לא לפגוע בחלקים. מניחים את השקופיות במעמד ולשטוף אותם פעמיים 0.2x SSC על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
      הערה: לעתים קרובות Coverslips ליפול בקלות כאשר השקופיות ממוקמים זקוף. אם coverslip נשאר צמוד, לטבול את השקופית חם 0.2x SSC דקות 1 או 2 לשטוף את coverslip משם. הימנע משיכת coverslip של השקופית, כמו זה יכול לגרום נזק הסעיפים.
    2. בינתיים, להכין 500 מ"ל כביסה חיץ (1% BSA, טריטון 0.3% ב TBS חיץ) ו 100 מ"ל הפתרון חוסם (0.5% חסימת מגיב ב TBS חיץ). מערבבים את אבקת חסימת לתוך כפות כי הוא מחומם לאט עד 70 ° C ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר פעם dissolved.
      הערה: כרכים של כביסה חיץ וחסימת הפתרון צריך ישתנה בהתאם לגודל של תיבת פלסטיק שטוחים המשמשים צעדים 4.3.8 -11. זה ייקח קצת זמן כדי להמיס לחלוטין טריטון, כך להכין פתרון מספיק מראש.
    3. לאזן את השקופיות ב NTE 1x דקות 2.
    4. המשך RNAse טיפול על ידי העברת שקופיות למאגר 1x NTE אשר 20μg/ml RNAse נוסף ממש לפני השימוש, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: RNAse cleaves חופשי חד גדילי RNA, כמו גם על חוסר התאמה ב דופלקסים RNA. פעולה זו מסייעת להפחית את רמת מחייב הלא ספציפית של החללית, כמו שברי נחקר ביקע הם לשטוף את האחרון 0.2x לשטוף SSC (ראו 4.3.6).
    5. יש לשטוף את השקופיות פעמיים NTE 1x 2 דקות כל אחד.
    6. שטפו את השקופיות טרי 0.2x SSC על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
    7. לאזן את השקופיות ב 1x PBS 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. העברת שקופיות מן המדף אל הדואר התחתון של תיבת פלסטיק שטוח ומכסים אותם עם נפח מינימלי של הפתרון חוסם. חסום את השקופיות עבור 45 דקות על פלטפורמה לאט רועד.
    9. העברת שקופיות בקופסת פלסטיק נקי second שטוח לשטוף אותם 45 דקות עם כביסה חיץ על פלטפורמה רועדת.
    10. המשך דגירה את הנוגדן. לדלל את נוגדן אנטי digoxigenin כביסה חיץ (01:05 v / v) או להחיל נפח מינימלי ישירות על כל שקופית או במקום להחליק לתוך קופסת פלסטיק שטוח ומכסים אותם עם נפח מינימלי של פתרון נוגדן. דגירה השקופיות בחושך במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
    11. לשטוף את השקופיות 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחת עם כביסה חיץ על פלטפורמה רועדת. השתמש בנפח מינימלי של חיץ כביסה קופסת פלסטיק שטוח. נקו את קופסת פלסטיק בין כל אחד שוטף.
      הערה: ניקוי תיבת בין שוטף יהיה מופחת רקע כללי בשקופית. כדי לפשט את זה, אנו משתמשים בשתי קופסאות שטוח זההולהעביר את השקופיות לתוך תיבת נקי לאחר כל שטיפה.
    12. העברת שקופיות 1x כפות דקות 2.
    13. לאזן את השקופיות ב TN חיץ פעמיים עבור 2 דקות כל אחד.
    14. הכן פתרון מכתים מיד לפני השימוש על ידי הוספת 20 μl NBT BCIP / חיץ לכל 1 מ"ל TN. יוצקים את הפתרון מכתים בצלחת פלסטיק קטנה במשקל. סנדוויץ שתי שקופיות יחד עם הסעיפים זה מול זה. טובלים צד אחד ארוך של הכריך בפתרון, ומאפשר פעולה נימי להרים את הפתרון. מסננים את השקופיות על Kimwipe ולמלא את השקופיות עם פתרון נוגדן שוב. ייתכן שיהיה עליך להקיש את השקופיות כפתרון זורם, כדי למנוע בועות. מניחים את השקופיות בתיבה חנות פלסטיק בטמפרטורת החדר בחושך.
    15. יום 10 עד יום 15: רענון פתרון מכתים פעמיים ביום במשך 1-5 ימים על ידי שטיפת שקופיות TN חיץ והכנת כריכים חדשה המכילה פתרון מכתים טריים.
      הערה: החלפת פתרון מכתים ב int רגילervals ישפר את יחס אות הרקע. פיתוח של האות יכול להיות פיקוח תחת מתחם או סטריאו מיקרוסקופ. אפשר לצלם את החלקים בזמן שהם TN חיץ בין סבבי מכתים או ברגע שהם מועברים לתוך המים ממש לפני הרכבה קבע.
  4. הרכבה
    1. לאחר אות ברור, לשטוף את שקופיות milliQ H 2 O ו - מייבשים אותם במהירות דרך סדרה אתנול:
      • אתנול 10% - 10 שניות
      • אתנול 30% - 10 שניות
      • אתנול 50% - 10 שניות
      • אתנול 70% - 5 של
      • אתנול 80% - 5 של
      • אתנול 95% - 5 של
      • אתנול 100% - 5 של
      • histoclear - 2 דקות
      • histoclear - 2 דקות
      הערה: הקפד לשמור על כל אלה פעמים הדגירה קצר, כמו האות אתנול מסיסים.
    2. הר שקופיות על ידי הנחת טיפה אחת או שתיים של המדיום טולואן מבוססי גובר על כל החליקדואר ולאט לאט להוריד את coverslip לשקופית למנוע את היווצרות בועות. תן בינוני הרכבה להקשיח לילה לפני ניתוח התוצאה תחת מיקרוסקופ המתחם. רכוב פעם, שקופיות יכול להיות מאוחסן במשך שנים בטמפרטורת החדר.

