Summary
Abstract
몇 십년의 게놈 연구의 발전과 함께, 식물 생물학은 유전자 발현의 대규모 양적 분석을 제시 수많은 연구를 볼 수 있습니다. Microarray 및 차세대 시퀀싱 접근 방식은, 발달, 생리학 및 스트레스 반응 과정을 조사 epigenetic과 작은 RNA 경로를 해부하다, 그리고 1-3 대규모 유전자 규제 네트워크를 구축하는 데 사용되고있다. 이 기술이 대규모 유전자 세트의 동시 분석을 용이하게하는 동안, 그들은 일반적으로 유전자 발현 변화의 매우 제한된 spatiotemporal 해상도를 제공합니다. 이 제한은 부분적으로 lasermicrodissection 또는 4-7를 정렬 형광 - 활성 세포와 함께 방법을 사용하거나 프로 파일링하여 극복할 수 있습니다. 그러나, 완전히 유전자의 생물 학적 역할을 이해하기 위해, 세포 해상도로 표현의 spatiotemporal 패턴에 대한 지식이 필수적입니다. 특히, 개발 또는 환경 STI의 효과를 공부하면muli 및 돌연변이 유전자의 표현 패턴의 상세한 분석이 필수적이 될 수 있습니다. 특정 세포 유형에 표현의 손실 또는 이득과 관련된 경우 예를 들어, 핵심 규제 유전자의 표현 수준에 미묘한 양적 차이가 극적인 phenotypes 발생할 수 있습니다.
여러 가지 방법은 정기적으로 유전자 발현 패턴의 세부 심사에 사용됩니다. 하나는 유전자 변형 기자 라인의 분석을 통해이다. 여러 개의 유전자를 분석하거나 변화에 완강히 저항하는 식물에서 작업할 때 이러한 분석은, 그러나, 시간이 많이 걸리는 될 수 있습니다. 또한, transgene 표현식 패턴이 내생 유전자의를 모방 수 있도록 독립적인 검증은 일반적으로 필요합니다. 현장 하이브 리다이 제이션에 Immunohistochemical 단백질 지방화 또는 mRNA는 세포와 조직 내에서 유전자 발현의 직접적인 시각화에 대한 비교적 빠른 대안을 제시한다. 후자는 쉽게 U 수있는 독특한 장점을 가지고관심의 유전자에 SED. 원위치 하이브 리다이 제이션에 관심의 유전자의 시험 관내 전사에 의해 얻은 프로브 표시 안티 - 감각의 RNA와 하이브리드화하여 세포 표적 mRNAs의 탐지 수 있습니다.
여기 우리는 높은 감도와 구체적인 식물의 유전자 표현의 현장 지방화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 paraformaldehyde에 고정, 파라핀 - 임베디드 섹션, 조직학 우수 보존을주고 단백질 감지 및 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - colorimetric 반응에 의해 시각 아르 발굴 - 분류 프로브와 함께 사용하기위한 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 식물 종의 다양한 조직의 숫자에 적용되었으며, mRNAs뿐만 아니라 작은 RNAs 8-14의 표현을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 샘플 준비
참고 : 최대 및 하이브리드화 단계 포함한 모든 단계 RNAse 활동으로 구분합니다. 그러므로 깨끗한 상태에서 작업하는 것이 필수적입니다. 그것은 적어도 3 시간 180에서 구운 DEPC - 처리된 물과 유리 ° C를 사용하여 RNase없는 모든 솔루션을 만들어도 꽤 일반적입니다. 플라스틱 용기는 종종 30 분 0.2 N NaOH와 치료를 통해 청소됩니다. 그러나 이러한주의 사항 중 누구도 필수하지 않습니다 우리는 일반적으로 모든 솔루션에 대한 정기적으로 청소 milliQ H 2 O를 사용합니다. 우리는 현장 hybridizations에 대해 별도의 시약, 상자와 유리를 유지하고 깨끗한 캐비닛에 저장 않습니다.
- 샘플 고정
- 1 일 : 신선한 4 % paraformaldehyde (PFA) 정착액을 준비합니다. 500 ML, 60 따뜻한 400 ML 1X PBS (130 MM NaCl, 7 MM 나 2 HPO 4, 3 MM 아니 2 PO 4 pH7.0) ° C와 NaOH의 두 알약을 디졸브. 퓸 배출 후드에서 paraformaldehy의 20g을 추가드 및 혼합 철저히까지 해소. 얼음 솔루션을 놓고 H 2 SO 4 (100ml 1-2 방울)로 7.2 산도를 조절 냉각하면. 그럼 1X PBS 500 ML에 볼륨을 조정합니다.
참고 :이 매우 유독 가스를 출시할 예정으로 산도를 조정 HCL을 사용하지 마십시오. Paraformaldehyde은 독성이며이 솔루션은 따라서 퓸 후드에 준비하고 적절하게 폐기해야합니다. 또한, Paraformaldehyde는 4 ° C에서 저장되고 새로운 매 6 구입한다 - 9 개월. - 유리 섬광 튜브 안에 얼음 15 ML 신선한 PFA의 정착액에 즉시 수확 조직 샘플을 넣으십시오. 조직의 절개가 필요한 경우, 이것은 가장 추운 고정력있는 얼음 속에서 이루어집니다.
참고 : 정착액의 큰 초과를 사용하는 것이 중요합니다. 일반적으로 권장되는 비율은 조직의 1 볼륨에 정착액 10 볼륨을 사용하는 것입니다. - 동안 얼음에 샘플로 진공 (~ 500mm HG) 적용합니다. 15~20분에 대한 진공을 잡고, 작은 거품이 샘플에서 풀어주기를 원하 느냐의하지만 정착액은 종기에 오지해야합니다. 천천히 진공을 릴리스하고, 정착액가 올바른 농도로 유지되도록 PFA의 정착액을 갱신. 조직이 진공이 출시된 이후에 싱크 때까지이 단계를 반복합니다.
참고 : 고정은 조직 내에서 RNA 분자를 수정하고 상호 연결이 필요합니다. 제대로 고정 재료는 낮은 신호를 얻을 수 등이 단계는 중요합니다. 일부 조직은 즉시 싱크 아니지만 대부분은 결국 하룻밤 싱크됩니다. 정착액의 침투를 개선하기 위해, 다음과 같은 세제가 추가될 수 있습니다 튼과 최대 0.1 % 및 / 또는 0.1까지 십대 초반에 - 0.3 %. 이러한 포름 알데히드 - 알코올 산성 산성 (FAA)과 같은 양자 택일로, 에탄올 기반 fixatives은, 달리 쉽게 14,15에 침투되지 않은 조직을 위해 사용될 수 있습니다. - 한 번 더 PFA의 정착액을 교체 4 ° C 하룻밤에 튜브를 유지.
- 1 일 : 신선한 4 % paraformaldehyde (PFA) 정착액을 준비합니다. 500 ML, 60 따뜻한 400 ML 1X PBS (130 MM NaCl, 7 MM 나 2 HPO 4, 3 MM 아니 2 PO 4 pH7.0) ° C와 NaOH의 두 알약을 디졸브. 퓸 배출 후드에서 paraformaldehy의 20g을 추가드 및 혼합 철저히까지 해소. 얼음 솔루션을 놓고 H 2 SO 4 (100ml 1-2 방울)로 7.2 산도를 조절 냉각하면. 그럼 1X PBS 500 ML에 볼륨을 조정합니다.
- 조직 퍼가기
- 일 2 : 4 미리 시원한 1X PBS와 에탄올 시리즈 ° C.
- 샘플 트위어을 씻어얼음 30 분 1X PBS에 각에 대한 CE.
참고 : 다시 각 솔루션의 큰 초과를 사용하는 것이 좋습니다. - 다음과 같이, 얼음, 에탄올 시리즈를 통해 그들을 복용하여 샘플을 탈수 :
- 10 % 에탄올 30 분,
- 30 % 에탄올 30 분,
- 50 % 에탄올 1 시간
- 70 % 에탄올 1 시간
- 85 % 에탄올 1 시간
- 95 % 에탄올 1 시간,
- 일시간 각 100 % 에탄올 3 변경
- 하루의 끝에, 4 박 100 % 에탄올에 0.1 %의 Eosine하여 에탄올을 대체 ° C. Eosine 얼룩은 세포 벽이 포함하고 sectioning 동안 샘플이 더 뚜렷해.
참고 : 시간이 여기에 표시가 3x3x3 mm하지만 더 이상 incubations가 큰 샘플이 필요할 수 있습니다 블록에 최적화된되었습니다.
샘플은 몇 달 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올에 저장할 수 있습니다. 3 일 : 다음날 아침, 한 시간 동안 실내 온도에 샘플을 따뜻하게. 그런 다음 다음과 같이 histoclear와 함께 점차 에탄올을 대체 :
- 하루의 끝에서, Paraplast 플러스 칩 1 / 4 볼륨을 추가하고 60 ° C의 오븐에 병을 놓습니다. 또한 Paraplast 칩과 비커를 기입 항상 손에 갓 녹은 왁스를 위해이 자주 보충.
참고 : 오븐의 온도가 60 이상 Paraplast의 중요한 연장 난방있다 ° C는 피해야한다. - 일 4 : 점차적으로 정기적으로 더 많은 파라핀 칩 (매 시간) 추가하여 Paraplast으로 histoclear를 교체하십시오. 하루의 끝에서 조심스럽게 histoclear / 왁스 혼합물을 부어 즉시 순수한 용융 왁스로 바꾸십시오. ° C 야간 60 샘플을 둡니다.
- 일 5와 6이 : s를 유지 신선한 녹은 왁스로, 매 4 시간 정도, 매일 Paraplast 3 회 변경60 amples ° C.
참고 : 그것을 하루 한 번만 왁스를 변경할 수 있지만, 밀랍이 최소한 5 ~ 6 번 변경할 필요로 조직 준비가 완료 며칠 걸릴 것입니다. 이들이 100 % EtOH 및 / 또는 왁스로에있는 조직 샘플의 진공 침투는 더욱 조직의 침투와 삽입을 향상시킬 수 있습니다. 왁스의 샘플 진공 침투는 60 ° C.에 완료되어야합니다 - 일 7 : 한번 더 왁스를 변경합니다. histoclear의 냄새가 완전히 사라질되어야하며 샘플 그날 나중에 임베디드 수 있습니다.
- 60 큰 온난 플레이트를 설정 ° C 알루미늄 호일에 의해 보호.
- 퍼가기의 방법은 분석되는 조직의 종류에 따라 달라집니다. 이 단계에서 가장 중요한 포인트는 샘플이 나중에 sectioning에 대해 올바르게 방향으로되어 있는지 확인하는 것입니다. 한 가지 방법은 플라스틱 금형 및 고리를 사용하는 것입니다. 온난 판에 금형을 따뜻하게하고 금형의 하단 부분에 녹은 왁스를 부어. 이전원하는 위치에 따뜻하게 포셉과 동양 그걸로 금형에 조직 샘플. 몰드에 화이트 반지를 놓고 조직이 완전히 덮여 그러한 추가 녹은 왁스를 추가합니다. 조심스럽게 벤치 접시에서 금형을 이동합니다. 왁스가 점차 진정하자.
또 다른 가능성은 60 ° C 예열 판에서 작업하는 동안 용융 왁스 (샘플이 완전히 왁스에 의해 적용되어야 함)가 포함된 배양 접시에있는 모든 샘플을 배포하는 것입니다. 따뜻한 집게로 샘플을 적웅시키다. 끝에 접시를 전환합니다. 왁스가 확정되면, 페트리 접시가 벤치로 이동 후 4 저장할 수있다 ° C. 언제 sectioning 준비, 조직 샘플을 포함하는 작은 블록은 따뜻하게 블레이드와 페트리 접시 밖으로 자르고 녹은 왁스의 추가 드롭과 마이크로톰 표본 홀더에 장착할 수 있습니다. sectioning 전에 몇 분 동안 샘플을 강화합시다.
참고 : 블록 수4 저장 ° C 일년 이상. 조직 고정 및 포함에 대한 자세한 유용한 도움말을 보려면, 심판을 참조하십시오. 16
2. 프로브 준비
- 복제
프로브는 보통 관심의 유전자 중 하나 이상의 특정 지역에 생성됩니다. 고도로 반복적인 시퀀스는 프로브에서 제외되어야하지만, 같은 전사 인자의 DNA 결합 모티브로 보존되어 단백질 도메인, 해당 시퀀스는 일반적으로 유전자의 특정 표현 패턴에게 8,9,12,15 (그림 1) 얻을 것입니다. 이 RNAse 이후 하이브 리다이 제이션 단계에서 치료 (아래 참조) 유전자 가족 구성원 사이의 프로브 교차 하이브 리다이 제이션의 수준을 감소 때문입니다. RNA의 duplexes의 불일치에 RNAse는 클리브, 후속 단계 씻어 것입니다 불완전 complementarity와 녹취록에 hybridized fragmenting 프로브.
일반적으로 몇몇 프로브는 관심의 각 유전자에 대한 검사를해야 할 수 있습니다. 프로브의 길이는 150 기지만큼 짧은하실 수 있습니다. Althoug프로브의 길이에는 제한이없는 H는 다음 1.5 킬로바이트은 일반적으로 더 좋은 녹음 짧은 단편. 베꼈는데 수 DNA 조각은 T3, T7, SP6 또는 발기인 (예 : pCRII - TOPO, Invitrogen)를 포함하는 벡터로 복제됩니다. 또는, T3, T7 또는 SP6 발기인 시퀀스는 프로브 영역을 확장에 사용되는 역방향 프라이머에 5' - 꼬리로 포함될 수 있습니다.
현장 하이브 리다이 제이션 실험의 모든에서, 우리는 하이브 리다이 제이션 패턴이 알려진 어떤이 일관되게 작동되는에 대한 긍정적인 제어 프로브뿐만 아니라 대조군 (그림 1D 및 H)를 포함합니다. 후자는 관심의 조직에 녹취록에 잡종을하지 알려진 임의의 RNA 프로브 수 있습니다. 이 분석에서 유전자의 감지 프로브를 사용하는 일반적인 있지만, 이것은 필요하지 않으며 비 hybridizing RNA의 목적에 맞게합니다. 가능하다면, 관심있는 유전자의 transcriptional NULL의 allele의 조직은 뛰어난 부정적인 제어 역할을합니다. - 모터의 사이트에 반대 삽입의 끝에 소화 제한 효소로 약 5 μg DNA를 소화하여 플라스미드를 Linearize. 3' - 오버행를 떠나 제한 효소를 사용하지 마십시오. 중합 효소가 전사를 계속 기판으로 3 '오버행을 활용할 수 있기 때문에 이것은 전사 유물을 초래할 수 있습니다. 또는, T3, T7 또는 SP6 발기인을 포함하여 프로브 지역은의 시험 관내 전사 반응에 대한 DNA 템플릿을 생성하는 PCR에 의해 증폭 수 있습니다.
- 반응이 완료 간 것을 확인하기 위해 젤에서 나누어지는를 확인하십시오.
- / 페놀 클로로포름으로 DNA를 추출 에탄올로 침전하고 1μg/μl의 농도 milliQ H 2 O에있는 DNA 펠렛을 resuspend. 또는 DNA는 표준 DNA 정제 컬럼을 사용하여 청소하실 수 있습니다.
- 혼합에 의한 시험 관내 전사 반응에를 설정합니다 :
- 1μl PUrified DNA (1μg/μl)
- 2μl 10X 전송 버퍼
- 2 μL 10X 발굴 RNA 상표 믹스
- 1μl RNAse OUT
- 2μl T3, T7 또는 SP6 RNA 효소 (20 U / μl)
- 20μl에 H 2 O까지.
37 품어 ° C 1-2시간하십시오. 나중에 젤에 대한 분석 1μl 유지.
참고 : 형광 - 라벨이 프로브는 동물 시스템에서 선호하지만, 인해 식물에 대한 현장 하이브 리다이 제이션 프로토콜에서는, 대부분의 식물 조직의 자동 형광 높은 더 많이 radiolabeled 프로브 17 immunohistochemistry에 의해 감지 발굴 - 분류 프로브를 사용합니다. - 전사 반응 75 μL MilliQ H 2 O 5 μL RQ1 DNAse (1 U / μl)를 추가 37 10 분 ° C를 반응을 잠복기에 의해 DNA 템플릿을 제거합니다.
- 비 통합 세포핵과 작은 기록을 제거하는 체외에서 전사 반응을 정화. 한 신에 게 보이 기bility는 미니 빠른 스핀 RNA 열 (Roche는)와 같은 크기 배제 Sephadex ® 컬럼을 사용하는 것입니다. 또는 전사 반응은 종래의 LiCl / 에탄올 침전 (심판을 참조하십시오. 14)에 의해 정화하실 수 있습니다. 나중에 젤을 확인하기 위해 1μl 유지.
- 길이 250 기지 이상의 프로브는 일반적으로 부분적으로 약 150 NT 따라서 효율적으로 조직 섹션을 뚫을 수있을 정도의 작은 RNA 분자를 얻을 hydrolized 있습니다. 60 정화 전사 반응과 부화 ° C.에 2X 탄산 버퍼의 동일한 볼륨 (80 MM NaHCO 3, 120 MM 나 2 CO 3) 추가 배양 시간은 다음 수식으로 계산되어야합니다
시간 = (리튬 - LF) / (K X 리가 X LF)
어디 리 = 초기 프로브 길이 (KB)를, 만약에 = 최종 프로브 길이 (0.150 KB), K = 0.11 KB / 분. 젤 확인 2 μL 보관하십시오. - 10% 초산의 20분의 1 볼륨을 추가하여 가수 분해 반응을 중화.
- 탐사선은 다음 푸리입니다10분의 1 볼륨 3M NaAc 산도 5.2 더하기 2.5 볼륨 차가운 100 % 에탄올 tRNA (100mg/ml)의 1μl를 추가하고, 30 분 -80 ° C에서 잠복기에 의해 얘기 들이었다. 4 20 분에 대한 13,500 RPM ° C.에서 원심 분리하여 RNA를 침전 뜨는을 취소하고 500μl 70 % 에탄올로 RNA 펠렛을 씻어. 다시 원심 분리기, 펠렛 공기 건조를 (일반적으로 약 15 분)하자, 그리고 50μl 50% deionized 포름 아미드의 RNA를 resuspend. 프로브는 -80 ° C에서 사용할 때까지 보관해야합니다.
- 태 아가로 오스는 섹션 2.2.4, 2.2.6 및 2.2.7 (그림 2A)에서 중간 제품뿐만 아니라 최종 제품을 젤 정규 1 % 확인합니다. 이것은 시험 관내 전사 반응에의 효율성 모니터링을 허용합니다.
참고 : 시험 관내 전사 반응에서이 템플릿의 1 μg 당 RNA의 약 1 μg를 얻을 것입니다. - 도트 얼룩 분석
프로브 농도 및 발굴 - UTP의 설립은 얼룩 점 분석 (그림 2B)로 평가하실 수 있습니다. 시리얼 RNA의 dilutions는 알려진 농도의 표시 제어 RNA와 함께 표준 하이브 리다이 제이션 막에 발견됩니다. 예를 들어, 우리는 발굴 - UTP가 제어 RNA 프로브는 시험 관내 전사 키트 (Roche는)에 포함된 레이블 사용합니다. 정확한 농도를 확립하기 위해 각 프로브에 대해 여러 dilutions를 테스트하는 것이 좋습니다.- 70 1X TBS 버퍼 (100 MM 트리스 - HCL pH7.5, 150 MM NaCl) ° C에서 차단 시약의 0.5 %를 용해하여 차단 버퍼를 준비 후, 실온까지 해결책은 식지.
- N에 체외에서 베꼈는데 및 제어 프로브 + 나일론 막 일련 dilutions (일반적으로 10 -1 10 -5 일)의 현장 1μl. UV 교차 연결하여 RNA를 수정.
참고 : 멤브레인의 최소 표면이 나중에 필요한 버퍼의 크기를 줄이기 위해 사용해야합니다. - 떨고 플랫폼에서 실온 (RT)에서 5 분 1X TBS에서 멤브레인를 평형.
- 차단을 사용하여 세포막을 차단떨고 플랫폼에서 RT 30 분 버퍼.
- 5 분 1X TBS에서 멤브레인을 씻어.
- RT에서 45 분 동안 1X TBS의 10 ML에 반 (反) digoxigenin - AP의 1μl를 diluting, 안티 파다 항체와 멤브레인를 품어.
- 15 분마다 1X TBS에서 두 번 멤브레인 씻으십시오.
- 5 분 1X TN 버퍼 (100mM 트리스 - HCL 산도 9.5, 100mM NaCl)에 멤브레인를 평형.
- 1X TN 버퍼에 NBT / BCIP 50분의 1 (V / V)와 잠복기하여 세포막을 얼룩. 얼룩 5-10 분 걸릴 수 있습니다. 이후 물로 씻어 멤브레인, 그것은 다음 건조하고 기록으로 보관하실 수 있습니다.
참고 : NBT / BCIP은 가수 분해에 진한 파란색 염료를 생산하는 안티 발굴 항체에 복합 알칼리 인산 분해 효소의 기판입니다.
3. Sectioning
- 상온에 블록을 따뜻하게. 블록이 너무 추운 경우, 개별 섹션 왁스 '리본'을 형성도 안하고 있습니다. trape로 블록을 손질zoid 형태는 샘플 주위에 왁스의 1mm에 관한 떠나.
- 대형 슬라이드를 따뜻하게 35-37에서 따뜻한 ° C.
참고 : 많은 프로토콜이 42에서이 단계를 할 ° C 그러나 35-37로 온도를 감소 ° C의 섹션에 따라 거품의 형성을 방지한다. - 더 이상 두 평행의 얼굴이 바닥에 있습니다 이러한 마이크로톰에 블록을 삽입합니다. 조심스럽게 블레이드 앞으로 블록을 가지고 있으며 블록의 표면이 블레이드에 평행하게되어 있는지 확인합니다. 8 두께 항 - 10μm. 왁스 리본은 관심있는 부분을 선택하기 위해 알루미늄 호일이나 종이 필터와 같은 비 끈적끈적한 표면에 정렬하실 수 있습니다. 이 근처 해부 현미경을 사용하여 평가하실 수 있습니다.
참고 : 조직의 eosin의 얼룩은 조직이 제대로 삽입 중에 침투되었는지 여부를 표시를 제공합니다. 블록의 중심이 eosin 물들일되지 않는 경우는 일반적으로 조직이 제대로 고정을 나타냅니다. - 마크 플러스 SL - 프로브에연필 (대부분의 펜 또는 마커가 현장 하이브 리다이 제이션 프로토콜 중에 삭제됩니다) 그것에 깨끗한 milliQ H 2 O의 1mL를 배포할과 십오 일. 조심스럽게 상온 (실온에서 작업할 때 물에에 섹션을 조작하는 것이 더 쉽습니다)의 수면에 대한 관심이 섹션을 떠. 반짝 이는 측면 (리본은 마이크로톰의 벗기으로 하단 측면)은 물을 얼굴 있는지 확인하십시오. 그런 다음 따뜻한 슬라이드로 천천히 슬라이드를 전송합니다. 가열 섹션 물의 표면에 확산하는 데 도움이됩니다. 5 분 후, 조심스럽게 하나 부드러운 움직임에 물을 부어 내려 때문에 리본이 슬라이드에 아래로 인하됩니다. 37 적어도 몇 시간 또는 하루에 대한 슬라이드가 건조 해 ° C, 그래서 조직을 준수합니다.
참고 : Sectioned 조직이 4 주 며칠 ° C에 대한 실리카 건조와 함께 상자에 저장할 수 있습니다, 그러나, 가능한 한 빨리 슬라이드를 사용하는 것이 최선입니다.
4. 원위치 하이브리드에ization
- 섹션 전처리
각 솔루션에 필요한 볼륨 분명히 치료와 컨테이너의 크기가 사용할 슬라이드의 숫자에 따라 달라집니다. 섹션은 항상 완전히 빠져들 것입니다. 25 - 슬라이드 랙 및 깔끔하게 피팅 컨테이너, 200-250 ML는 충분합니다. 부화 단계의 대부분은 매우 짧은이기 때문에, 우리는 일반적으로 먼저 가능한 솔루션을 준비하고 다음 슬라이드 미리 치료를 시작합니다. 그러나, 아세트산 무수물 솔루션은 사용 및 프로 테아제가 사용시 추가되기 전에 바로 준비해야합니다. 별도로 명시하지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 또한, 모든 버퍼가 주식 솔루션으로 10 배 농도에서 준비하실 수 있습니다.- 37 ° C.에 컨테이너에있는 프로 테아제 버퍼 (100 MM 트리스 산도 8.0, 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 따뜻하게
- Deparaffinize 다음과 같이 조직 섹션 rehydrate :
- histoclear - 10 분 (유리 접시를 사용)
- histoclear - 10 분 (를 사용하여유리 접시)
- 100 % 에탄올 - 1 분
- 100 % 에탄올 - 30 초
- 95 % 에탄올 - 30 초
- 85 % 에탄올 - 30 초
- 70 % 에탄올 - 30 초
- 50 % 에탄올 - 30 초
- 30 % 에탄올 - 30 초
- 10 % 에탄올 - 30 초
- milliQ H 2 O - 1 분
- 두 분 1X PBS에 품어.
- 250 ML 프로 테아제 버퍼 미리 예열 37 ° C와 37에서 20 분 슬라이드를 품어 ° C.에있는 프로 테아제 50mg/ml의 625μl를 혼합
참고 : 프로 테아제는 고정 단백질을 소화하고 셀룰러 RNAs에 프로브 접근을 높이기 위해 필요합니다. 그것은 조직의 붕괴없이 하이브 리다이 제이션 신호를 최대화하기 위해 부화의 시간을 제어하는 것이 중요합니다, 따라서 일부 최적화는 각 조직 샘플에 필요한 수 있습니다. - 두 분 1X PBS에 0.2 % 글리신의 프로 테아제의 활동을 중화.
- 2 분 한번은 1X PBS에서 슬라이드를 씻어.
- 슬라이드에게 I를 치료N 4% PFA 솔루션은 10 분에 대한 단백 분해 효소 처리에 의해 손상될 수있는 RNA를 다시 수정합니다.
- 2 분 각 1X PBS로 두 번 슬라이드를 씻어.
- 슬라이드는 PBS에 세척하는 동안, 236.25 ML milliQ H 2 O로 2M triethanolamine의 12.5 ML (100ml milliQ H 2 O에서 29.8g, HCL와 pH8.0)를 혼합하여 0.1 M triethanolamine 솔루션 산도 8.0 250 ML을하다 유리 접시 인치 에서 슬라이드를 올려 놓기 전에 바로 triethanolamine 버퍼에 1.25 ML 아세트산 무수물을 추가하고 잘 저어. 슬라이드를 추가한 후, 10 분 천천히 저어로 진행합니다.
이것은 슬라이드 선반이 triethanolamine / 아세트산 무수물의 컨테이너에 상승되어 있어야합니다. 우리는 지원 스탠드와 클램핑 시스템을 사용합니다.
참고 :이 단계에서 프로브가 아닌 특정 바인딩 발생할 수 있습니다 긍정적으로 청구 아미노산 그룹 acetylated 있습니다. 또한, 아세트산 무수물은 독성이며이 솔루션은 따라서 퓸 후드에 준비하고 적절하게 처리되어야합니다 <./ 리> - 두 분 1X PBS로 두 번 슬라이드를 씻어.
- 다시 조직 섹션 탈수 :
- H 2 O - 1 분
- 10 % 에탄올 - 30 초
- 30 % 에탄올 - 30 초
- 50 % 에탄올 - 30 초
- 70 % 에탄올 - 30 초
- 85 % 에탄올 - 30 초
- 95 % 에탄올 - 30 초
- 100 % 에탄올 - 30 초
- 100 % 에탄올 - 30 초
- 이종 교잡
- 85 ° C.에 가열 블록을 따뜻하게
- 하이브 리다이 제이션 버퍼를 준비합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 소금에 팔콘 튜브 1.25 ML (3M NaCl, 100mM 트리스 - HCL 산도 8.0, 100mM 나 인산 pH6.8, 50mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 10 ML, 조합, 5 ML deionized 포름 아미드, 2.5 ML 50% Dextran 황산, 250 μl 50x Denhardt 125 μl 100mg/ml tRNA, 그리고 875 μl H 2 O. <BR /> 참고 : Dextran 황산은 매우 점성 때문에, 그것이 앞서 열을 가하다 60에 대한 해결책 최선 ° C 쉽게 pipetting 할 수 있습니다. 하이브 리다이 제이션 버퍼 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 다른 프로브를 준비합니다. 각 슬라이드에 대한 9 μl milliQ H 2 O 10 μl deionized 포름 아미드 1 μl 프로브를 섞는다. 85에 프로브를 가열 ° 2-3 분 C, 얼음, 원심 분리기를 간략하게, 그리고 슬라이드 당 80μl 하이브 리다이 제이션 버퍼 프로브를 추가할에 즉시 냉각. pipetting으로 잘 믹스지만, 거품을 만들어 피하십시오.
참고 : 슬라이드마다 추가되는 프로브의 금액은 경험적으로 검증이 필요합니다. 일반적으로 프로브는 0.5 NG / KB / μl 프로브 복잡 최종 농도에 사용됩니다. hybridizations가 슬라이드 당 100 μl로 수행하기 때문에, 프로브의 약 25 NG는 길이 1 - KB 길이 프로브에 대해 프로브 슬라이드 당 50 NG에 0.5 - KB 아르 프로브에 대한 슬라이드마다 필요합니다. 단순화하기 위해, 우리는 자주 0.5, 1을 시도하고, 슬라이드 당 4 μl 프로브. - 에서 슬라이드를 장소표면을 청소하고 공기 5-10 분 완전히 말리면. 슬라이드의 오른쪽 가장자리에 Pipet 프로브 / 하이브 리다이 제이션 버퍼 섞는다. 점차적 슬라이드로 coverslip을 내리고, 하이브 리다이 제이션 솔루션은 모든 거품없이 모든 부분을 다루고 있는지 확인하고. 거품이 모든 조직 부분에서 그들을 치환하는 형태로 손가락으로 가볍게 coverslip을 누릅니다. 이 섹션을 손상시킬 수로 커버가 벗어 버리는 당기지 마십시오.
참고 : 일반적으로이 단계에 사용되는 다른 방법은 동일한 프로브와 함께 incubated 두 슬라이드의 "샌드위치"를 준비하는 것입니다. 이 방법에 대한 자세한 내용은 심판을 참조하십시오. 14. - 완벽하게 평평한 플라스틱 상자에 습도 챔버를 준비합니다. 워트 먼지 종이 상자 하단의 커버는 milliQ 물로 moistened parafilm는 코너가 밝혀두고있는 종이를 덮고, 플라스틱 상자에 슬라이드를 삽입하고 단단히 상자를 밀봉.
- 원하는 하이브 리다이 제이션 온도, 일반적으로 50 슬라이드를 품어 - 55 ° C, F또는 16-20시간.
- 다음날 아침에 사용하기 위해, 55 ° C.에 1리터 0.2x SSC를 준비하고 이것을 저장 또한, 1리터 NTE 버퍼를 준비 (0.5 M NaCl, 10 MM 트리스 - HCL pH7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) pH8.0) 37 시에 매장 ° C.
- 포스트 하이브 리다이 제이션 치료
- 섹션을 손상하지 않도록 신중하게 coverslips를 제거합니다. 랙에 슬라이드를 놓고 한 시간 동안 55 ° C에서 0.2x SSC 두 번 그들을 씻는다.
참고 : 슬라이드를 수직으로 배치하는 경우 Coverslips 자주 쉽게 떨어질. coverslip 첨부 남아있는 경우, coverslip 씻어 1 또는 2 분 따뜻한 0.2x SSC에있는 슬라이드를 담가. 이 섹션에 손상을 일으킬 수 있으므로, 슬라이드의 coverslip을 떼어 내지 마십시오. - 그 동안에, 500 ML의 세척 버퍼 (1 % BSA, TBS 버퍼에 0.3 %의 트리톤) 100 ML 차단 솔루션 (0.5 %는 TBS 버퍼에 시약을 차단)을 준비합니다. 천천히 70 가열 TBS에 차단 분말을 저어 ° C하고 실온까지 식지 dissolv 번에드.
참고 : 버퍼를 세척하고 필요한 솔루션은 단계 4.3.8 -11에 사용되는 평면 플라스틱 상자의 크기에 따라 달라집니다 차단의 권. 그것은 완전히 튼 해산하기 위해 다소 시간이 걸릴 수 있으므로 사전에 충분한 솔루션을 준비합니다. - 두 분 1X NTE에서 슬라이드를 평형.
- RNAse에 1X NTE 버퍼에 20μg/ml RNAse 직전 37 품어 사용 ° C를 30 분 추가됩니다.로 슬라이드를 전송하여 치료를 진행
참고 : RNAse RNA의 duplexes의 불일치에서 앞을 무료로 단일 좌초 RNA뿐만 아니라. 죽습 탐지 조각이 마지막 0.2x SSC 세차 (4.3.6 참조)에 씻어 그대로이 단계는 프로브가 아닌 특정 바인딩의 수준을 줄일 수 있습니다. - 2 분 각 1X NTE에 두 슬라이드를 씻어.
- 한 시간 만이라도 55 ° C에서 신선한 0.2x SSC에있는 슬라이드를 씻으십시오.
- 상온에서 5 분 1X PBS로 슬라이드를 평형.
- 일에 선반에서 슬라이드를 전송전자 평평한 플라스틱 상자의 하단과 차단 솔루션의 최소 볼륨으로 그들을 커버. 천천히 흔들어 플랫폼에서 45 분에 대한 슬라이드를 차단합니다.
- 두 번째 깨끗한 평면 플라스틱 상자에 슬라이드를 전송하고 흔들림 플랫폼에서 버퍼를 세척과 함께 45 분 그들을 씻는다.
- 항체 보육로 진행합니다. 버퍼 (1시 5분 V / V)를 세척의 방지 digoxigenin 항체를 희석하거나, 각 슬라이드에 직접 최소한의 볼륨을 적용하거나 평평한 플라스틱 상자에 슬라이드를 장소와 항체 솔루션의 최소한의 볼륨을 커버. 4 2-3 상온에서 시간 또는 하룻밤 동안 짙은 어둠 속에서 슬라이드를 품어 ° C.
- 15 분 각각의 플랫폼을 흔들어에 버퍼를 세척과에 대한 슬라이드에게 4 번 씻으십시오. 세정 버퍼와 평평한 플라스틱 상자의 최소한의 볼륨을 사용합니다. 세척의 각 사이의 플라스틱 상자를 청소하십시오.
참고 : 세척 사이의 상자를 청소 슬라이드에있는 일반적인 배경을 감소합니다. 이것을 단순화하기 위해, 우리는 두 동일한 평면 상자를 사용하여각 세척 후에 깨끗한 상자에 슬라이드를 전송합니다. - 두 분 1X TBS로 슬라이드를 전송합니다.
- 2 분 각각에 대해 두 번 TN 버퍼에 슬라이드를 평형.
- 당장 1 ML TN 버퍼 당 20 μl NBT / BCIP를 추가하여 사용하기 전에 얼룩 솔루션을 준비합니다. 작은 플라스틱 계량 접시에 얼룩 솔루션을 붓고. 샌드위치 두 마주 섹션과 함께 슬라이드. 모세관 작업 솔루션을 끌어 수 있도록 솔루션에 샌드위치 중 하나가 긴 측면을 찍어. Kimwipe에 슬라이드를 배수하고 다시 항체 솔루션 슬라이드를 채우십시오. 당신은 솔루션 거품을 피하기에 흐르는으로 슬라이드를 도청 할 수 있습니다. 어둠 속에서 상온에서 플라스틱 상자와 저장소에있는 슬라이드를 삽입합니다.
- 일 15 일 10 : 새로 고침 TN 버퍼에 슬라이드를 rinsing 신선한 얼룩 솔루션을 포함하는 새로운 샌드위치를 준비하여 1~5일에 두 번씩 매일 얼룩 솔루션입니다.
참고 : 정기 INT에 얼룩 솔루션을 교체ervals 배경 비율로 신호를 향상됩니다. 신호의 개발은 화합물 또는 스테레오 - 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 그들은 얼룩의 순찰 사이에 TN 버퍼에 한 번 또는 그들은 단지 영구 장착하기 전에 물에 전송하는 동안 그것은 섹션을 사진 수 있습니다.
- 섹션을 손상하지 않도록 신중하게 coverslips를 제거합니다. 랙에 슬라이드를 놓고 한 시간 동안 55 ° C에서 0.2x SSC 두 번 그들을 씻는다.
- 설치
- 신호가 명확되면 milliQ H 2 O에있는 슬라이드를 씻어 에탄올 시리즈를 통해 신속하게 탈수 :
- 10 % 에탄올 - 10의
- 30 % 에탄올 - 10의
- 50 % 에탄올 - 10의
- 70 % 에탄올 - 5의
- 80 % 에탄올 - 5의
- 95 % 에탄올 - 5의
- 100 % 에탄올 - 5의
- histoclear - 2 분
- histoclear - 2 분
- 각 톨루엔 기반 설치 매체 중 하나 또는 두 방울을 배치하여 슬라이드 마운트 하락E 천천히 거품의 형성을 피하 슬라이드로 coverslip을 절감. 복합 현미경 결과를 분석하기 전에 장착 매체 강화는 밤새하자. 일단 마운트, 슬라이드는 상온에서 년 동안 저장할 수 있습니다.
- 신호가 명확되면 milliQ H 2 O에있는 슬라이드를 씻어 에탄올 시리즈를 통해 신속하게 탈수 :
5. 대표 결과 :
1-5일 후, 붉은 보라색 신호는 프로브가 보완 성적표 (그림 1) hybridized가 그 세포에서 개발합니다. 색상 신호 따라서 관심의 유전자의 표현 패턴의 세포 해상도에서 직접 시각화를 제공합니다. 약한 배경 얼룩도 식물 조직의 프로브 또는 얼룩 (그림 3)의 비 특정 바인딩에서 발생하는 개발 있습니다. 이러한 배경 신호는 조직의 작은, 적은 결정 세포에서 상대적으로 더 발음 될 수도 있지만 배경 얼룩도 부정하고 긍정적인 제어 프로브에 hybridized 섹션에 준수하고 없을 것실험 사이에서 재현할 수 있습니다.
그림 1. 대표 결과는 Arabidopsis와 옥수수 조직에서 다른 탐사선과 획득하였습니다. Arabidopsis의 현장 hybridizations (AD)와 옥수수 (EH) 조직에서 설명된 프로토콜의 성공적인 완료를 기대할 수 있습니다 결과의 유형을 보여주는 독특한 유전자 특정 프로브와 함께. (A) Arabidopsis 식물 촬영 꼭대기에 SHOOTMERISTEMLESS1 (STM)의 현지화가, 분열 조직과 주변 단풍 신호의 부족 미지의 세포에 보라색 파란색 신호의 존재를 확인합니다. 몇 배아 줄기 세포에서 CLAVATA3 (B) 표현을 보여주는 Arabidopsis 어뢰 무대 배아의 (BD) 섹션, AtML1 (C) 표피 레이어에 표현하고, 섹션에 신호의 부족 무작위 대조군 RNA (D와 탐지). 개발 옥수수 배아에서 STM의 상동체의 knotted1의 (E) 현지화, 참고 특히 배아 분열 조직과 루트에 강한 신호. arf3a (F) 및 ocl4 (G)에 대한 현장 하이브 리다이 제이션 패턴에 뚜렷한 보여주는 옥수수에서 식물 촬영 꼭대기와 부정적인 제어 프로브 (H)에 대한 하이브 리다이 제이션 신호를 통해 (FH) 세로 섹션. AtML1 상동체의 ocl4가 표피에 구체적으로 표현이지만 arf3a는 abaxial / 아래쪽 잎 표면에 표시됩니다.
다음과 같은 유전자 조각은 프로브로 사용되었습니다 : STM : 아미노산 81 포함한 cDNA 지역 - 382, 보존 homeodomain을 포함, CLV3 : cDNA의 전체 길이, AtML1 : 세 번째 엑손, kn1 : 전체 열린 독서 프레임, arf3a를 : 세포핵 9 - cDNA 클론 HM004539의 225, ocl4 : 여러 가지 보존 단백질 도메인을 포함 cDNA 전체 길이의 3 '1.7 킬로바이트
그림 2. 시험 관내 전사 프로브의 제작하면서 포인트를 확인. (A) 현장 하이브리드화 프로브에서 탄산 가수 분해 - 경우 후 DNase 처리 및 시험 관내 전사 반응 (B)의의 후속 정화 후, (A) 시험 관내 전사 이후 표준 아가로 오스 겔에 선택되어 있는지 확인 필요 - (C) 언제 사용 (D) 준비. 이러한 프로브 1로 길이가 250 BP, 이상의 프로브 들어, 탄산 가수 분해가 작은 프로브 조각 (브라켓)의 범위를 얻을 것입니다. (B) 점 얼룩 분석 프로브의 Colorimetric 부량. 10 -1에서 100 μl / NG 제어 프로브 (1) 10 -5하고 새로 발굴 - 라벨 프로브 (2-4) 세까지 Dilutions는 안티 파다 항체와 incubated 전송 막에 발견, 그리고 assayed 아르 프로토콜의 섹션 2.3에 명시된 colorimetric 분석을 사용하여. 분석 제안다음 예상 농도 : 프로브 2 ~ 100 NG / μl, 프로브 3 ~ 10 μl / NG 프로브 4 ~ 1 NG / μl. 프로브 4 현장 하이브리드화 신호에 좋은 항복하지 않을 수 있습니다.
그림 3. 잘 작동 탐사에 비 특정 프로브의 비교. 아닌 특정 배경 신호 (A) 및 외부 셀 층 (B)에 OCL5 프로브에 대한 현장 하이브 리다이 제이션 신호에서 특정을 보여주는 옥수수에서 식물 촬영 꼭대기를 통해 세로 섹션.
그림 4. 현장 하이브 리다이 제이션 프로토콜의 단계의 타임 라인을 보여주는 다이어그램. 조직 퍼가기 단계는 오렌지색에서 녹색, 프로브 - 준비 단계로 표시하고, 파란색으로 현장 하이브 리다이 제이션 단계에서. 아르 이 타임 라인은 생각하는 DNA templa프로브의 체외의 해독에 대해 처리할 수 있습니다. Parafin - 임베디드 조직 블록 및 발굴 - 라벨 프로브는 사용 시간까지 ° C 및 -80 ° C, 각각 4 미리 준비하고 저장할 수 있습니다. 현장 하이브 리다이 제이션 프로토콜은 다음과 같은 약간의 사로 일 이내에 완료할 수 있습니다.
Discussion
여기에 명시된 현장 하이브 리다이 제이션 방식의 좋은 세포 해상도, 높은 감도와 특이성과 관심의 유전자의 spatiotemporal 표현 패턴의 직접 시각화 수 있습니다. 프로토콜은 유전자 간의 표현 수준의 양적 비교를 허용하지 않습니다. 그러나, 방법의 높은 감도와 해상도가 유전자 발현을 분석 대부분의 다른 방법으로 가능하지 않은 조직이 8, 18, 내의 유전자 발현의 그라디언트를 공개하실 수 있습니다.
프로토콜 문제 해결은 문제가 만들 수있는 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 조직의 고정 및 프로브의 선택과 라벨입니다. 낮은 발굴의 설립과 함께 저조한 침투 조직 및 프로브는 배경 위에 감지하기 어려울 수도 매우 약한 신호를 얻을 것입니다. 관심 각각의 새로운 유전자 들어, diffe에서 파생된 몇 가지 뚜렷한 프로브를 시도하는 것이 좋습니다명시 지역을 임대. 때때로, 유전자의 다른 작은 지역을 대상으로 두 개 또는 세 탐사선이 강하고 특정 하이브 리다이 제이션 신호를 얻기 위해 결합해야 할 수도 있습니다. 또한, 같은 온도와 하이브 리다이 제이션 버퍼 구성으로 하이브 리다이 제이션 조건, 각각의 유전자 또는 하이브 리다이 제이션 엄중을 낮추거나 높일 조직에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 단백 분해 효소 처리 단계는 변수이며 다른 식물 종 (种) 또는 매우 낮은 풍부한 성적의 검출을위한 프로토콜을 적응 변경할 수 있습니다. 모두 긍정적이고 부정적인 제어 프로브의 포함은 프로토콜의 문제 지점을 식별하는데 도움이 될 것입니다.
절차는 파라핀 - 임베디드 식물 조직 섹션에 최적화되어 있지만 사소한 수정은 현장 하이브리드화에서 전체 마운트에도 사용할 수 있습니다로. 널리 원위치 하이브리드화에서 동물 연구 19 전체 마운트에 사용되는 것은 있지만 리터 것입니다이러한 배아, 뿌리 또는 젊은 meristematic 조직 20,21 쉽게 침투 수있는 식물 조직에 imited. 프로토콜은 쉽게 동시에 두 개의 mRNAs를 검색하거나 단백질 15,22,23 함께 성적표를 집중하기 위해 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 식물의 작은 RNA 표현 패턴의 시각화에이 방법의 응용 프로그램을 확장하는 것이 가능합니다. miRNA 발현 패턴은 옥수수와 Arabidopsis 8,14 모두에서이 프로토콜을 사용하여 결정되었습니다. 최근 체외 베꼈는데 프로브에있는가에 의해 대체되었습니다 상용 파다 - 레이블 잠금 핵산 (LNA) oligo 프로브 그 증가 신호 감도 18, 24.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
MT의 연구실에서 연구는 국립 과학 재단 (DBI - 0820610 및 IOS - 1022102)와 건강의 뉴욕과 (NYSTEM - C024308)에서 기금에 의해 지원됩니다. CM은 교육과 과학 (2007-0937)와 재단 라파엘 델 피노, 스페인의 스페인 교육부에서 박사 장학금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
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