In Situ Hybridisering for presis lokalisering av Avskrifter i Plants

Summary

Det

Abstract

Med fremskritt i genomforskning av det siste tiåret, har plantebiologi sett tallrike studier presentere store kvantitative analyser av genuttrykk. Microarray og neste generasjons sekvensering tilnærminger blir brukt til å undersøke utviklingsmessige, fysiologiske og stressrespons prosesser, dissekere epigenetic og små RNA stier og bygge store genet regulatoriske nettverk ^1-3. Mens disse teknikkene lette samtidig analyse av store gen-sett, de vanligvis gir en svært begrenset i tid og rom oppløsning av genuttrykk endringer. Denne begrensningen kan delvis løses ved hjelp av enten profilering metode i forbindelse med lasermicrodissection eller fluorescens-aktivert celle sortering ^4-7. Men for å forstå de biologiske rollen av et gen, er kunnskap av sin tid og rom mønster av uttrykket på en mobil løsning avgjørende. Spesielt når studere utvikling eller effekten av miljømessige STImuli og mutanter kan detaljert analyse av et gen uttrykk mønster blir avgjørende. For eksempel kan subtile kvantitative forskjeller i uttrykket nivåene av viktige regulatoriske gener fører til dramatiske fenotyper når forbundet med tap eller gevinst på uttrykk i spesifikke celletyper.

Flere metoder blir rutinemessig brukt for detaljert undersøkelse av genuttrykk mønstre. Den ene er gjennom analyse av transgene reporter linjer. Slike analyser kan imidlertid bli tidkrevende å analysere flere gener eller arbeider i planter gjenstridige til transformasjon. Dessuten er en uavhengig validering for å sikre at transgenet uttrykket mønsteret etterligner at av de endogene gen vanligvis nødvendig. Immunhistokjemisk protein lokalisering eller mRNA in situ hybridisering presentere relativt raske alternativer for direkte visualisering av genuttrykk i celler og vev. Sistnevnte har den klare fordelen at det kan være lett used på noen genet av interesse. In situ hybridisering muliggjør påvisning av target mRNAs i celler ved hybridisering med en merket anti-sense RNA probe innhentet av in vitro transkripsjon av genet av interesse.

Her vil vi skissere en protokoll for in situ lokalisering av genuttrykk i planter som er svært følsomhet og spesifikke. Det er optimalisert for bruk med Paraformaldehyde fast, parafin-embedded seksjoner, som gir utmerket bevaring av histologi, og DIG-merket sonder som er visualisert ved immuno-deteksjon og alkalisk-fosfatase kolorimetriske reaksjon. Denne protokollen har blitt brukt til en rekke vev fra et bredt spekter av plantearter, og kan brukes til å analysere uttrykk av mRNA så vel som små RNAS ^8-14.

Protocol

1. Prøvepreparering

Merk: Alle trinn opp til og med hybridisering trinnet er følsomme for RNase aktivitet. Det er derfor viktig å arbeide i rene forhold. Det er også ganske vanlig å gjøre alle løsninger RNase-frie ved å bruke DEPC-behandlet vann og glass bakes ved 180 ° C i minst 3 timer. Plastic containere er ofte renset gjennom behandling med 0,2 N NaOH i 30 min. Men ingen av disse forholdsreglene er viktig og vi bruker vanligvis vanlig ren milliQ H ₂ O for alle løsninger. Vi gjør holde atskilt reagenser, bokser og glass for in situ hybridizations og lagre disse i en ren skap.