5. נציג תוצאות:

לאחר 1-5 ימים, איתות אדום סגול יפתחו באותם תאים שבהם יש לחקור את הכלאה אל תעתיקי משלימים (איור 1). האות צבע ובכך מספק ראיה ישירה ברזולוציה הסלולר של דפוס הביטוי של הגן של עניין. מכתים רקע החלשות יכול גם לפתח, כתוצאה מחייב הלא ספציפית של בדיקה או הכתמה של רקמות הצמח (איור 3). האות רקע כזה עלול להיות יחסית בולטת יותר, תאים קטנים של רקמות נחוש פחות, אבל מכתים רקע יהיה גם לצפות בקטעים הכלאה של בדיקות בקרה שלילית וחיובית וכי לאניתן לשחזור בין הניסויים.

איור 1
באיור 1. התוצאות שהושגו עם נציג בדיקות שונות על רקמות ארבידופסיס תירס. הכלאות ב באתרו של ארבידופסיס (AD) ותירס (EH) עם רקמות שונות ספציפי גן בדיקות הממחישות את סוג התוצאות ניתן לצפות עם סיום מוצלח של פרוטוקול המתואר. (א) לוקליזציה של SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) ב איפקס ארבידופסיס לירות וגטטיבי; לציין את נוכחותו של אות כחול סגול בתאי מוגדר של meristem וחוסר האות העלים שמסביב. (BD) סעיפים של ארבידופסיס עוברים שלב לטרפד מראה CLAVATA3 (ב) ביטוי בתאי גזע עובריים מעטים, AtML1 (ג) הביטוי בשכבת האפידרמיס, וחוסר אות בסעיפים נחקר עם שליטה אקראי RNA שלילי (D ). (ה) לוקליזציה של knotted1 STM homolog בעובר המתפתח תירס; לציין את אות חזק במיוחד meristem שורש עובריים. (FH) סעיפים אורך דרך הקודקוד לירות צמח מתוך תירס מראה מובהק בדפוסי הכלאה באתרו עבור arf3a (F) ocl4 (G) אין אות הכלאה עבור בדיקה מלאה שלילי (H). arf3a באה לידי ביטוי על פני השטח עלה abaxial / תחתית, בעוד ocl4 AtML1 homolog באה לידי ביטוי במיוחד האפידרמיס.

שברי הגן הבאים שימשו בדיקה: STM: האזור המקיף cDNA חומצות אמינו 81-382, הכולל את homeodomain משומר; CLV3: אורכו cDNA; AtML1: אקסון שלישי; kn1: את המסגרת כולה קריאה פתוחה; arf3a: נוקלאוטידים 9-225 של שיבוט cDNA HM004539; ocl4: 1.7 של 3 קילו של cDNA באורך מלא, אשר כוללת מספר תחומים חלבון נשמרת.

ילדה = "jove_content"> איור 2
באיור 2. בדיקת נקודות תוך ביצוע בדיקות ב שעתוק במבחנה. (א) בדיקות הכלאה באתרו נבדקות על תקן agarose ג'ל לאחר שעתוק במבחנה ב (א), לאחר טיפול וטיהור DNase הבאים של בתגובה שעתוק במבחנה (ב), אחרי קרבונט הידרוליזה, אם נדרש, (ג) כאשר מוכן לשימוש (ד). עבור בדיקות מעל 250 נ"ב אורך, כגון בדיקה 1, הידרוליזה קרבונט תניב מגוון רחב של שברי בדיקה קטן (סוגריים). (ב) כימות Colorimetric של בדיקות על ידי ניתוח כתם נקודה. דילולים הנעים בין 10 עד 10 -1 -5 של בדיקה ng / μl 100 שליטה (1) ו החדש של שלושה DIG שכותרתו בדיקות (2-4) הם הבחינו על קרום העברה, מודגרות עם נוגדן אנטי לחפור, assayed באמצעות assay colorimetric המפורטים בסעיף 2.3 של הפרוטוקול. הניתוח מצביע עלהריכוזים מוערך הבאים: בדיקה 2, ~ 100 ng / μl; בדיקה 3, ~ 10 ng / μl בדיקה 4, ~ 1 ng / μl. בדיקה 4 סביר תשואה טובה האות הכלאה באתרה.

איור 3
באיור 3. השוואה של החללית הלא ספציפית לחקור היטב עובד. קטעים אורך דרך הקודקוד לירות צמח מתוך תירס מראה אות הלא ספציפית רקע (א) ו מסוים האות הכלאה באתרו עבור בדיקה OCL5 בשכבת התאים החיצונית (B).

איור 4
איור 4. תרשים המראה את ציר הזמן של הפעולות המפורטות בפרוטוקול הכלאה באתרה. הטבעה צעדים רקמות מסומנים בירוק, בדיקה, הכנת השלבים תפוזים, ואת בצעדים הכלאה באתרו בכחול. ציר זה סבור DNA template עבור בתעתיק במבחנה של בדיקה זמין. Parafin-משובצים אבני רקמות ולחפור שכותרתו בדיקות ניתן להכין מראש ולאחסן ב 4 ° C ו -80 ° C, בהתאמה, עד למועד השימוש. בפרוטוקול הכלאה באתרו לאחר מכן ניתן להשלים קטנה כמו ארבעה ימים.

Discussion

בשיטת הכלאה באתרו המפורטים כאן מאפשר הדמיה ישירה של דפוס הביטוי של הגן spatiotemporal כל עניין עם רזולוציה סלולרית גדולה, רגישות גבוהה וספציפיות. הפרוטוקול אינו מאפשר השוואה כמותית של רמות ביטוי בין הגנים. עם זאת, רגישות גבוהה של שיטה ופתרון יכול לחשוף הדרגתיים של ביטוי גנים בתוך הרקמה 8, 18, ​​דבר שאינו אפשרי עם רוב שיטות אחרות של ניתוח ביטוי גנים.

פרוטוקול זה כולל שלבים רבים, מה שעלול להפוך בעיות הירי בעייתי. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול הם קיבוע של הרקמה ואת הבחירה וסימון של החללית. רקמות הסתננו גרוע בדיקות עם שילוב DIG נמוך תניב אותות חלשים מאוד שעשוי להיות קשה לזהות מעל הרקע. עבור כל גן חדש של עניין, מומלץ לנסות כמה בדיקות שונות הנגזרות diffeשכר הדירה באזורים של תמליל. מדי פעם, פעמיים או שלוש בדיקות מיקוד לאזורים קטנים שונות של הגן ייתכן שיהיה צורך בשילוב לקבל איתות חזק הכלאה ספציפיים. בנוסף, התנאים הכלאה, כגון הטמפרטורה והרכב למאגר הכלאה, יכול להיות מותאם עבור כל גן או רקמות להקטין או להגדיל את חומרא הכלאה. כמו כן, הצעד טיפול פרוטאז הוא משתנה ניתן לשנות על מנת להתאים את פרוטוקול מיני צמחים שונים או לצורך זיהוי של תמלילי עם שפע נמוך מאוד. הכללת שתי בדיקות בקרה חיוביים ושליליים יהיה מועיל בזיהוי הנקודות הבעייתיות של הפרוטוקול.

הנוהל הוא אופטימיזציה עבור פרפין מוטבע סעיפים רקמות הצמח אך עם שינויים קלים ניתן להשתמש גם הכלאה באתרו על כל הר. למרות שימוש נרחב הכלאה באתרו במחקר בבעלי חיים 19, הר כולו יהיה אניimited לרקמות צמח יכול להיות שחדר בקלות, כמו עוברים, שורשים או רקמות meristematic צעירים 20,21. הפרוטוקול ניתן גם לשנות בקלות לזהות בו זמנית two mRNAs ברורים או בתרגום תמלילי לצד חלבונים 15,22,23. לבסוף, ניתן להרחיב את היישום של שיטה זו על ויזואליזציה של RNA קטנים דפוסי ביטוי בצמחים. דפוסי הביטוי מירנה נקבעו באמצעות פרוטוקול תירס וגם ארבידופסיס 8,14. לאחרונה, בשנת בדיקות במבחנה עיבד הוחלפו זמינים מסחרית DIG שכותרתו חומצות גרעין נעול (LNA) בדיקות אוליגו כי האות להגביר את הרגישות 18, 24.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

מחקר במעבדה של MT הוא נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (DBI-0820610 ו IOS-1022102) ואת מחלקת ניו יורק הבריאות (NYSTEM-C024308). סי קיבלו מלגות דוקטורט ממשרד ספרדית החינוך והמדע (2007-0937) ואת רפאל קרן דל פינו, ספרד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytoseal 60 4oz Fisher Scientific 23-244-256 Toluene-based 8310-4
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus Fisher Scientific 23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL Invitrogen 10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl Promega Corp. M6101
DIG-labeled Control RNA Roche Group 11585746910
DIG RNA labeling mix Roche Group 11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10881767001
RNase-A Roche Group 109142 dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent Roche Group 1 096 176 Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U Roche Group 1 093 274
NBT/BCIP stock solution Roche Group 1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns Roche Group 11814427001
tRNA from E. coli Roche Group 109541
Triton®X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV Sigma-Aldrich P5147 Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279 Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride Sigma-Aldrich A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate Sigma-Aldrich D2532
Albumin from bovine serum - ≥98% Sigma-Aldrich A7906
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds Electron Microscopy Sciences 62352-15
Embedding rings Fisher Scientific 22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps VWR international 66020-326
Probe-on-plus slides Fisher Scientific 22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm VWR international 48404-452
Whatman paper 3mm VWR international 89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack Electron Microscopy Sciences 71420-25 Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers Electron Microscopy Sciences 71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes Help handing wax ribbons
Microtome Leica
Self-cleaning dry vacuum system Welch Allyn 2025
Slide warmer Fisher Scientific
Heating block needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C Fisher Scientific For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C Fisher Scientific Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
  2. Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
  3. Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
  4. Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
  5. Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
  6. Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
  7. Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
  8. Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
  9. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
  10. Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
  11. Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
  12. Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
  13. Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
  14. Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
  15. Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
  16. Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
  17. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
  18. Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
  19. Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
  20. Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
  21. Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
  22. Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
  23. Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
  24. Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).

Tags

הצמח ביולוגיה גיליון 57, לוקליזציה של RNA ניתוח ביטוי צמח לחפור שכותרתו בדיקה
<em>ב</em> הכלאה <em>באתרו</em> עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Javelle, M., Marco, C. F.,… More

Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328, doi:10.3791/3328 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter