Summary
Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien
Abstract
Funktionale Tests sind seit langem eine wichtige Rolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoff gespielt. Dies wird üblicherweise als Serum bakterizide Titer ausgedrückt. Studium der Serum bakterizide Titer in Reaktion auf Impfstoffen für Kinder haben es uns zur Entwicklung und Validierung cut-off Werte für schützende Immunantworten und wie cut-offs sind in den Routineeinsatz. Keine solche Assays wurden nach vorne in die Routine Beurteilung von Impfstoffen, die vor allem die zellvermittelte Immunität in Form von Effektor-T-Zell-Reaktionen, wie z. B. TB-Impfstoffe induzieren genommen. Im Tiermodell ist die Leistung eines bestimmten Impfstoff routinemäßig in standardisierten bakterizide Assays ausgewertet und alle aktuellen Roman TB-Impfstoff-Kandidaten haben diesen Schritt in ihrer Auswertung wurden die vor dem 1. Humanstudien Phase unterzogen. Die Beurteilung der Immunogenität und damit die Wahrscheinlichkeit der Schutzwirkung von neuartigen Anti-TB-Impfstoffe sollten im Idealfall durchlaufen eine ähnliche stufenweise Auswertung in der menschlichen Modellen nun auch eine Bestimmung in bakterizide Assays.
Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind bereits gut in den Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Es wurden jedoch keine solchen Tests in klinischen Studien für neue Anti-TB-Impfstoffe bisher einbezogen.
Zwar gibt es noch Ungewissheit über die genauen Mechanismen, die von Mykobakterien in humanen Makrophagen töten führen, ist die Interaktion von Makrophagen und T-Zellen mit Mykobakterien eindeutig erforderlich. Der Test in diesem Papier beschrieben stellt eine neuartige Generation von bakterizide Assays, die Untersuchungen solcher Schlüssel zellulären Komponenten ermöglicht mit allen anderen zellulären und humoralen Faktoren, die in Vollblut ohne Annahmen bezüglich ihrer relativen individuellen Beitrag. Der Test von unserer Gruppe beschrieben werden kleine Mengen von Blut und hat bereits in Studien an Erwachsenen und Kindern in TB-endemischen Einstellungen eingesetzt. Wir haben Immunogenität des BCG-Impfstoffes gezeigt, erhöhtes Wachstum von Mykobakterien bei HIV-positiven Patienten, sowie die Wirkung von anti-retroviralen Therapie und Vitamin D auf Mykobakterien Überleben in vitro. Hier fassen wir die Methodik, und präsentieren Ihnen unsere Reproduzierbarkeit Daten mit diesem relativ einfachen, kostengünstigen und Feld-freundlichen Modell.
Hinweis: Definitionen / Abkürzungen
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal Belastung, mit Shuttle-Plasmid pSMT1 Durchführung der luxAB Gene von Vibrio harveyi verwandelt, die unter der Kontrolle der Mykobakterien GroEL (Hsp60)-Promotor.
KBE = Kolonie bildende Einheiten (ein Maß für Mykobakterien Lebensfähigkeit).
Protocol
1. Vorbereitung der BCG lux Reporter Mykobakterien Lager
- Wachsen BCG lux (M. bovis BCG Montreal Stamm mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 umgewandelt) unter Schütteln bei 200rpm bis Mitte logarithmischen Phase in Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2% Glycerin, 0,05% zwischen 80 und 10% ADC Bereicherung.
- Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung.
- Laden Röhrchen mit N-Decyl-Aldehyd (Luciferase Enzym-Substrat) auf der Rückseite der Maschine und gewährleistet den Deckel befestigt ist, und Röhren statt.
- Prime Luminometer Injektor mit Substrat über die Prime-Programm auf 100 ucl x 3 in jeder der 3 leere Grundierung Rohre in das Luminometer platziert zu injizieren.
- Legen Sie die 2 Röhren in das Luminometer und nehmen Messungen über ein Programm zur Injektion 100 ucl von Substrat in jedes Röhrchen setzen und zu lesen für 20 sec in 1 Sekunden-Intervallen.
- Wenn die Aktie 1x10 8 RLU / ml zu 2x10 8 RLU / ml (dies dauert ca. 3-4 Tagen Wachstum) erreicht hat, das gleiche Volumen von sterilem 30% Glycerin, um die Kultur in einem 50ml Falcon-Röhrchen und vorsichtig mischen.
- Aliquot 1,5 ml Volumen in beschriftete 2ml Schraubverschluss Mikroröhrchen und bei -80 ° C.
2. Bestimmen Lager RLU / CFU Korrelation und die Inhalte der Aliquots
- Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe.
- Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur (RT) in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe.
- Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 4 Tage.
- An jedem Tag, Make-up seriellen 10-fach Verdünnungen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 und 1:100.000) für CFU Bestimmung.
- Richten Sie den gleichen Verdünnungen parallel und duplizieren, um Lumineszenz zu bestimmen (siehe Teil 1,2-1,6).
- Bereiten Sie zwei 3-Fach Platten Middlebrook 7H11-Agar (1 l flüssiges Medium mit 0,5% Glycerin, 10% OADC ergänzen, 1 ml 20% Tween und 1 ml Hygromycin).
- Platte aus 100 &mgr; l jeder Verdünnung auf ein Segment jeder Platte mit separaten Spreizer, verteilen die Flüssigkeit gleichmäßig auf die einzelnen Kammer.
- Seal jede Platte mit Parafilm, in einem sterilen Plastikbeutel, Dichtung mit Autoklav-Band, und bei 37 ° C für 2 Wochen mit Deckel nach unten.
- Überprüfen Sie regelmäßig, bis KBE erscheinen (2-3 Wochen).
- Zum Zählen Kolonien, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator nehmen und auf eine Kolonie zu begegnen. Berechnen Sie den Mittelwert für jede Verdünnung aus dem Duplikat-Platten.
- Berechnen Sie die RLU / CFU-Verhältnis mit entsprechenden RLU und KBE-Zählungen für jede Verdünnung. Das Verhältnis sollte zwischen 3 und 5 RLU / CFU werden.
3. Vorbereitung der BCG lux Kultur für die Impfung in Vollblut
- Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe.
- Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei RT in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe.
- Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 2 bis 4 Tagen.
- Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung.
- Prime Luminometer mit dem Substrat (wie oben beschrieben), vorsichtig vortexen der 2 Röhren und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben).
- Verwenden Sie diese Lesung zu verdünnen die Kultur in PBS zu einem Gegenwert von 7x10 6 RLU (dieser wird ein Inokulum von etwa 2x10 5 CFU / ml Blut und einem Verhältnis von BCG an Monozyten von etwa 1:1 zu geben, unter der Annahme einer Monozytenzahl des Gebens etwa 2x10 5 bis 4x10 5 Monozyten pro ml Blut).
4. Vorbereitung von Vollblut
- Nehmen Sie 3 bis 5 ml Venenblut in ein Röhrchen mit frei von Konservierungsmitteln Heparin.
- Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Falcon-Röhrchen und verdünnt mit dem gleichen Volumen RPMI 1640 mit Glutamin und 25 mM HEPES (keine Pen / Strep).
- Aliquot 900μl verdünntes Blut in dreifacher Ausfertigung in sterile bijou Rohre für jeden Zeitpunkt (6 Röhren in insgesamt:. 3 für 0HRS und 3 für 96 Stunden Einrichten zusätzlicher Röhren für zusätzliche Zeitpunkte, falls erforderlich.
- Aliquot 900μl der Middlebrooks 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC ergänzen + 50μg/ml Hygromycin (dem gleichen Medium wie die Kultur der BCG lux verwendet) in die für das Wachstum steuert duplizieren.
- Add 100 &mgr; der verdünnten BCG lux in jedes Röhrchen Blut, und die 2 WachstumskontrolleRohren.
- Gut mischen und statt der 3 Bijous für die 96hr Zeit-Punkt und die 2 Wachstum steuert auf ihrer Seite in dem schaukelnden Brutschrank bei 37 ° C, 20 U / min (CO 2 nicht erforderlich).
5. Mess-Lumineszenz (bei 0 STUNDEN und 96 Std.)
- Centrifuge die 3 Bijous bei 2000g für 10 min.
- Entfernen Sie vorsichtig 300μl Überstand, ohne das Pellet und in 2ml Schraubverschluss Röhrchen zu bei -80 ° C einzufrieren für nachfolgende Zytokin-Analyse.
- Fügen Sie 300μl PBS für jeden bijou, um die Lautstärke der Überstand entfernt zu ersetzen.
- Saugen Sie die Inhalte der einzelnen bijou in die entsprechenden 50ml Falcon-Röhrchen und fügen 8ml destilliertem Wasser in jedes Röhrchen. Beginnen Sie einen Timer für 10 min.
Nb: Dies ist eine Zeit-und Kleinschreibung Schritt, und dieser Inkubation darf nicht länger als 10 min, beginnend ab, wenn die Zellen zum ersten Mal in Kontakt mit Wasser. - Spülen Sie jede bijou mit 2 ml destilliertem Wasser und Vortex für 5 Sekunden, bevor Kippen in die entsprechenden Falcon-Röhrchen.
- Am Ende der 10 Minuten Inkubation Zentrifuge der Falcon-Röhrchen bei 2000g für 10 Minuten.
- Dekantieren Überstand in Surfanios Desinfektionsmittel.
- Fügen Sie ein paar Glasperlen zu jedem Pellet und vortexen.
- Add 1 ml sterilem PBS in jedes Röhrchen und vortexen.
- In Luminometer Rohre, machen 1:10 Verdünnungen für jede Probe in zweifacher Ausfertigung mit PBS (900μl PBS + 100 &mgr; Probe) und an der 96hr Zeitpunkt. Nehmen Sie die gleichen Verdünnungen für jeden der das Wachstum steuert.
- Vorsichtig vortexen die Rohre und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben)
Nb: Readings zwischen dreifach von der gleichen Probe sollte innerhalb von 15% voneinander werden.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Es ist wichtig, um Bakterien in der logarithmischen Phase des Wachstums für das gesamte Blut lux-Assays verwenden, dh über 48-72 Stunden angewachsen vor Inokulation der Proben, wie Stoffwechselaktivität ist suboptimal, wenn entweder direkt aus dem Gefrierschrank oder in der stationären Phase. Die vor Wachstum sollten standardisiert werden für eine Reihe von Experimenten, um entweder 48 oder 72 Stunden, um die Variabilität zu vermeiden. Abbildung 1 zeigt die Wachstumskurve einer repräsentativen Kultur des BCG lux. Die Verdoppelungszeit beträgt etwa 24 Stunden bis zur stationären Phase erreicht ist.
Abbildung 1. Representative Wachstumskurve BCG lux über 96 Stunden in 7H9 Medium und Korrelation von RLU und CFU.
Obwohl RLU-Werte immer mit CFU korrelieren, kann die Zahl der RLU entspricht einer CFU je nach Lager, weshalb es ratsam, die gleiche eingefroren Lager in einer Reihe von Experimenten verwenden, um eine konsistente Multiplizität der Infektion zu gewährleisten ist ( MOI).
Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für RAW-Datum zum Zeitpunkt der Impfung (T 0) und bei 96 Stunden. Das Wachstum Verhältnisse sind nach folgender Formel berechnet T 96 / T 0, aber auch andere Zeitintervalle können natürlich auch gemessen werden. Es ist jedoch ratsam, die Kulturen jenseits 96 Stunden zu verwenden, da erhebliche Zelltod eintritt.
Tabelle 1. Beispiel von Rohdaten zum Zeitpunkt der Impfung (T0) und bei 96 Stunden (T96) und berechnete Wachstum Verhältnisse von 3 erwachsenen Spendern.
Abhängig von den verfügbaren Antigen-spezifischen Gedächtnis Reaktionen und eventuell auch der neutrophilen Granulozyten, variieren Wachstum Verhältnisse zwischen Individuen, wie hier in Abbildung 2 im Blut von Kindern mit und ohne HIV-Infektion gezeigt. Im Durchschnitt kleine Kinder haben ein höheres Wachstum Verhältnisse als Erwachsene, haben Tuberkulin-Hauttest (TST) + ve Einzelpersonen geringeres Wachstum Verhältnisse als TST-ve Individuen und HIV-infizierten Patienten haben hohes Wachstum Verhältnisse durch den Mangel an CD4 T-Zell-Population, einer der wichtigsten Vermittler der zellulären Immunantwort gegen Mykobakterien.
Abbildung 2 Inter-Donor Variabilität:. Growth-Verhältnisse von T 0 im Vergleich zu 96 Stunden für eine Reihe von Patienten, je nach zugrunde liegende HIV-Status.
Reproduzierbarkeit des Wachstums Verhältnisse über einen längeren Zeitraum ist in Abbildung 3, die Ergebnisse von 64 Spendern blutete zweimal über einen Zeitraum von 12 Monaten und von einem einzigen Spender blutete immer wieder zur Kontrolle Experimente zusammengefasst dargestellt. Mögliche Ursachen der Variabilität könnten Veränderungen in mykobakterielle Sensibilisierung oder Variabilität innerhalb Ebenen der Host-Zytokine, wie in vielen Bioassays beobachtet werden.
Abbildung 3. (A) Single Spender auf 12 Anlässe über 12 Monate. (B) mehrere (64) Spender auf 2 Gelegenheiten über 12 monate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind auch in Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität.
Die erste Generation von Menschen bakterizide Assays wurden unter Verwendung Makrophagen allein, infiziert mit M. Tuberkulose. CFU diente als Haupt-Auslesen von Mykobakterien Überleben nach einem Minimum von 3 Wochen. Diese Assays zur Vorbereitung der PBMC, adhärenten Monozyten / Makrophagen und Lyse bei einer bestimmten Zeitpunkten 1,2 verlassen.
Als unser Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und T-Zellen zu M. enthalten Tuberkulose entwickelt, und die Trennung von verschiedenen Zellpopulationen mit magnetischen Beads war es nun möglich, wurden diese Systeme durch Zugabe von T-Zellen wieder in den Tests und Messungen CFU 3,4,5 geändert. Einige dieser Tests haben zu leben M. verwendet Tuberkulose, sondern eines der Haupthindernisse für die Arbeit mit M. Tuberkulose in bakterizide Assays ist die Notwendigkeit zur Eindämmung Einrichtungen und die Tatsache, dass CFU nur nach 3 Wochen der Kultur zur Verfügung. Darüber hinaus erfordern PBMC-basierte Assays eine große Menge an Blut und noch auf CFU verlassen als read-out, die 3 Wochen dauert.
Um eine schnellere Lese-outs zu erleichtern, basierend auf Stoffwechselaktivität wurden neue Assays entwickelt. In diesen Tests, Stoffwechsel-Aktivität gemessen wird als lebensfähiger Mykobakterien und drei verschiedene Systeme korrelieren haben in den letzten 10 Jahren entweder mit Uracil Einbau 4,5 konzipiert, Reporter-Gen Mykobakterien 6-11 oder eine radiometrische Detection System via BACTEC / Tag MDGIT Flaschen 7,8.
Die Vollblut-lux-Assay ist der einzige Test, um Datum, das bereits erfolgreich zur TB-endemischen Einstellungen übertragen und in Kinder 9,10. Darüber hinaus hat kein anderes Assay-Daten von intra-Spender Variabilität über einen Zeitraum von Zeit veröffentlicht.
Eine Begrenzung der lux-Assay ist die Abhängigkeit von genetisch veränderten Organismen und die Notwendigkeit, die Kultur des Organismus vor der Inokulation. Aufgrund der exakten Quantifizierung der Organismen, ist es möglich, eine sehr genaue Multiplizität der Infektion für jede Serie von Experimenten und jede Charge, die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit Hilfsmittel zu berechnen. Anweisungen müssen genau in der Vorbereitung der Stämme, gute Rentabilität der Bestände, die wichtig für eine erfolgreiche Umsetzung des Assays ist zu erreichen verfolgt werden. Da der Test erfolgt auf frisches Blut durchgeführt, ist es Zeit-und Kleinschreibung und Lagerung der Proben in das Feld ist nicht möglich. Im Idealfall braucht das Blut ins Labor innerhalb von 4 Stunden zu erreichen. Es könnte sein, in der Zukunft möglich sein, weiter zu reduzieren das Volumen des Blutes erforderlich, und unser Labor arbeitet derzeit an diesem.
Angesichts der niedrigen Kosten und Anwendbarkeit auf kleine Proben, ist es technisch möglich ist, diesen Test in die klinische Erprobung neuer TB-Impfstoffe 10 oder anti-TB Interventionen 11 zu integrieren. Dies würde eine zusätzliche Möglichkeit, nicht nur den Host-Reaktion auf den Impfstoff zu beurteilen, wie sich die derzeitige Praxis mit einer Reihe von immunologischen und molekularbiologischen Techniken (zB Durchflusszytometrie, ELISPOT und Microarray), sondern fügen Sie die funktionale Auslesen von Mykobakterien Überleben nach Wirt-Pathogen-Interaktion. Dies ist gängige Praxis, für die Impfstoffproduktion Einschätzungen in vorklinischen Studien im Tiermodell oder durch bakterizide Assays auf den Serum-Hemmung für andere Infektionen nicht unter Berufung auf die zelluläre Immunantwort basieren.
Es ist an der Zeit, diesen Ansatz, um neue TB-Impfstoffe anzuwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch persönliche Stipendien aus dem Wellcome Trust an Beate Kampmann (056.608, GRO77273) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