1. Eksempel fiksering
   1. Dag 1: Forberede fersk 4% Paraformaldehyde (PFA) fiksativ. For 500 ml, varme 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO ₄ pH7.0) til 60 ° C og oppløse to pelleter av NaOH. I et avtrekksskap, tilsett 20 g paraformaldehyde og bland godt til det er oppløst. Plasser løsningen på is, og når avkjølt justere pH til 7,2 med H ₂ SO ₄ (1-2 dråper for 100ml). Deretter justere volumet til 500 ml med 1x PBS.
      Merk: Ikke bruk HCl å justere pH, da dette vil frigjøre svært giftige gasser. Paraformaldehyde er giftig; denne løsningen bør derfor være forberedt i et avtrekksskap og kastes på riktig måte. Dessuten er Paraformaldehyde oppbevares ved 4 ° C og bør kjøpes nytt hver 6-9 mnd.
   2. Høste vevsprøver og plassere dem umiddelbart i 15 mL frisk PFA fiksativ på is i glass scintillation hetteglass. Hvis vevet disseksjon er nødvendig, dette gjøres best på is i kaldt fiksativ.
      Merk: Det er viktig å bruke et stort overskudd av festing. Den generelle anbefalte ratio er å bruke 10-volumer av fiksativ til 1 volum av vev.
   3. Påfør et vakuum (~ 500 mm Hg) til prøvene mens på is. Hold et vakuum i 15-20 minutter, små bobler bør utgivelse fra prøvens, men det festing bør ikke komme til en byll. Slipp vakuum sakte, og fornye PFA fikseringsmiddel for å sikre at fiksativ fortsatt på riktig konsentrasjon. Gjenta dette trinnet inntil vevet vasken etter utgivelsen av vakuum.
      Merk: Fixation er nødvendig for å fikse og cross-link RNA-molekyler i vevet. Dette trinnet er kritisk dårlig faste materialer gi et lavt signal. Noen vev ikke synke umiddelbart, men de fleste vil til slutt synke over natten. For å forbedre infiltrasjon av fiksativ, kan følgende vaskemidler legges: Triton inntil 0,1% og / eller Tween opp til 0,1 - 0,3%. Alternativt etanol-basert fiksativ, som formaldehyd-alkohol-sure acid (FAA), kan brukes for vev som ellers ikke er lett infiltrert ^14,15.
   4. Skift PFA festing gang og holde hetteglassene ved 4 ° C over natten.
2. Tissue embedding
   1. Dag 2: Pre-cool 1x PBS og etanol serien ved 4 ° C.
   2. Skyll prøvene TWIce for 30 min hver i 1x PBS, på is.
      Merk: Igjen er det anbefalt å bruke et stort overskudd av hver løsning.
   3. Tørke prøvene ved å ta dem gjennom en etanol-serien, på is, som følger:
      • 10% etanol 30 min,
      • 30% etanol 30 min,
      • 50% etanol 1 time,
      • 70% etanol 1 time,
      • 85% etanol 1 time,
      • 95% etanol 1hour,
      • 3 Endringer på 100% etanol for 1hour hver
   4. På slutten av dagen, erstatte etanol med 0,1% Eosine i 100% etanol over natten ved 4 ° C. Eosine flekker celleveggen gjøre prøvene mer synlig under innebygging og seksjonering.
      Merknader: tiden er angitt her er optimalisert for blokker 3x3x3 mm men lengre inkubasjoner kan være nødvendig for større prøver.
      Prøver kan lagres i 70% etanol ved 4 ° C i flere måneder. Dag 3: Følgende morgen, varm prøvene til romtemperatur i én time. Deretter erstatte etanol gradvis med histoclear som følger:
      
   5. På slutten av dagen, tilsett 1 / 4 volum av Paraplast Plus chips og plasser flasken i en 60 ° C ovnen. Også fylle et beger med Paraplast chips og fylle dette ofte for å alltid ha ferske smeltet voks på hånden.
      Merk: Temperaturen i ovnen er viktig og langvarig oppvarming av Paraplast over 60 ° C bør unngås.
   6. Dag 4: Gradvis erstatte histoclear med Paraplast ved regelmessig å legge mer parafin chips (hver time). På slutten av dagen, nøye hell av histoclear / voks blandingen og umiddelbart erstatte den med ren smeltet voks. La prøvene ved 60 ° C over natten.
   7. Dag 5 og 6: Endre Paraplast 3 ganger daglig, ca hver 4. time, med ferske smeltet voks holde eamples ved 60 ° C.
      Merk: Det er mulig å endre voksen bare én gang om dagen, men vevet forberedelse ville ta et par ekstra dager å fullføre, som voks må endres minst 5 eller 6 ganger. Støvsug infiltrasjon av vevsprøver når disse er i 100% EtOH og / eller voks kan ytterligere forbedre infiltrasjon og innebygging av vev. Vacuum infiltrasjon av prøver i voks bør gjøres ved 60 ° C.
   8. Dag 7: Endre voks igjen. Lukten av histoclear skal nå være borte helt og prøvene kan bygges senere den dagen.
   9. Sett opp en stor varmeplate ved 60 ° C beskyttet av aluminiumsfolie.
   10. Metoden for embedding vil variere avhengig av type vev som skal analyseres. Det viktigste punktet på dette trinnet er å sørge for at prøvene er riktig vei for seksjonering senere. En måte er å bruke plast molds og ringer. Varm opp formene på oppvarmingen tallerken og hell smeltet voks inn i den nederste delen av mold. Overføren vevsprøve ned i formen med varmet tang og innrette den i ønsket posisjon. Plasser den hvite ringen på formen og legge til ytterligere smeltet voks slik at vevet blir dekket helt. Flytt forsiktig formen fra plate til benken. La voksen kjøles ned gradvis.

En annen mulighet er å distribuere alle prøvene i en petriskål med smeltet voks (prøvene skal være helt dekket av voks) mens han arbeidet på 60 ° C varm plate. Orientere prøvene med varm tang. På slutten, slå av platen. Når voksen er stivnet, kan petriskål bli flyttet til benken og deretter lagre ved 4 ° C. Når du er klar for seksjonering, kan små blokker som inneholder en vevsprøve bli kuttet ut av petriskål med en varm kniv og montert på en mikrotom eksemplar holder med en ekstra dråpe av smeltet voks. La prøven herde i noen minutter før snitting.

Merk: Blocks kanoppbevares ved 4 ° C i 1 år eller lenger. For flere nyttige tips på vev fiksering og embedding, se ref. 16

2. Probe forberedelse

1. Kloning
   Sonder er vanligvis genereres til ett eller flere spesifikke områder av genet av interesse. Meget repetitive sekvenser bør utelukkes fra sonden, men sekvenser tilsvarende konservert protein domener, for eksempel DNA-bindende motiv i transkripsjonsfaktorer, typisk vil gi genet spesifikke uttrykk mønstre ^8,9,12,15 (Fig. 1). Dette fordi RNase En behandling i post-hybridisering trinn (se nedenfor) reduserer nivået av probe cross-hybridisering mellom genet familiemedlemmer. RNase En kløyver ved uoverensstemmelser i RNA tomannsboliger, fragmenting prober hybridisert til utskrifter med ufullkommen komplementaritet, som vil bli vasket ut i påfølgende trinn.
   Generelt kan flere prober må testes for hvert gen av interesse. Prober kan være så kort som 150 baser i lengde. Although er det ingen grense for lengden av sonden, fragmenter kortere deretter 1,5 kb typisk transkribere bedre. DNA fragmenter til å bli transkribert er klonet inn i en vektor som inneholder T3, T7, eller SP6 arrangører (f.eks pCRII-topo, Invitrogen). Alternativt kan T3, T7 og SP6 promoter sekvenser inngå som en 5'-hale på reverse primer som brukes for å forsterke sonden regionen.
   I hvert in situ hybridisering eksperiment, inkluderer vi en positiv kontroll sonde der hybridisering mønsteret er kjent og som fungerer konsekvent, samt en negativ kontroll (figur 1D og H). Sistnevnte kan være et tilfeldig RNA probe som er kjent for ikke å hybridize til noen utskrifter i vev av interesse. Selv om det er vanlig å bruke fornuft probe av genet i henhold til analysen, er dette ikke nødvendig, og enhver ikke-hybridizing RNA vil passe til formålet. Hvis tilgjengelig, ville vev fra en transcriptional null allel av genet av interesse fungere som en utmerket negativ kontroll.
   
In vitro transkripsjon
1. Linearize plasmidet ved å fordøye ca 5 mikrogram DNA med en begrensning enzym som fordøyer på slutten av innsatsen motsatte stedet av arrangøren. Ikke bruk restriksjon enzymer som forlater en 3'-overheng. Dette kan føre til transkripsjon artefakter fordi polymerase kan utnytte 3 'overheng som underlag for å fortsette transkripsjon. Alternativt kan sonden regionen inkludert T3, T7 og SP6 promoter bli forsterket av PCR for å generere DNA malen for in vitro transkripsjon reaksjon.
2. Sjekk en delmengde på en gel for å bekrefte at reaksjonen har gått til ferdigstillelse.
3. Pakk ut DNA med fenol / kloroform, bunnfallet med etanol og resuspender DNA pellet i milliQ H ₂ O til en konsentrasjon av 1μg/μl. Alternativt kan DNA rengjøres ved hjelp av standard DNA rensing kolonner.
4. Sett opp in vitro transkripsjon reaksjoner ved å blande:
   • 1μl purified DNA (1μg/μl)
   • 2μl 10x transkripsjon buffer
   • 2 mL 10x DIG RNA merking mix
   • 1μl RNase OUT
   • 2μl T3, T7 og SP6 RNA polymerase (20 U / mL)
   • H ₂ O opp til 20μl.
   
   Inkuber ved 37 ° C i 1 til 2 timer. Hold 1μl å analysere på en gel senere.
   Merk: Fluorescens-merket sonder er foretrukket i animalske systemer, men på grunn av høy auto-fluorescens de fleste plante vev, In situ hybridisering protokoller for planter bruk radiomerket prober ¹⁷ eller oftere DIG-merket sonder som oppdages ved immunhistokjemi.
5. Fjern DNA-malen ved å tilsette 75 mL MilliQ H ₂ O og 5 mL RQ1 DNAse (1 U / mL) til transkripsjon reaksjon og incubating reaksjonen ved 37 ° C i 10 min.
6. Rense in vitro transkripsjon reaksjon å eliminere ikke-inkorporert nukleotider og små utskrifter. Ett possihet er å bruke en størrelse utestenging Sephadex ® kolonne, for eksempel mini Rask Spin RNA kolonner (Roche). Alternativt kan transkripsjon reaksjonen bli renset ved en konvensjonell LiCl / etanol nedbør (se ref. 14). Hold 1μl å sjekke på en gel senere.
7. Sonder over 250 baser i lengden er vanligvis delvis hydrolized å få RNA-molekyler av ca 150 nt og derfor liten nok til effektivt å trenge inn i vev seksjoner. Legg til en lik mengde 2x karbonat buffer (80 mM NaHCO _3, 120 mM Na ₂ CO ₃₎ til det rensede transkripsjon reaksjonen og inkuber ved 60 ° C. Inkubasjonstiden skal beregnes etter følgende formel:
   tid = (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
   hvor Li = innledende probe lengde (i kb); Lf = endelige probe lengde (0.150 kb), K = 0,11 kb / minutt. Hold 2 mL å sjekke på en gel.
8. Nøytralisere hydrolyse reaksjonen ved å tilsette 1 / 20 volum på 10% eddiksyre.
9. Sonden er da Purisert ved å legge 1μl av tRNA (100mg/ml), 1 / 10 volum 3M NaAc 5,2 pH, pluss 2,5 volum kald 100% etanol, og incubating ved -80 ° C i 30 min. Bunnfall RNA ved sentrifugering ved 13500 rpm i 20 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og skyll RNA pellet med 500μl 70% etanol. Sentrifuge igjen, la pellet lufttørke (vanligvis ca 15 min), og resuspender RNA i 50μl 50% avionisert formamide. Sonden bør oppbevares ved -80 ° C til bruk.
10. Sjekk med jevne 1% TAE-agarose gel det endelige produktet samt halvfabrikata av § § 2.2.4, 2.2.6 og 2.2.7 (Figur 2A). Dette tillater overvåking av effektiviteten av in vitro transkripsjon reaksjon.
    Merk: in vitro transkripsjon reaksjoner bør gi ca 1 mikrogram av RNA per 1 mikrogram av mal.
2. Dot Blot Analysis
   Sonden konsentrasjon og DIG-UTP innlemmelse kan vurderes ved dot blot analyse (figur 2B). Serial RNA fortynninger er oppdaget på en standard hybridisering membran langs en merket kontroll RNA av kjent konsentrasjon. For eksempel bruker vi DIG-UTP merket kontroll RNA probe inkludert i in vitro transkripsjon kit (Roche). Det er best å teste flere fortynninger for hver sonde å etablere en nøyaktig konsentrasjon.
   1. Forbered blokkering buffer ved å løse opp 0,5% av Blokkering Reagens i 1x TBS buffer (100 mM pH7.5 Tris-HCl, 150 mM NaCl) ved 70 ° C, deretter la løsningen kjøles ned til romtemperatur.
   2. Spot 1μl av seriefortynning (vanligvis mellom 10 ^-1 til 10 ^-5) av in vitro transkribert og kontroll prober på en N + nylon membran. Fest RNA ved UV cross-linking.
      Merk: En minimal overflate på membranen bør brukes for å redusere volumet av buffere som trengs senere.
   3. Stabilisere membranen i 1x TBS i 5 min ved romtemperatur (RT) på en risting plattform.
   4. Block membranen med blokkeringbuffer i 30 min ved RT på en risting plattform.
   5. Skyll membranen i 1x TBS i 5 min.
   6. Inkuber membran med anti-DIG antistoff, fortynne 1μl av Anti-digoxigenin-AP i 10 ml 1x TBS, for 45 min ved RT.
   7. Vask membranen to ganger i 1x TBS for 15 min hver.
   8. Stabilisere membranen i 1x TN buffer (100mm Tris-HCl 9,5 pH, 100mm NaCl) i 5 min.
   9. Stain membranen ved inkubasjon med NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) i 1x TN buffer. Flekker kan ta 5-10 min. Etterpå skylles membranen med vann, det kan deretter tørkes og oppbevares som en rekord.
      Merk: NBT / BCIP er et substrat for alkalisk fosfatase konjugert til anti-DIG antistoff som ved hydrolyse gir en mørk blå farge.

3. Seksjonering

1. Varm blokkene til romtemperatur. Hvis blokkene er for kaldt, kan enkelte paragrafer rulle over uten å danne en voks 'bånd'. Trim blokken til en trapezoid form forlater ca 1mm av voks rundt prøven.
2. Varm opp et stort bilde varmere ved 35-37 ° C.
   Merk: Mange protokoller gjør dette trinnet ved 42 ° C imidlertid redusere temperaturen til 35-37 ° C hindrer dannelsen av bobler under seksjonene.
3. Legg blokken på mikrotomen slik at jo lenger de to parallelle ansikter er nederst. Nøye bringe blokken frem til bladet og sørg for at overflaten av blokken er parallell til bladet. Seksjon med en tykkelse på 8 - 10μm. Voksen bånd kan justeres på en ikke-klebrig overflate, for eksempel aluminiumsfolie eller filter papir, for å velge deler av interesse. Dette kan vurderes ved hjelp av en nærliggende dissekere mikroskop.
   Merk: eosin farging av vev gir en indikasjon om vev har blitt riktig infiltrert i løpet av innebygging. Hvis midten av blokken ikke er farget med eosin dette betyr vanligvis at vevet er dårlig løst.
4. Mark Probe-on Plus slIDES med en blyant (de fleste penner eller markørene er slettet under in situ hybridisering protokoll) og distribuere 1 ml av rene milliQ H ₂ O på den. Nøye flyter deler av renter på overflaten av vann ved romtemperatur (det er lettere å manipulere seksjoner på vannet når du arbeider ved romtemperatur). Kontroller at den blanke siden (den nederste siden som båndet kommer ut på mikrotomen) vender mot vannet. Deretter overføre gli sakte inn lysbildet varmere. Oppvarming hjelper seksjoner å spre seg på overflaten av vannet. Etter 5 minutter, hell av vannet forsiktig, men i en jevn bevegelse, slik at båndet er senket ned på lysbildet. La lysbilder tørke i minst flere timer eller over natten ved 37 ° C, slik at vevet overholder.
   Merk: seksjonert vev kan lagres i en boks med silica tørkemiddel for et par dager til uker ved 4 ° C, er det imidlertid best å bruke lysbilder så snart som mulig.

Fire. In situ Hybridvisualisering

1. Seksjon forbehandling
   Volumet som kreves for hver løsning vil åpenbart avhenge av antall lysbilder som skal behandles, og beholderen størrelse benyttes. Seksjonene skal alltid være helt neddykket. For en 25-lysbilde stativ og et pent passende beholder, er 200-250 ml tilstrekkelig. Fordi mange av de inkubering trinnene er svært kort, pleier vi forberede alle mulige løsninger først, og deretter start lysbildet pre-behandlinger. Imidlertid vil eddiksyre løsningen må tilberedes umiddelbart før bruk og protease er lagt ved bruk. Alle trinn utføres ved romtemperatur hvis ingenting annet. Dessuten kan alle buffere være forberedt på 10x konsentrasjon som en stamløsning.
   1. Varm den protease buffer (100 mM Tris 8,0 pH, 50 mM EDTA) i beholderen til 37 ° C.
   2. Deparaffinize og rehydrere vevet seksjoner som følger:
      
      • histoclear - 10 min (bruk et glassfat)
      • histoclear - 10 min (bruk englassfat)
      • 100% etanol - 1 min
      • 100% etanol - 30 sek
      • 95% etanol - 30 sek
      • 85% etanol - 30 sek
      • 70% etanol - 30 sek
      • 50% etanol - 30 sek
      • 30% etanol - 30 sek
      • 10% etanol - 30 sek
      • milliQ H ₂ O - 1 min
   3. Inkuber i 1x PBS i 2 min.
   4. Bland 625μl av protease 50mg/ml i 250 ml protease buffer forvarmet til 37 ° C og inkuber lysbildene i 20 min ved 37 ° C.
      Merk: protease er nødvendig for å fordøye faste proteiner og øke probe tilgangen til mobilnettet RNAS. Det er viktig å kontrollere tiden av inkubasjonstiden for å maksimere hybridiseringen signal uten nedbrytning av vevet, og dermed noen optimalisering kan være nødvendig for hver vevsprøve.
   5. Nøytralisere protease aktivitet i 0,2% glysin i 1x PBS i 2 min.
   6. Skyll lysbilder gang i 1x PBS i 2 min.
   7. Unn lysbildene in 4% PFA løsning for 10 min å re-fix RNA som kan skades av protease behandling.
   8. Skyll lysbilder to ganger i 1x PBS for 2 min hver.
   9. Mens lysbildene er i PBS vasker, utgjør 250 ml av 0,1 M trietanolamin løsning pH 8,0 ved å blande 12,5 ml 2M trietanolamin (29.8g i 100ml milliQ H ₂ O, pH8.0 med HCl) til 236,25 ml milliQ H ₂ O i et glassfat. Legg til 1.25 ml eddiksyre i trietanolamin buffer umiddelbart før du setter lysbildene i, og rør godt. Etter å legge til lysbilder, fortsett å røre sakte i 10 minutter.
      Dette krever at lysbildet rack er forhøyet i beholderen av Triethanolamine / eddiksyre. Vi bruker en fastspenning system med støtte stand.
      Merk: I dette trinnet, positivt ladet amino grupper som kan føre til ikke-spesifikk binding av sonden er acetylert. Dessuten er eddiksyre giftig; denne løsningen bør derfor være forberedt på en avtrekksskap og kastes på riktig <./ Li>
   10. Skyll lysbilder to ganger i 1x PBS i 2 min.
   11. Tørke vevet seksjoner igjen:
       
       • H ₂ O - 1 min
       • 10% etanol - 30 sek
       • 30% etanol - 30 sek
       • 50% etanol - 30 sek
       • 70% etanol - 30 sek
       • 85% etanol - 30 sek
       • 95% etanol - 30 sek
       • 100% etanol - 30 sek
       • 100% etanol - 30 sek
       Merk: Slides kan lagres i en beholder med en liten mengde på 100% etanol nederst i opptil flere timer ved 4 ° C.
2. Hybridisering
   1. Varm en oppvarming blokk til 85 ° C.
   2. Klargjør hybridisering buffer. For 10 ml, bland i en Falcon rør 1,25 ml in situ hybridisering salter (3M NaCl, 100mm Tris-HCl 8,0 pH, 100mm Na Fosfat pH6.8, 50mm EDTA), 5 ml avionisert formamide, 2,5 ml 50% dekstransulfat, 250 mL 50x Denhardt, 125 mL 100mg/ml tRNA, og 875 mL H ₂ O. <br /> Merk: dekstransulfat er veldig tyktflytende, så det er best å forvarme løsningen til 60 ° C for å gjøre pipettering enklere. Hybridisering buffer kan lagres ved -20 ° C.
   3. Klargjør de ulike sonder. For hvert bilde, bland 1 mL probe med 9 mL milliQ H ₂ O og 10 mL avionisert formamide. Varm sonden ved 85 ° C i 2-3 min, umiddelbart slappe av på is, sentrifuger kort, og legger til sonden til 80μl hybridisering buffer per lysbilde. Bland godt med pipettering, men unngå å lage bobler.
      Merk: Mengden probe for å bli lagt per lysbilde må testes empirisk. Vanligvis er prober brukes på en endelig konsentrasjon på 0,5 ng / kb / mikroliter probe kompleksitet. Siden hybridizations utføres med 100 mL per lysbilde, er ca 25 ng av probe som trengs per lysbilde for sonder som er 0,5 kb i lengde og 50 ng av probe per lysbilde for sonder som er 1-kb lang. For enkelhets skyld, vi ofte prøve 0,5, 1 og 4 mL probe per lysbilde.
   4. Plasser lysbilder på enren overflate og la dem lufttørke helt i 5-10 min. Pipet sonden / hybridiseringen buffer mix på høyre kant av lysbildet. Gradvis lavere en dekkglass på lysbildet, pass på at hybridiseringen løsningen dekker alle seksjoner, uten noen bobler. Trykk på dekkglass lett med fingeren hvor det dannes bobler å fortrenge dem fra alle vev seksjoner. Ikke dra dekselet ta av, da dette vil skade delene.
      Merk: En alternativ metode som vanligvis brukes til dette trinnet er å forberede "sandwicher" av to lysbilder som er inkubert med samme sonde. For mer informasjon om denne metoden, se ref. 14.
   5. Utarbeide en fuktighet kammer i en perfekt flat plastboks. Dekk bunnen av esken med Whatman papir fuktet med milliQ vann, dekket papiret med Parafilm forlate hjørnene avdekket, sted lysbildene i plastboks og forsegle esken tett.
   6. Inkuber lysbilder på ønsket hybridisering temperatur, vanligvis 50-55 ° C, feller 16-20 timer.
   7. For bruk neste morgen, forberede 1 liter 0,2 x SSC og lagre denne på 55 ° C. I tillegg forbereder 1 liter NTE buffer (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) og oppbevar ved 37 ° C.
3. Post-hybridisering behandling
   1. Fjern Dekkglass nøye for å ikke skade delene. Plasser lysbildene i et rack og vask dem to ganger i 0,2 x SSC ved 55 ° C i én time.
      Merk: Dekkglass ofte falle av lett når lysbildene er plassert stående. Hvis dekkglass forblir festet, fordype raset i varme 0,2 x SSC for 1 eller 2 min å vaske dekkglass av. Unngå å trekke dekkglass av raset, da dette kan forårsake skade på seksjonene.
   2. I mellomtiden forbereder 500 ml vaske buffer (1% BSA, 0,3% Triton i TBS buffer) og 100 ml blokkering oppløsning (0,5% blokkering reagens i TBS buffer). Rør blokkering pulveret i TBS som sakte varmes opp til 70 ° C og la den avkjøles til romtemperatur gang dissolved.
      Merk: Volumene av vaske buffer og blokkering løsning som trengs vil variere avhengig av størrelsen på flat plastboks brukt i trinn 4.3.8 -11. Det vil ta litt tid å fullstendig oppløse Triton, så forbered nok løsning på forhånd.
   3. Stabilisere seg lysbildene i 1x NTE for 2 min.
   4. Fortsett til RNase En behandling ved å overføre den glir inn 1x NTE buffer som 20μg/ml RNase A er lagt like før bruk, Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
      Merk: RNase A kløyver gratis single-RNA samt ved uoverensstemmelser i RNA tomannsboliger. Dette trinnet bidrar til å redusere nivået av ikke-spesifikk binding av sonden, som spaltes probed fragmentene er vasket bort i de siste 0,2 x SSC vaske (se 4.3.6).
   5. Skyll lysbilder to ganger i 1x NTE for 2 min hver.
   6. Vask lysbildene i friske 0,2 x SSC ved 55 ° C i én time.
   7. Stabilisere seg lysbildene i 1x PBS i 5 minutter ved romtemperatur.
   8. Overfør lysbilder fra stativet på the bunnen av en flat plastboks og dekk dem med et minimalt volum av blokkering løsning. Blokker lysbilder for 45 min på en sakte rister plattform.
   9. Overfør lysbilder til en annen ren flat plastboks og vask dem i 45 min med vasking buffer på en risting plattform.
   10. Fortsett til antistoffet inkubering. Fortynn anti-digoxigenin antistoff i vask buffer (1:5 v / v) og enten bruke en minimal mengde direkte på hvert lysbilde eller sted lysbildet i en flat plastboks og dekk dem med et minimalt volum av antistoff løsning. Inkuber lysbilder i mørke i 2-3 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
   11. Vask lysbildene 4 ganger i 15 min hver med vask buffer på risting plattform. Bruk en minimal mengde av å vaske buffer og en flat plastboks. Rengjør plastboks mellom hver av vasker.
       Merk: Rengjøring av boksen mellom vasker vil reduseres den generelle bakgrunnen på lysbildet. For å forenkle dette, bruker vi to identiske flate bokserog overføre glir inn i en ren boks etter hver vask.
   12. Overfør glir inn 1x TBS for 2 min.
   13. Stabilisere seg lysbildene i TN buffer to ganger i 2 min hver.
   14. Forbered flekker løsning umiddelbart før bruk ved å tilsette 20 mL NBT / BCIP per 1 ml TN buffer. Hell flekker løsning i en liten plast veier parabolen. Sandwich to lysbilder sammen med de delene mot hverandre. Dypp den ene langsiden av sandwich i løsningen, slik at kapillærkraft å trekke opp løsningen. Drain lysbildene på en Kimwipe og fylle lysbilder med antistoff løsning igjen. Det kan hende du må trykke på lysbilder som løsningen flyter i å unngå bobler. Plasser lysbildene i en plastikk boks og oppbevares ved romtemperatur i mørket.
   15. Dag 10 til dag 15: Oppdater flekker løsningen to ganger daglig i 1-5 dager ved å skylle lysbilder i TN buffer og forberede nye smørbrød med fersk flekker løsning.
       Merk: Skifte flekker løsningen med jevne intervals vil forbedre signalet til bakgrunnen ratio. Utvikling av signalet kan overvåkes under en sammensatt eller stereo-mikroskop. Det er mulig å fotografere de delene mens de er i TN buffer i mellom runder med flekker eller når de er overført til vannet like før fastmontering.
4. Montering
   1. Når signalet er åpenbar, skyll lysbildene i milliQ H ₂ O og virke uttørrende på dem raskt gjennom en etanol-serien:
      
      • 10% etanol - 10 s
      • 30% etanol - 10 s
      • 50% etanol - 10 s
      • 70% etanol - 5 s
      • 80% etanol - 5 s
      • 95% etanol - 5 s
      • 100% etanol - 5 s
      • histoclear - 2 min
      • histoclear - 2 min
      Merk: Sørg for å holde hver av disse inkubasjonstider kort fordi signalet er etanol løselig.
   2. Mount lysbildene ved å plassere en eller to dråper Toluen-baserte montering medium på hvert glede og sakte senke dekkglass på lysbildet unngå dannelse av bobler. La montering medium herde over natten før analysere resultatet under et sammensatt mikroskop. Når montert, kan lysbilder lagres i mange år ved romtemperatur.

5. Representant Resultater:

Etter 1-5 dager, vil en rød-lilla signal utvikle seg i de cellene der sonden har hybridisert til komplementære utskrifter (figur 1). Fargen signalet gir dermed en direkte visualisering på cellenivå oppløsning av uttrykket mønster av genet av interesse. En svakere bakgrunn flekker kan også utvikle seg, som følge av ikke-spesifikk binding av sonde eller farging av anlegget vev (figur 3). Slike bakgrunn signal kan være relativt mer uttalt hos de små, mindre bestemt cellene i vevet, men bakgrunnen flekker ville også være observert i seksjoner hybridisert til de negative og positive kontroll prober og ville ikkekunne reproduseres mellom eksperimenter.

Figur 1. Representative resultater oppnådd med ulike prober på Arabidopsis og mais vev. In situ hybridizations av Arabidopsis (AD) og mais (EH) vev med forskjellige gen-spesifikke prober som illustrerer den type resultater som kan forventes på vellykket gjennomføring av den skisserte protokollen. (A) Lokalisering av SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) i Arabidopsis vegetative skyte apex; merke tilstedeværelse av lilla blå signal i den ubestemmelige cellene i meristem og manglende signal i de omkringliggende bladene. (BD) Deler av Arabidopsis torpedo scenen embryo viser CLAVATA3 (B) uttrykk i de få embryonale stamceller, probed AtML1 (C) uttrykk i epidermal lag, og mangelen på signal i seksjoner med en tilfeldig negativ kontroll RNA (D). (E) Lokalisering av STM homolog knotted1 i utviklingsland mais embryo, merk den sterke signal spesielt i embryonale meristem og rot. (FH) Langsgående seksjoner gjennom vegetative skyte apex fra mais viser distinkte in situ hybridisering mønstre for arf3a (F) og ocl4 (G) og ingen hybridisering signal for den negative kontrollen probe (H). arf3a uttrykkes på abaxial / nederste blad overflate, mens AtML1 homolog ocl4 er uttrykt spesielt i epidermis.

Følgende genet fragmentene ble brukt som probe: STM: den cDNA regionen omfatter aminosyrer 81-382, som inkluderer bevart homeodomain; CLV3: full lengde cDNA; AtML1: den tredje ekson; kn1: hele åpne lesing ramme; arf3a: nukleotider 9-225 av cDNA klon HM004539; ocl4: 3 '1,7 kb av full lengde cDNA, som inkluderer flere konservert protein domener.

Figur 2. Kontroll punkter samtidig som in vitro transkripsjon sonder. (A) In situ hybridisering prober blir sjekket på en standard agarose gel etter in vitro transkripsjon (a), etter DNase behandling og påfølgende rensing av in vitro transkripsjon reaksjon (b), etter karbonat hydrolyse-om nødvendig-(c) og når klar til bruk (d). For prober over 250 bp i lengde, slik som probe 1, vil karbonat hydrolyse gi en rekke mindre probe fragmenter (brakett). (B) kolorimetrisk kvantifisering av prober ved dot blot analyse. Fortynninger fra 10 ^-1 til 10 ^-5 av 100 ng / mL kontroll probe (1) og tre nye DIG-merket prober (2-4) er oppdaget på en overføring membran, inkubert med anti-DIG antistoff, og analyseres bruker kolorimetriske analysen beskrevet i pkt. 2.3 i protokollen. Analysen antyderfølgende estimerte konsentrasjoner: 2 probe, ~ 100 ng / mL, probe 3, ~ 10 ng / mikroliter probe 4, ~ 1 ng / mL. Probe 4 er usannsynlig å gi en god in situ hybridisering signal.

Figur 3. Sammenligning av en ikke-spesifikk probe til en godt arbeidende probe. Langsgående seksjoner gjennom vegetative skyte apex fra mais viser en ikke-spesifikk bakgrunn signal (A) og en spesifikk in situ hybridisering signal for OCL5 sonde i ytterste celle laget (B).

Figur 4. Diagram som viser tidslinjen trinn i in situ hybridisering protokollen. Tissue embedding trinnene er angitt i grønt, probe-forberedelse trinn i oransje, og in situ hybridisering trinn i blått. Denne tidslinjen anser at DNA templaTe for in vitro transkripsjon av sonden er tilgjengelig. Parafin-embedded tissue blokker og DIG-merket prober kan være forberedt på forhånd og oppbevares ved 4 ° C og -80 ° C, henholdsvis inntil tidspunktet for bruk. Den in situ hybridisering protokollen kan da være ferdig i så lite som fire dager.

Discussion

Den in situ hybridisering metode skissert her tillater direkte visualisering av tid og rom uttrykk mønster av noen genet av interesse med stor cellular oppløsning, høy sensitivitet og spesifisitet. Protokollen tillater ikke en kvantitativ sammenligning av uttrykket nivåer mellom gener. Imidlertid kan metoden er høy følsomhet og oppløsning avslører gradienter av genuttrykk i en vev ^{8, 18,} ​​som ikke er mulig med de fleste andre metoder for analyse av genuttrykk.

Protokollen inneholder mange trinn, noe som kan gjøre feilsøking problematisk. Den mest kritiske trinn i protokollen er fiksering av vev og utvalget og merking av sonden. Dårlig infiltrert vev og prober med lav DIG innlemmelse vil gi svært svake signaler som kan være vanskelig å oppdage ovennevnte bakgrunn. For hvert nytt gen av interesse, er det tilrådelig å prøve noen forskjellige prober avledet fra diffeleie regioner av karakterutskriften. Noen ganger kan to eller tre sonder targeting forskjellige mindre regioner av genet må kombineres for å oppnå en sterk og spesifikk hybridisering signal. I tillegg hybridisering forhold, slik som temperatur og sammensetning av hybridisering buffer, kan optimaliseres for hvert gen eller vev for å senke eller øke hybridisering stringens. Også protease behandlingen trinnet er en variabel og kan endres for å tilpasse protokollen for forskjellige plantearter eller for påvisning av utskrifter med svært lav overflod. Inkludering av både positiv og negativ kontroll prober vil være nyttig for å identifisere problematiske punkter i protokollen.

Prosedyren er optimalisert for parafin-embedded plantevevet seksjoner, men med små modifikasjoner kan også brukes for hel-mount in situ hybridisering. Selv om mye brukt i dyreforsøk ^19, hele monter in situ hybridisering vil være limited å plante vev som lett kan infiltrert, som embryo, røtter eller unge meristematic vev ^20,21. Protokollen kan også enkelt endres til å samtidig oppdage to distinkte mRNA eller lokalisere avskrift sammen proteiner ^15,22,23. Endelig er det mulig å utvide anvendelsen av denne metoden til visualisering av små RNA uttrykk mønstre i planter. miRNA uttrykk mønstre har blitt bestemt å bruke denne protokollen i både mais og Arabidopsis ^8,14. Mer nylig har in vitro transkriberte prober blitt erstattet av kommersielt tilgjengelige DIG-merket låst nukleinsyre (LNA) oligo prober som øker signal sensitivitet ^{18, 24.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytoseal 60 4oz	Fisher Scientific	23-244-256	Toluene-based 8310-4
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus	Fisher Scientific	23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+	GE Healthcare	RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL	Invitrogen	10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl	Promega Corp.	M6101
DIG-labeled Control RNA	Roche Group	11585746910
DIG RNA labeling mix	Roche Group	11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10881767001
RNase-A	Roche Group	109142	dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent	Roche Group	1 096 176	Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U	Roche Group	1 093 274
NBT/BCIP stock solution	Roche Group	1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Group	11814427001
tRNA from E. coli	Roche Group	109541
Triton®X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV	Sigma-Aldrich	P5147	Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8906-5G	Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate	Sigma-Aldrich	D2532
Albumin from bovine serum - ≥98%	Sigma-Aldrich	A7906
Eosin Y disodium salt	Sigma-Aldrich	E4382	Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds	Electron Microscopy Sciences	62352-15
Embedding rings	Fisher Scientific	22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps	VWR international	66020-326
Probe-on-plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm	VWR international	48404-452
Whatman paper 3mm	VWR international	89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack	Electron Microscopy Sciences	71420-25	Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers	Electron Microscopy Sciences	71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids			required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes			Help handing wax ribbons
Microtome			Leica
Self-cleaning dry vacuum system	Welch Allyn	2025
Slide warmer	Fisher Scientific
Heating block			needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C	Fisher Scientific		For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C	Fisher Scientific		Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood