Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Summary

Abstract

Geçtiğimiz on yıl genomik araştırma gelişmelerle birlikte, bitki biyolojisi, gen ekspresyonu büyük ölçekli kantitatif analizleri gösteren çok sayıda çalışma gördü. Mikroarray ve yeni nesil sıralama yaklaşımlar, gelişimsel, fizyolojik ve stres yanıtı süreçlerini araştırmak, epigenetik ve küçük RNA yollar teşrih ^ve 1-3 büyük gen düzenleyici ağlar oluşturmak için kullanılmaktadır . Bu tekniklerin büyük gen setleri eşzamanlı analizi kolaylaştırmak iken, genellikle gen ekspresyonu değişiklikleri çok sınırlı uzaysal çözünürlüğü sağlar. Bu sınırlama kısmen lasermicrodissection ile birlikte ya ^da 4-7 sıralama floresan ile aktive olan hücre yöntemi kullanarak ya profil üstesinden gelinebilir . Ancak, tam bir genin biyolojik rolünü anlamak için, bir hücresel çözünürlükte ifade Spatiotemporal desen bilgisi şarttır. Özellikle, geliştirme veya çevre sti etkileri eğitimMuli ve mutantlar bir gen ifade deseninin ayrıntılı analizi gerekli olabilir. Örneğin, belirli bir hücre türleri ifade kaybı veya kazancı ile ilgili anahtar düzenleyici genlerin ekspresyon düzeyleri ince kantitatif farklılıklar dramatik fenotipleri yol açabilir.

Çeşitli yöntemler rutin ayrıntılı inceleme için gen ekspresyonu kullanılır. Bir transgenik muhabiri hatlarının analizi yoluyla. Böyle bir analiz, birden fazla genin analiz veya dönüşüm inatçı tesislerinde çalışırken Ancak, zaman alıcı olabilir. Ayrıca, bağımsız bir doğrulama transgen ifade desen endojen gen taklit sağlamak için genellikle gereklidir. İmmünohistokimyasal protein yerelleştirme veya mRNA in situ hibridizasyon, gen ekspresyonu hücre ve dokuları içinde doğrudan görünüm için nispeten hızlı alternatifler sunuyoruz . Ikincisi kolayca u ayrı bir avantajı varilgi herhangi bir gen sed in situ hibridizasyon ilgi gen in vitro transkripsiyon elde prob etiketli anti-sense RNA hibridizasyon hücreleri hedef mRNA'ların algılanmasını sağlar .

Burada yüksek hassasiyet ve özel bitkilerde gen ekspresyonu in situ lokalizasyonu için bir protokol anahat. Paraformaldehid sabit, parafine gömülü bölümleri, histoloji mükemmel koruma sağlar ve immün algılama ve alkalin fosfataz kolorimetrik reaksiyon tarafından görüntülenmiştir DIG etiketli probları ile kullanım için optimize edilmiştir. Bu protokol bitki türlerinin geniş bir dokuların bir dizi başarıyla uygulanan ve mRNA'ların yanı sıra küçük RNA'lar ^8-14 ifade analiz etmek için kullanılır.

Protocol

1. Örnek hazırlama

Not: hibridizasyon adım da dahil olmak üzere tüm adımlar RNAse aktivite duyarlıdır. Bu nedenle temiz koşullarda çalışmak esastır. Bu en az 3 saat için 180 az pişmiş DEPC arıtılmış su ve cam ° C ile RNaz tüm çözümleri yapmak için de oldukça yaygındır. Plastik kaplar, genellikle 30 dakika için 0.2 N NaOH ile tedavi ile temizlenir. Ancak, bu önlemlerin hiçbiri gerekli olan ve genellikle tüm çözümler için düzenli temiz milliQ H ₂ O kullanın. Biz yerinde döllemeler için ayrı reaktifler, kutular ve cam tutmak ve temiz bir kabin içinde bu saklayın.

1. Örnek fiksasyon
   1. 1. Gün: taze% 4 paraformaldehid (PFA) fiksatif hazırlayın. Için 500 ml, 60 ila 400 ml 1x PBS sıcak (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO ₄ pH7.0) ° C ve NaOH iki pelet çözülür. Davlumbaz, 20 g paraformaldehy eklemekde ve karışımı iyice kadar feshetti. Buz üzerinde çözüm yerleştirin ve H ₂ SO ₄ (100ml için 1-2 damla) ile 7.2 pH ayarlamak soğutmalı. Daha sonra 500 ml 1x PBS ile ses seviyesini ayarlamak.
      Not: pH ayarı için bu son derece zehirli dumanlar yayınlayacak HCl kullanmayın. Paraformaldehit toksik; Bu nedenle, bu çözüm davlumbaz hazırlanan ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Ayrıca, Paraformaldehit 4 ° C'de saklanır ve yeni satın alınan her 6 - 9 ay olmalıdır.
   2. 15 ml taze PFA fiksatif hemen buz, cam sintilasyon şişeleri Hasat doku örnekleri ve yer. Doku diseksiyonu gerekli ise, bu en iyi şekilde soğuk fiksatif buz yapılır.
      Not: büyük bir fiksatif aşırı kullanımı önemlidir. Genel tavsiye oranı, doku hacmi 1 10 ciltlik fiksatif kullanmaktır.
   3. Örnekleri ise buz üzerinde bir vakum (~ 500 mm Hg) uygulayın. Vakum 15-20 dakika tutun, küçük kabarcıklar örnek çıkartmak gerekirama fiksatif Çıban etmemelidir. Vakum yavaş yavaş bırakın ve fiksatif doğru konsantrasyonda kalmasını sağlamak için PFA fiksatif yenilemek. Dokuların vakum yayımlanmasından sonra lavaboya kadar bu adımı yineleyin.
      Not: Fiksasyon doku içinde RNA molekülleri düzeltmek ve çapraz-bağlantı gereklidir. Bu adım, kötü sabit malzemeler düşük sinyal verimi gibi kritik öneme sahiptir. Bazı dokuların hemen lavaboya değil ama en sonunda bir gecede batar. Fiksatif infiltrasyonu artırmak için, aşağıdaki deterjan eklenebilir: Triton% 0.1 ve / veya 0.1 'e kadar Tween -% 0.3. Formaldehit-alkol-asidik asit (FAA) Alternatif olarak, etanol bazlı fiksatif, aksi takdirde kolayca ^14,15 sızmış değildir dokular için kullanılabilir.
   4. PFA fiksatif bir kez daha değiştirin ve 4 ° C gecede şişeleri tutmak.
2. Doku gömme
   1. 2. Gün: Pre-cool 4 1x PBS ve etanol serisi ° C
   2. Örnekleri durulayın twi30 dakika buz üzerinde 1x PBS her ce.
      Not: Yine her çözümün büyük bir aşırı kullanılması tavsiye edilir.
   3. Etanol bir dizi olarak izleyin, buz, onları alarak örnekleri dehydrate:
      • % 10 etanol 30 dakika,
      • % 30 etanol 30 dakika,
      • % 50 etanol 1 saat,
      • % 70 etanol 1 saat,
      • % 85 etanol 1 saat,
      • % 95 etanol 1 saat,
      • 1 saat her biri için% 100 etanol 3 değişiklik
   4. Günün sonunda, 4 gecede% 100 etanol içinde% 0.1 Eozin etanol yerine ° C Eozin lekeleri hücre duvarı örnekleri gömme ve kesit sırasında daha görünür hale getirmek.
      Notlar: defa burada belirtilen 3x3x3 mm ancak uzun inkubasyon büyük numuneler için gerekli olabilir blokları için optimize edilmiştir.
      Örnekleri birkaç ay için, 4 ° C'de% 70 etanol saklanabilir. 3. Gün: Ertesi sabah, bir saat boyunca oda sıcaklığında örnekleri sıcak. Sonra aşağıdaki gibi histoclear yavaş yavaş etanol yerine:
      
   5. Günün sonunda, paraplast Plus yongaları 1 / 4 hacim kazandırmak ve 60 ° C fırında flakon yerleştirin. Ayrıca paraplast çipleri ile beher doldurun ve taze erimiş mum her zaman elinizin altında olması için bu sık sık yenilemek.
      Not: fırının sıcaklığı 60 yukarıda paraplast önemli ve uzun süreli ısıtma ° C kaçınılmalıdır.
   6. 4. Gün: Yavaş yavaş, düzenli olarak daha fazla parafin yongaları (her saat) ekleyerek paraplast histoclear değiştirin. Günün sonunda, dikkatle histoclear / balmumu karışımı dökün ve hemen saf erimiş balmumu ile değiştirin. 60 ° C gecede örnekleri bırakın.
   7. Gün 5 ve 6: s tutmak taze erimiş balmumu ile, yaklaşık her 4 saatte bir, günde paraplast 3 kez değiştirin60 ° C az amples
      Not: Bu bir günde yalnızca bir kez balmumu değiştirmek mümkündür, ancak balmumu en az 5 veya 6 defa değiştirilmesi gereken doku hazırlığı tamamlamak için fazladan birkaç gün alacaktı. Vakum infiltrasyon bunlar% 100 EtOH ve / veya balmumu doku örnekleri daha da dokulara infiltrasyon ve gömme artırabilir. Balmumu numune Vakum infiltrasyon 60 ° C'de yapılmalıdır
   8. 7. Gün: balmumu bir kez daha değiştirin. Histoclear kokusu tamamen ortadan olmalıdır ve örnekleri o gün daha sonra gömülü olabilir.
   9. 60 yaşında büyük bir ısınma plaka ayarlayın ° C alüminyum folyo ile korunmaktadır.
   10. Gömme yöntemi analiz edilecek doku tipine bağlı olarak değişir. Bu aşamada en önemli nokta, daha sonra kesit örnekleri için doğru odaklı olduğundan emin olmak için. Bir şekilde plastik kalıpları ve yüzük kullanmaktır. Isınma ısınma plaka kalıpları ve kalıp alt kısmını içine erimiş mum dökün. Transferistenilen pozisyon içine ısıtılmış forseps ve yönlendirmek bu kalıp içine bir doku örneği. Beyaz halka kalıp üzerine yerleştirin ve bu tür ek erimiş mum dokuların tamamen kapalı olduğunu eklemek. Kalıp, tezgah plakadan dikkatlice hareket ettirin. Balmumu yavaş yavaş soğumaya alalım.

Bir başka olasılık, 60 ° C ısıtılmış plaka üzerinde çalışırken erimiş mum (örnekleri tamamen balmumu ile kaplı olmalıdır) içeren bir petri tüm örnekleri dağıtmak için. Sıcak forseps ile örnekleri yolunuzu. Sonunda, plaka kapatın. Balmumu katılaşmış, petri tezgah taşındı ve daha sonra 4 saklamak olabilir ° C Kesit için hazır bir doku örneği içeren küçük bloklar petri ısıtılmış bir bıçak ile kesip ve ekstra bir damla erimiş mum ile mikrotom bir numune tutucu üzerine monte edilebilir. Kesit önce bir kaç dakika için örnek sertleşmesine izin verin.

Not: Blocks4 ° C 'de 1 yıl veya daha uzun süreyle saklanabilir. Doku fiksasyon ve gömme ek yararlı ipuçları için ref bakın. 16

2. Probe hazırlık

1. Klonlama
   Problar genellikle bir veya daha fazla ilgi gen belirli bölgelerde üretilir. Oldukça tekrarlayıcı sekansları prob dahil edilmelidir, ancak gibi transkripsiyon faktörlerinin DNA-bağlayıcı motifleri gibi korunmuş protein alanları, karşılık gelen dizileri genellikle gen ekspresyonu ^8,9,12,15 (Şekil 1) verecektir. Bu RNAse sonrası hibridizasyon adımda bir tedavi (aşağıya bakınız) prob gen ailesi üyeleri arasında çapraz hibridizasyon seviyesini azaltır. RNA dubleksleri uyumsuzlukları RNAse Bir sonraki adımda yıkanır olacak kusurlu tamamlayıcılık, transkript için melezleşmiştir parçalayarak, parçalanan probları.
   Genel olarak, çeşitli probları ilgi her gen için test edilmesi gerekebilir. Problar uzunluğu 150 üsleri gibi kısa olabilir. Although prob uzunluğu sınırı yoktur, daha sonra 1.5 kb genellikle daha iyi bir yazıya kısa parçaları. Transkripsiyonu DNA parçaları, T3, T7, SP6 rehberleri (örneğin pCRII-TOPO Invitrogen) içeren bir vektör içine klonlanmış. Alternatif olarak, T3, T7 veya SP6 promotor dizisinde prob bölgenin yükseltme için kullanılan ters astar üzerinde 5'-tail olarak da eklenebilir.
   Her situ hibridizasyon deneyi, hibridizasyon desen bilinen ve sürekli çalışır olduğu bir pozitif kontrol probu, yanı sıra negatif kontrol (Şekil 1D ve H) içerir. Sonuncusu ilgi doku herhangi bir transkript melezleşme bilinen bir rastgele RNA prob olabilir. Altında gen analiz anlamında sondası kullanımı yaygın olmasına rağmen, bu gerekli değildir ve literatürde olmayan herhangi bir RNA amaca uygun olacaktır. Varsa, ilgi genin bir transkripsiyonel null allel dokuların mükemmel bir negatif kontrol olarak hizmet edecektir.
   
In vitro transkripsiyon
1. Organizatörü site karşısında eklemek sonunda digests bir restriksiyon enzimi ile yaklaşık 5 mg DNA sindirerek plazmid Linearize. 3'-çıkıntı terk restriksiyon enzimleri kullanmayın. Polimeraz transkripsiyon devam etmek için bir substrat olarak 3 'çıkıntı yararlanabilirler çünkü bu transkripsiyon eserler yol açabilir. Alternatif olarak, in vitro transkripsiyon reaksiyonu için DNA şablonu oluşturmak için, T3, T7 veya SP6 promoter dahil prob bölge PCR ile yükseltilecek.
2. Reaksiyonun tamamlanması için gitti doğrulamak için bir jel üzerinde bir kısım kontrol edin.
3. Extract DNA, fenol kloroform / etanol ile hızlandırabilir ve 1μg/μl bir konsantrasyon milliQ H ₂ O DNA pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, DNA standart DNA arıtma kolonları kullanılarak temizlenebilir.
4. Karıştırılması ile in vitro transkripsiyon tepki olarak kurun :
   • 1μl purified DNA (1μg/μl)
   • 2μl 10x transkripsiyon tampon
   • 2 mcL 10x DIG RNA etiketleme mix
   • 1μl RNAse çıkış
   • 2μl T3, T7 veya SP6 RNA polimeraz (20 U / ml)
   • 20μl için H ₂ O kadar.
   
   37 ° ° C'de 1 ila 2 saat için. Daha sonra bir jel üzerinde analiz 1μl tutun.
   Not: Floresan-etiketli probları hayvan sistemlerinde tercih nedeniyle bitkiler için in situ hibridizasyon protokolleri, bitki dokularının çoğunda otomatik floresan yüksek daha yaygın Radyoaktif probları ¹⁷ veya immünohistokimyasal olarak tespit DIG etiketli probları kullanırlar.
5. DNA transkripsiyon reaksiyonu 75 mcL MilliQ H ₂ O ve 5 mcL RQ1 DNAz (1 U / ml) ekleyerek ve 37 ° 10 dakika ° C reaksiyon kuluçka şablonu kaldırın.
6. Olmayan anonim nükleotidler ve küçük transkript ortadan kaldırmak için in vitro transkripsiyon reaksiyonu arındırın. Bir Konstruksiyonçıkarak mini Quick Spin RNA Sütunlar (Roche) gibi bir boyut dışlama Sephadex ® sütun kullanmaktır. Alternatif olarak, transkripsiyon reaksiyonu geleneksel bir LiCl / etanol yağış (ref 14) arındırılmalıdır. Daha sonra bir jel üzerinde kontrol etmek için 1μl tutun.
7. Uzunluğu 250 üsleri üzerinde sondalar yaklaşık 150 nt ve bu nedenle verimli doku kesitlerinde nüfuz kadar küçük RNA molekülleri elde etmek için genellikle kısmen hidrolize. 60 yaşında saflaştırılmış transkripsiyon reaksiyonu ve inkübe ° C 2x karbonat tamponu (80 mM NaHCO _3, 120 mM Na ₂ CO ₃₎ eşit hacimde ekle Inkübasyon süresi aşağıdaki formüle göre hesaplanacaktır:
   zaman = (Li-Lf) / (K x Li x Lf)
   Li = ilk prob uzunluğu (kb); Lf = son prob uzunluğu (0.150 kb), K = 0.11 kb / dakika. Bir jel üzerinde kontrol etmek için 2 mcL tutun.
8. 1 / 20,% 10 asetik asit hacim ekleyerek hidroliz reaksiyonu nötralize.
9. Prob sonra Puri1 / 10 hacim 3M NaAc pH 5.2, artı 2.5 hacim soğuk% 100 etanol tRNA (100mg/ml), 1μl eklenmesi ve -80 ° C'de 30 dakika inkübe tarafından belirlenmiştir. 4 20 dakika 13.500 rpm ° C santrifüj RNA çöktürün Süpernatantı atın ve RNA pelet 500μl% 70 etanol ile yıkayın. Tekrar santrifüj, pelet hava kuru (tipik olarak yaklaşık 15 dakika), izin ve RNA 50μl% 50 deiyonize formamid tekrar süspansiyon. Prob, -80 ° C'de kullanımı kadar muhafaza edilmelidir.
10. TAE-agaroz bölüm 2.2.4, 2.2.6 ve 2.2.7 (Şekil 2A) ara ürünlerin yanı sıra nihai ürün jel, bir düzenli olarak% 1 kontrol edin. Bu, in vitro transkripsiyon reaksiyonu etkinliğinin izlenmesine olanak sağlar.
    Not: in vitro transkripsiyon reaksiyonu şablon başına 1 mg RNA yaklaşık 1 mikrogram verim gerekir .
2. Dot Blot Analizi
   Prob konsantrasyonu ve DIG-UTP dahil dot blot analizi (Şekil 2B) tarafından değerlendirilecektir. Seri RNA dilüsyonları bilinen konsantrasyon etiketli bir kontrole RNA yanında standart bir melezleşme membran üzerine fark vardır. Örneğin, biz DIG-UTP kontrolü RNA prob in vitro transkripsiyon kiti (Roche) dahil etiketli kullanın. Her prob için birden fazla dilüsyonları test etmek için doğru bir konsantrasyon kurmak için en iyisidir.
   1. 1x 70 TBS tamponu (100 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl) ° C Engelleme Reaktif% 0.5 'eriterek engelleme tampon hazırlayın, sonra çözüm oda sıcaklığına kadar serin sağlar.
   2. N in vitro transkripsiyonu ve kontrol probları + naylon membran seri dilüsyonları (genellikle 10 ^-1 10 ^-5) Spot 1μl. UV çapraz bağlama RNA sabitleyin.
      Not: minimum yüzey, membran, daha sonra gerekli tamponlarının hacmini azaltmak için kullanılmalıdır.
   3. 1x TBS sallayarak bir platform üzerinde oda sıcaklığında (RT) 5 dakika membran dengelenmesi.
   4. Blok engelleme kullanarak membransallayarak bir platform üzerinde RT 30 dakika tampon.
   5. 5 dakika boyunca 1x TBS membran durulayın.
   6. RT 45 dakika, 10 ml 1x TBS Anti-digoxigenin-AP 1μl seyreltilmesi, anti-DIG membran antikor ile inkübe edin.
   7. Membran, her biri için 15 dakika 1x TBS iki kez yıkayın.
   8. 5 dakika boyunca 1x TN tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl) membran dengelenmesi.
   9. 1x TN tampon NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) ile inkübe membran Leke. Boyama 5-10 dakika alabilir. Daha sonra membran su ile yıkayın, daha sonra kurutulmuş ve bir kayıt olarak tutulabilir.
      Not: NBT / BCIP hidroliz üzerine koyu mavi boya ürettiği anti-DIG antikor konjuge alkalin fosfataz için bir substrat.

3. Kesit

1. Bloklar, oda sıcaklığına kadar ısıtın. Blokları çok soğuk ise, ayrı ayrı bölümlerin bir balmumu 'şerit' oluşturan devrilme olabilir. Trape içine blok Trimzoid şekli örnek etrafında mum bırakarak yaklaşık 1mm.
2. Büyük bir slayt Isınma 35-37 sıcak ° C
   Not: Birçok protokolleri bu adımı 42 ° C sıcaklık ancak 35-37 azaltarak ° C bölümlerinde yer alan kabarcıklarının oluşumunu engeller.
3. Mikrotom üzerine uzun iki paralel yüzlerinin alt kısmında olduğu gibi blok yerleştirin. Dikkatlice bıçak blok ileriye getirmek ve blok yüzeyi bıçak paralel olduğundan emin olun. 8 kalınlığı Bölümü - 10μm. Balmumu şeritler ilgi bölümleri seçmek için, alüminyum folyo ya da filtre kağıdı gibi yapışkan olmayan bir yüzey, uyumlu olabilir. Bu, yakındaki bir diseksiyon mikroskobu kullanarak tespit edilebilir.
   Not: eozin boyama doku, dokular düzgün gömme sırasında sızmış olup olmadığını bir göstergesi sağlar. Blok merkezi eozin ile boyanmış ise bu doku genellikle kötü sabit olduğunu gösterir.
4. Mark Probe-Plus, sl(çoğu kalem ya da kalem in situ hibridizasyon protokolü sırasında silinir) bir kalem ve üzerine temiz milliQ H ₂ O 1mL dağıtmak ides. Oda sıcaklığında (oda sıcaklığında çalışırken su bölümlerde işlemek için daha kolay olur) su yüzeyine faiz bölümlerini dikkatle süzülüyor. Parlak tarafı (şerit mikrotom kapalı geliyor gibi alt tarafı), suya karşı karşıya olduğundan emin olun. Sonra yavaş yavaş slayt slayt üzerine sıcak aktarın. Isıtma bölümlerde su yüzeyine yaymak için yardımcı olur. 5 dakika sonra, dikkatli ama tek bir yumuşak hareketle su dökün, böylece şerit slayt üzerine aşağı indirilir. 37 en az birkaç saat veya gece boyunca slaytlar kurumasını bekleyin ° C, böylece doku yapışır.
   Not: kesitli doku az 4 hafta birkaç gün ° C silika kurutucu ile bir kutu içinde saklanır, ancak kısa sürede slaytları kullanmak en iyisi.

4. yerinde Hybrid.ization

1. Bölüm öncesi-tedavi
   Her çözüm için gerekli hacmi açıkça tedavi ve konteyner boyutu, kullanılan slaytların sayısına bağlı olacaktır. Bölümleri her zaman tamamen sular altında olmalıdır. 25-slayt raf ve düzgün bir şekilde oturan bir konteyner için 200-250 ml yeterlidir. Inkübasyon adımları çok kısa olduğundan, genellikle ilk olarak tüm olası çözümleri hazırlayan ve daha sonra slayt pre-tedavileri başlatmak. Ancak, asetik anhidrit çözümünün kullanımı ve proteaz kullanım süresi eklenir hemen önce hazırlıklı olmak gerekir. Aksi belirtilmediği sürece tüm adımları oda sıcaklığında yapılır. Ayrıca, tüm tamponlar, stok çözelti olarak 10x konsantrasyonda hazırlanmış olabilir.
   1. 37 ° C'ye kadar kap içinde proteaz tamponu (100 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA) Sıcak
   2. Deparaffinize ve aşağıdaki gibi doku bölümleri rehidrate:
      
      • histoclear - 10 dakika (bir bardak çanak kullanmak)
      • histoclear - 10 dakika (bir kullanımcam tabak)
      • % 100 etanol - 1 dk
      • % 100 etanol - 30 sn
      • % 95 etanol - 30 sn
      • % 85 etanol - 30 sn
      • % 70 etanol - 30 sn
      • % 50 etanol - 30 sn
      • % 30 etanol - 30 sn
      • % 10 etanol - 30 sn
      • milliQ H ₂ O - 1 dk
   3. 1x PBS içinde 2 dakika süreyle inkübe edin.
   4. 250 ml proteaz tampon önceden ısıtılmış 37 ° C ve 37, 20 dakika boyunca slayt inkübe ° C proteaz 50mg/ml 625μl Mix
      Not: proteaz sabit proteinleri sindirmesi ve hücresel RNA prob erişimi artırmak gereklidir. Doku arıza olmadan hibridizasyon sinyali en üst düzeye çıkarmak için inkübasyon zaman kontrol etmek için kritik öneme sahiptir, bu nedenle bazı optimizasyon her doku örneği için gerekli olabilir.
   5. 2 dakika süreyle PBS 1x% 0.2 glisin proteaz aktivitesi nötralize eder.
   6. 2 dakika süreyle bir kez 1x PBS slaytlar durulayın.
   7. I slayt davranınn% 4 PFA 10 dakika için çözüm proteaz tedavi ile hasar görmüş olabilir RNA yeniden düzeltmek için.
   8. Slaytlar, her biri için 2 dakika 1x PBS iki kez durulayın.
   9. Slaytları PBS içinde yıkar iken, 2M trietanolamin 12.5 ml (100ml milliQ H ₂ O 29.8g, HCl ile pH8.0) 236,25 ml milliQ H ₂ O içine karıştırılarak 250 ml 0,1 M trietanolamin pH 8.0 makyaj bir cam tabak. Slaytları koymadan önce hemen trietanolamin tampon 1.25 ml asetik anhidrit ekleyin ve iyice karıştırın. Slaytları ekledikten sonra 10 dakika boyunca yavaş yavaş karıştırmaya devam edin.
      Bu slayt raf trietanolamin / asetik anhidrit konteyner yüksek olmasını gerektirir. Biz destek ayağı sıkma sistemi kullanın.
      Not: Bu adımda, non-spesifik prob bağlayıcı yol açabilir pozitif yüklü amino grupları asetillenmiş. Ayrıca, asetik anhidrit toksik Bu nedenle, bu çözüm davlumbaz hazırlanan ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir <./ Li>
   10. Slaytlar, 2 dakika süreyle 1x PBS içinde iki kez durulayın.
   11. Doku bölümleri tekrar dehydrate:
       
       • H ₂ O - 1 dakika
       • % 10 etanol - 30 sn
       • % 30 etanol - 30 sn
       • % 50 etanol - 30 sn
       • % 70 etanol - 30 sn
       • % 85 etanol - 30 sn
       • % 95 etanol - 30 sn
       • % 100 etanol - 30 sn
       • % 100 etanol - 30 sn
       Not: Slaytlar 4, alt kısmında küçük bir miktar ile% 100 etanol birkaç saat kadar bir kapta saklanabilir ° C
2. Melezleme
   1. 85 ° C'ye kadar ısıtma bloğu Sıcak
   2. Hibridizasyon tamponu hazırlayın. In situ hibridizasyon tuzları Falcon tüp 1.25 ml (3M NaCl 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM Na Fosfat pH6.8, 50mm EDTA) 10 ml, mix, 5 ml deiyonize formamid, 2.5 ml% 50 dekstran sülfat, 250. 50x Denhardt, ul 125 ul 100mg/ml tRNA ve 875 ul H ₂ O <br /> Not: Dekstran sülfat çok viskoz, bu yüzden ön ısıtma için 60 çözüm en iyi ° C daha kolay pipetleme yapmak. Hibridizasyon tamponu -20 ° C'de deposu olabilir.
   3. Farklı problar hazırlayın. Her slayt için, 9 ul milliQ H ₂ O ve 10 ul deiyonize formamid ile 1 ul prob karıştırın. Isı Probu 85 ° C 2-3 dakika süreyle, hemen soğuk buz, santrifüj, kısaca prob ve slayt başına 80μl hibridizasyon tamponu ekleyin. Pipetleme tarafından iyice karıştırınız, ancak kabarcıkları yapmamak.
      Not: slayt başına eklenecek prob miktarı deneysel olarak test edilmesi gerekmektedir. Genellikle, problar 0.5 ng / kb / ml prob karmaşıklığı son bir konsantrasyonda kullanılır. Döllemeler slayt başına 100 ul olduğundan, uzunluk ve 50 ng slayt başına 1-kb uzun probları için prob 0.5 kb probları için prob yaklaşık 25 ng slayt başına ihtiyaç vardır. Basitlik için, sık sık 0.5, 1 deneyin ve slayt başına 4 ul prob.
   4. Bir slayt yerleştirin.yüzeyini temizlemek ve onları hava 5-10 dakika için tamamen kurumasını bekleyin. Slayt sağ kenarı üzerine pipetleyin prob / hibridizasyon tampon karışımı. Yavaş yavaş slayt üzerine bir lamel düşük; hibridizasyon çözüm varsa kabarcıkları olmadan tüm bölümleri kapsadığını emin olun. Lamel kabarcıkları tüm doku kesitlerinde onları yerinden formu parmağınızla hafifçe dokunun. Bu bölümlere zarar verecek gibi kapağı kayarak çekmeyin.
      Not: Bu adım için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, aynı prob ile inkübe iki slaytlar "sandviç" hazırlamak için. Bu yöntem hakkında daha fazla bilgi için, ref bakın. 14.
   5. Bir nem odası mükemmel bir şekilde düz bir plastik kutu hazırlayın. Vatmanlar kağıt kutusu alt kapağı, milliQ su ile nemlendirilmiş parafilm köşeleri ortaya bırakarak kağıt kaplı plastik kutu slaytlar ve sıkıca kutunun mühür.
   6. Istenilen hibridizasyon sıcaklık, genellikle 50 slaytlar inkübe - 55 ° C, fveya 16-20 saat.
   7. Ertesi sabah kullanmak için, 55 ° C'de 1 litre 0.2x SSC hazırlamak ve bu mağaza Buna ek olarak, 1 litre NTE tampon hazırlamak (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) 37 ve mağaza ° C
3. Post-hibridizasyon tedavisi
   1. Bölümlerde zarar vermez lamelleri dikkatle çıkarın. Slaytlar rafa koyun ve bir saat boyunca 55 ° C'de 0.2x SSC iki kez yıkayın.
      Not: slaytlar dik konulduğunda lameller genellikle kolayca düşmek. Lamel bağlı kalırsa, lamel yıkayın, 1 ya da 2 dakika süreyle ılık 0.2x SSC slayt bırakın. Bu bölümlere zarar verebilir, slayt lamel çekerek kaçının.
   2. Bu arada, 500 ml yıkama tamponu (% 1 BSA TBS tampon,% 0.3 'tür deniz salyangozu) ve 100 ml engelleme solüsyonu (% 0.5 TBS tampon engelleme reaktif) hazırlayın. TBS içine yavaş yavaş 70 ısıtılır engelleme tozu iyice karıştırınız ° C ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin dissolv kezed.
      Not: tampon yıkama ve gerekli çözüm adımları 4.3.8 -11 kullanılan düz plastik kutunun boyutuna bağlı olarak değişir engelleme hacimleri. Triton tamamen çözmek için biraz zaman alacaktır, bu nedenle yeterli bir çözüm önceden hazırlayın.
   3. 2 dakika süreyle 1x NTE slaytlar dengelenmesi.
   4. RNAse 1x NTE tampon 20μg/ml RNAse hemen önce 37 inkübe kullanmak ° C 30 dakika eklenir. Slaytlar aktararak bir tedavi geçin
      Not: RNAse RNA dubleksleri uyumsuzlukları parçalayarak tek zincirli RNA gibi. Bu adım, bölünmüş probed parçaları son 0.2x SSC yıkama (4.3.6) yıkanır gibi non-spesifik prob bağlama seviyesini azaltmaya yardımcı olur.
   5. Slaytlar, her biri için 2 dakika 1x NTE iki kez durulayın.
   6. 55 ° C'de bir saat süreyle taze 0.2x SSC slaytlar yıkayın.
   7. 1x PBS içinde oda sıcaklığında 5 dakika slaytları dengelenmesi.
   8. Inci üzerine rafa Transfer slaytlare düz bir plastik kutu alt ve engelleme çözümünün en az bir hacim ile onları karşılamak. 45 dakika yavaş yavaş sallayarak bir platform üzerinde slaytlar engelleyin.
   9. Ikinci bir temiz ve düz bir plastik kutuya aktarın ve slaytlar sallayarak bir platform üzerinde yıkama tamponu ile 45 dakika süreyle yıkayın.
   10. Antikor inkübasyon devam edin. Yıkama tamponu (1:5 v / v) anti-digoxigenin antikor seyreltilir ve her slayt üzerine ya da doğrudan en az bir hacim uygulamak slayt veya düz bir plastik kutu içine yerleştirin ve en az bir antikor çözüm hacmi ile onları karşılamak. Slaytları oda sıcaklığında 2-3 saat veya gece boyunca karanlıkta inkübe 4 ° C
   11. 15 dakika her platformda sallayarak yıkama tampon slayt 4 kez yıkayın. Çamaşır tampon ve düz bir plastik kutu minimal volüm kullanın. Her yıkama arasında plastik kutu temizleyin.
       Not: yıkar arasında kutusu Temizleme slayt genel arka plan azaltılmış olacaktır. Bunu basitleştirmek için, biz iki özdeş düz kutularını kullanınve her yıkama sonrası temiz bir kutuya slaytlar aktarın.
   12. 2 dakika süreyle 1x TBS slaytlar aktarın.
   13. TN tampon slaytların her biri için 2 dakika iki dengelenmesi.
   14. 1 ml TN tampon başına 20 ul NBT / BCIP ekleyerek hemen önce boyama çözüm hazırlayın. Tartım kabı küçük bir plastik boyama çözüm dökün. Sandviç iki birbirine bakacak şekilde bölümleri ile birlikte slaytlar. Kapiller eylem çözüm yukarı çekin izin, uzun bir yan çözüm sandviç batırın. Kimwipe üzerine boşaltın ve slaytlar slaytlar antikor çözeltisi ile tekrar doldurun. Kabarcıkları önlemek için çözüm akar slaytlar dokunun gerekebilir. Karanlık oda sıcaklığında bir plastik kutu ve mağaza slaytlar yerleştirin.
   15. Gün 15 Gün 10: Refresh TN tampon slaytlar durulama ve taze boyama çözeltisi içeren yeni sandviçler hazırlanması 1-5 gün boyunca günde iki kez boyama çözüm.
       Not: düzenli int boyama çözüm Değiştirilmesiervals arka plan sinyal oranını artıracaktır. Sinyal Geliştirme bir bileşik veya stereo-mikroskop altında izlenebilir. Boyanma tur arasında TN tampon ya da bir kez onlar sadece kalıcı monte etmeden önce suya transfer edilirken bölümleri fotoğraflamak mümkün.
4. Montaj
   1. MilliQ H ₂ O sinyali açıktır sonra, slaytlar yıkayın ve etanol bir dizi hızlı bir şekilde kurutmak:
      
      • % 10 etanol - 10 s
      • % 30 etanol - 10 s
      • % 50 etanol - 10 s
      • % 70 etanol - 5 s
      • % 80 etanol - 5 s
      • % 95 etanol - 5 s
      • % 100 etanol - 5 s
      • histoclear - 2 dakika
      • histoclear - 2 dakika
      Not: bu kuluçka süreleri kısa tutmak için emin olun, sinyal etanol çözünür.
   2. Her bir veya iki damla Toluen tabanlı montaj orta koyarak slaytlar Dağı kaydırdıe ve kabarcık oluşumunu önlemek slayt üzerine yavaş yavaş lamel düşürücü. Bir bileşik mikroskop altında analiz etmeden önce montaj orta sertleşmesine gecede edelim. Bir kez monte edilmiş, slaytlar, oda sıcaklığında yıl saklanabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

1-5 gün sonra, kırmızı-mor bir sinyal prob tamamlayıcı transkript (Şekil 1) melezleşmiştir bu hücrelerin gelişecektir. Renk sinyali böylece ilgi gen ifade deseninin hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirme sağlar. Zayıf bir arka plan boyama, bitki dokularında prob veya boyama (Şekil 3) non-spesifik bağlanma kaynaklanan gelişebilir. Böyle bir arka plan doku küçük, daha az belirlenen hücre sinyal nispeten daha belirgin olabilir, ancak arka plan boyama, negatif ve pozitif kontrol probları melezleşmiştir bölümlerde de gözlenen ve olmazdı olurdudeneyler arasında tekrarlanabilir.

Şekil 1. Temsilcisi sonuçları Arabidopsis ve mısır dokuların farklı prob ile elde Arabidopsis yerinde döllemeler (AD) ve mısır (EH) dokuların ana hatlarıyla protokolü başarılı bir şekilde tamamlanmasından sonra beklenen sonuçları gösteren farklı gen-spesifik problar. (A) Arabidopsis vejetatif sürgün tepesinde SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) Yerelleştirme; meristem ve çevresindeki yapraklar sinyal yokluğu belirsiz hücrelerde mor, mavi sinyal varlığı dikkat edin . (BD), birkaç embriyonik kök hücreler CLAVATA3 (B) ifade gösteren Arabidopsis torpido dönem embriyoların Bölüm, rastgele bir negatif kontrol RNA (D AtML1 epidermal katman (C) ifade ve bölümler halinde sinyal eksikliği probed.) (E) gelişmekte olan mısır embriyo STM homolog knotted1 Yerelleştirme; not özellikle embriyonik meristem ve kök güçlü bir sinyal. (FH) arf3a (F) ve ocl4 (G) in situ hibridizasyon desenler farklı gösteren mısır vejetatif ateş apeks ve negatif kontrol probu (H) için herhangi bir hibridizasyon sinyali ile Boyuna bölümleri. AtML1 homolog ocl4 epidermisin özellikle ifade ise arf3a, eksen dışı / alt yaprak yüzeyinde ifade edilir.

Aşağıdaki gen parçaları prob olarak kullanılır: STM: amino asitler 81 cDNA bölgeyi kapsayan 382, korunmuş homeodomain içerir; CLV3: tam uzunlukta cDNA; AtML1: Üçüncü ekson; kn1: Tüm açık okuma çerçevesi; arf3a: nükleotidler 9 - cDNA klonu HM004539 225; ocl4: 3 'birkaç korunmuş protein etki içeren cDNA tam uzunluğu, 1.7 kb.

Şekil 2. In vitro transkripsiyon probları yaparken noktaları denetleniyor . (A) karbonat hidroliz eğer sonra, in situ hibridizasyon probları DNaz tedavi ve in vitro transkripsiyon reaksiyonu (b) sonraki saflaştırma sonra (a), in vitro transkripsiyon sonra, standart bir agaroz jel kontrol gerekli-(c) ve (d) için hazır. Prob 1 gibi uzunluğu 250 bp, aşkın prob için, karbonat hidroliz, bir dizi küçük prob parçaları (köşebent) verecektir. (B) dot blot analizi yoklamaları Kolorimetrik kantifikasyon. 10 ^-5 10 ^{-1 'den} bir 100 ng / ul kontrol probu (1) ve üç yeni DIG etiketli probları (2-4) arasında değişen dilüsyonları anti-DIG antikor ile inkübe bir transfer membran, lekeli ve test protokol bölüm 2.3 'de belirtilen kolorimetrik tahlil kullanarak. Analiz öneriraşağıdaki tahmini dağılımı: prob 2, ~ 100 ng / ml; prob 3 ~ 10 ng / ul prob 4 ~ 1 ng / ml. Probe 4 in situ hibridizasyon sinyali iyi bir verim olası değildir.

Şekil 3. Non-spesifik bir prob iyi çalışan bir prob karşılaştırılması. Non-spesifik bir arka plan sinyali (A) ve belirli bir dış hücre tabakası (B) OCL5 prob için in situ hibridizasyon sinyali gösteren mısır vejetatif sürgün apeksi üzerinden Boyuna kesitler.

Şekil 4. In situ hibridizasyon protokolü adım zaman çizelgesi gösteren diyagram . Doku gömme adımları, yeşil, turuncu prob hazırlık adımları belirtilen ve mavi in situ hibridizasyon adımları . Bu zaman çizelgesi düşündüğü DNA template prob in vitro transkripsiyon için kullanılabilir. Parafin gömülü doku blokları ve DIG-etiketli problar kullanım zamanına kadar 4 ° C ve -80 ° C, sırasıyla önceden hazırlanan ve saklanan olabilir. In situ hibridizasyon protokolü sonra en az dört gün içinde tamamlanabilir.

Discussion

Burada özetlenen in situ hibridizasyon yöntemi büyük hücresel çözünürlük, yüksek duyarlılık ve özgüllük ile ilgi herhangi bir genin Spatiotemporal ifade deseninin doğrudan görselleştirme sağlar . Protokol genler arasında ekspresyon düzeyleri kantitatif bir karşılaştırma izin vermez. Ancak, yöntemin yüksek hassasiyet ve çözünürlük, gen ekspresyonu analiz diğer yöntemler ile mümkün olmayan bir ^{doku 8, 18,} ​​içinde, gen ekspresyonu degradeler ortaya çıkarabilir.

Protokol, sorun giderme sorunlu yapabilirsiniz birçok adımları içerir. Protokolün en kritik adımlardan doku fiksasyon ve prob seçimi ve etiketleme. Düşük DIG dahil Kötü sızmış doku ve sondalar arka plan yukarıda tespit etmek zor olabilir çok zayıf sinyaller verecektir. Ilgi her yeni gen için, farklı türetilmiş bir kaç farklı problar denemek için tavsiye edilirtranskript bölgelerde kira. Bazen genin farklı bölgelerde küçük hedefleyen iki veya üç probları güçlü ve spesifik hibridizasyon sinyali elde etmek için bir araya gerekebilir. Buna ek olarak, hibridizasyon koşulları, sıcaklık ve hibridizasyon tamponu bileşimi olarak, hibridizasyon darlığı düşük ya da arttırmak için her bir gen ya da doku için optimize edilebilir. Ayrıca proteaz tedavi adım bir değişken ve farklı bitki türleri için ya da çok düşük bolluğu ile transkript tespiti için protokol adapte değiştirilebilir. Hem pozitif ve negatif kontrol probları dahil protokolün sorunlu noktaları belirlenmesinde yararlı olacaktır.

Prosedür parafine gömülü bitki doku bölümleri için optimize edilmiştir, ancak küçük değişiklikler, in situ hibridizasyon tüm montaj için de kullanılıyor olabilir. In situ hibridizasyon hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar ^19, tüm montaj yaygın olarak kullanılmasına karşın l olacakembriyolar, kökler veya genç Meristematik dokuların ^20,21 gibi kolayca sızmış olabilir bitki dokularında imited. Protokol aynı zamanda, eş zamanlı olarak iki ayrı mRNA'ların algılamak ^veya proteinleri 15,22,23 birlikte transkript lokalize kolayca değiştirilebilir. Sonuç olarak, bu yöntemin uygulama bitkilerin küçük RNA ekspresyonu görselleştirme uzatmak mümkündür. miRNA ekspresyonu, mısır ve ^Arabidopsis 8,14 hem de bu protokolü kullanılarak tespit edilmiştir . Daha yakın zamanlarda, in vitro transkripsiyonu probları yerini almış piyasada bulunan DIG etiketli kilitli nükleik asit (LNA) oligo probları artış hassasiyeti ve ^{sinyal 18, 24} .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytoseal 60 4oz	Fisher Scientific	23-244-256	Toluene-based 8310-4
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus	Fisher Scientific	23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+	GE Healthcare	RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL	Invitrogen	10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl	Promega Corp.	M6101
DIG-labeled Control RNA	Roche Group	11585746910
DIG RNA labeling mix	Roche Group	11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10881767001
RNase-A	Roche Group	109142	dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent	Roche Group	1 096 176	Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U	Roche Group	1 093 274
NBT/BCIP stock solution	Roche Group	1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Group	11814427001
tRNA from E. coli	Roche Group	109541
Triton®X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV	Sigma-Aldrich	P5147	Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8906-5G	Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate	Sigma-Aldrich	D2532
Albumin from bovine serum - ≥98%	Sigma-Aldrich	A7906
Eosin Y disodium salt	Sigma-Aldrich	E4382	Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds	Electron Microscopy Sciences	62352-15
Embedding rings	Fisher Scientific	22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps	VWR international	66020-326
Probe-on-plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm	VWR international	48404-452
Whatman paper 3mm	VWR international	89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack	Electron Microscopy Sciences	71420-25	Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers	Electron Microscopy Sciences	71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids			required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes			Help handing wax ribbons
Microtome			Leica
Self-cleaning dry vacuum system	Welch Allyn	2025
Slide warmer	Fisher Scientific
Heating block			needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C	Fisher Scientific		For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C	Fisher Scientific		Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood