Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Summary

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria

Abstract

מבחני פונקציונלית שיחקו זמן רב תפקיד מרכזי מדידה של immunogenicity של החיסון נתון. זה בא לידי ביטוי קונבנציונלית כמו titers bactericidal בסרום. מחקרים titers bactericidal בסרום בתגובה חיסונים בילדות אפשרו לנו לפתח לאמת חתוכים רמות המערכת החיסונית מגן כגון לחתוך-offs נמצאים בשימוש שגרתי. מבחני אין כאלה ננקטו קדימה לתוך הערכה שגרת חיסונים לגרום בעיקר התא בתיווך חסינות בדמות מפעיל התגובות תא T, כגון שחפת חיסונים. במודל חיה, הביצועים של מועמד חיסון נתון מוערך באופן שגרתי מבחני bactericidal סטנדרטית, וכל הנוכחית TB-חיסון מועמדים הרומן היה נתון בשלב זה להערכה שלהם לפני שלב 1 בניסויים בבני אדם. הערכת immunogenicity ולכן הסבירות של יעילות ההגנה של החיסון נגד שחפת רומן רצוי לעבור הערכה דומה צעד חכם של מודלים אנושיים עכשיו, כולל מדידות מבחני bactericidal.

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר חיסון שחפת כבר מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. עם זאת, אין מבחני כאלה שולבו ניסויים קליניים עבור חיסון נגד שחפת הרומן עד כה.

אמנם יש עדיין אי ודאות לגבי המנגנונים המדויקים שהובילו להרג של mycobacteria בתוך מקרופאגים אדם, האינטראקציה של מקרופאגים ותאי T עם mycobacteria נדרש בבירור. Assay המתואר במאמר זה מייצג דור חדש של מבחני bactericidal המאפשר מחקרים כאלה רכיבים סלולריים מפתח עם כל הגורמים הסלולר הלחות אחרים הנמצאים בדם שלם מבלי לעשות הנחות על התרומה היחסית הפרט שלהם. Assay שתואר על ידי הקבוצה שלנו משתמשת בנפחים קטנים של דם שלם כבר המועסקים מחקרים על מבוגרים וילדים TB-אנדמיים הגדרות. הראינו immunogenicity של חיסון BCG, גדל צמיחה של mycobacteria ב חולי איידס, כמו גם את ההשפעה של טיפול אנטי retroviral וויטמין D על הישרדות mycobacterial במבחנה. כאן אנחנו מסכמים את המתודולוגיה, ולהציג נתונים reproducibility שלנו באמצעות מודל פשוט יחסית, בעלות נמוכה ושדה ידידותי.

הערה: הגדרות / קיצורים

BCG לוקס = M. בוביס BCG, זן במונטריאול, הפך עם pSMT1 מעבורת הפלסמיד נושא את הגנים luxAB מ Vibrio harveyi, תחת שליטה של GroEL mycobacterial (hsp60) מקדם.
CFU = יחידת יצירת המושבה (מדד הכדאיות mycobacterial).

Protocol

1. הכנת מלאי לוקס כתב BCG mycobacteria

1. לגדול BCG לוקס (M. בוביס BCG זן מונטריאול הפך עם pSMT1 המעבורת פלסמיד) עם רעד בכל 200rpm לשלב אמצע לוגריתמי ב מידלברוק 7H9 מרק המכיל גליצרול 0.2%, 0.05% tween 80 ו - 10% העשרה ADC.
2. הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים.
3. טעינת שפופרת המכילה N-decyl אלדהיד (המצע האנזים בלוציפראז) על חלקו האחורי של המכשיר ולוודא את המכסה מאובטח וצינורות במקום.
4. ראש luminometer מזרק עם המצע באמצעות תוכנית הממשלה, קבע להזרים 100 UCL x 3 לתוך כל אחד 3 שפופרות ריק תחול להציב luminometer.
5. טען את 2 צינורות לתוך luminometer ולקחת קריאות באמצעות תוכנית להגדיר הזרקת 100 UCL של המצע לתוך הצינור כל ולקרוא במשך 20 שניות במרווחים של 1 שניות.
6. כאשר המניה הגיעה 1x10 ⁸ RLU / ml כדי 2x10 ⁸ RLU / מ"ל (זה לוקח בערך 3-4 ימים של צמיחה), מוסיפים נפח שווה של גליצרול 30% סטרילי לתרבות בצינור בז 50 מ"ל לערבב בעדינות.
7. Aliquot 1.5ml לתוך microtube כרכים שכותרתו בורג מכסה חנות 2ml ובבית -80 ° C.

2. קביעת RLU / CFU מניות קורלציה תוכן aliquots

1. הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ"ל Erlenmeyer עם כובע פרקו.
2. הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%.
3. הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר בטמפרטורת החדר (RT) בקבינט בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה.
4. דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
5. ביום אחד, להמציא סדרתי של פי 10 דילולים (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 ו - 1:100,000) להגדרה CFU.
6. הגדרת דילולים אותו במקביל כפולות, כדי לקבוע הארה (ראה חלק 1.2-1.6).
7. להכין שתי 3-תא צלחות אגר 7H11 מידלברוק (1 l של המדיום נוזל המכיל גליצרול 0.5%, תוספת OADC 10%, 1 מ"ל של Tween 20% ו - 1 מ"ל של hygromycin).
8. צלחת החוצה 100μl של דילול על כל קטע של כל צלחת באמצעות מפיצי נפרדים, הפצת נוזלי שווה על פני החדר בודדים.
9. חותם כל צלחת עם parafilm, מקום בתוך שקית פלסטיק סטרילית, חותם עם הקלטת החיטוי, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות עם מכסים כלפי מטה.
10. בדוק בקביעות עד CFUs להופיע (2-3 שבועות).
11. כדי לספור מושבות, להסיר את הצלחות מן החממה מקום על הדלפק מושבה. חשבו את הממוצע של דילול כל מהצלחות כפולים.
12. חישוב יחס RLU / CFU באמצעות RLU המקבילה וספירת CFU עבור כל דילול. היחס צריך להיות בין 3 ל 5 RLU / CFU.

3. הכנת תרבות לוקס חיסון BCG עבור לדם שלם

1. הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ"ל Erlenmeyer עם כובע פרקו.
2. הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%.
3. הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר ב RT בארון בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה.
4. דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 4 ימים.
5. הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים.
6. Luminometer ראש עם המצע (כמתואר לעיל), מערבולת בעדינות את 2 צינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל).
7. השתמש קריאה לדלל את התרבות PBS לתת שווה ערך של ⁶ RLU 7x10 (זה ייתן inoculum דם על 2x10 CFU / ⁵ מ"ל ו - יחס של BCG על מונוציטים כ 01:01, בהנחה של ספירת מונוציטים כ - ⁵ עד 2x10 4x10 ⁵ מונוציטים לכל מ"ל דם).

4. הכנה של דם מלא

1. קח 3 עד 5 מ"ל של דם ורידי בתוך שפופרת המכילה הפרין ללא חומר משמר.
2. מעבירים את הדם אל צינור בז 50 מ"ל ו לדלל עם נפח שווה של RPMI 1640 המכיל HEPES גלוטמין ו 25mm (לא עט / סטרפטוקוקוס).
3. Aliquot 900μl דם מדולל בשלושה עותקים תוך סטרילי צינורות תכשיט לכל נקודת זמן (6 צינורות סה"כ: 3. עבור 0hrs ו -3 עבור 96hrs הגדרת צינורות נוספים timepoints נוספות, במידת הצורך.
4. 900μl Aliquot של המדיום תרבות Middlebrooks 7H9 עם 10% + תוספת ADC 50μg/ml hygromycin (המדיום זהה בשימוש לתרבות לוקס BCG) בשני עותקים עבור פקדי צמיחה.
5. הוסף 100μl של BCG בדילול לוקס אל צינור אחד של דם, כדי לשלוט על 2 הצמיחהצינורות.
6. מערבבים היטב את המקום 3 bijous עבור 96hr זמן נקודות ו 2 שולטת צמיחה בצד שלהם בחממה נדנדה ב 37 ° C, 20 rev / min (CO ₂ לא חובה).

5. מדידת הארה (ב 0hr ו 96hrs)

1. צנטריפוגה 3 bijous ב 2000g במשך 10 דקות.
2. מוציאים בזהירות 300μl של supernatant מבלי להפריע גלולה ומניחים בורג מכסה microtubes 2ml להקפיא ב -80 ° C לניתוח ציטוקינים הבאים.
3. הוסף 300μl של PBS על כל תכשיט להחליף את נפח supernatant הוסרו.
4. לשאוב את תוכנו של כל תכשיט לתוך הצינור המקביל בז 50 מ"ל ולהוסיף מים מזוקקים 8ml על צינור אחד. בגין טיימר 10 דקות.
   הערה: זהו צעד זמן רגיש, הדגירה זה לא חייב להיות כל דקות יותר מ 10, החל כאשר התאים הראשונים לבוא במגע עם מים.
5. יש לשטוף את כל תכשיט עם 2ml מערבולת של מים מזוקקים למשך 5 שניות לפני מפנה לתוך הצינור בז המקביל.
6. בסוף הדגירה של 10 דקות, צנטריפוגה צינורות בז ב 2000g במשך 10 דקות.
7. למזוג לתוך supernatant חיטוי Surfanios.
8. הוספת חרוזי זכוכית מעטים כל גלולה ו מערבולת.
9. הוסף 1ml של PBS סטרילי כדי צינור כל מערבולת.
10. ב צינורות luminometer, לעשות דילולים 1:10 למדגם כל כפולות עם (מדגם + 900μl PBS 100μl) PBS ובבית 96hr נקודת זמן. הפוך את דילולים זהה עבור כל אחד שולט צמיחה.
11. מערבולת בעדינות את הצינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל)
    הערה: הקריאות בין triplicates מדגם זהה צריך להיות בתוך 15% של אחד אחר.

6. נציג התוצאות:

חשוב להשתמש בחיידקים בשלב לוגריתמי של צמיחה עבור מבחני לוקס כולו דם, גדל כלומר מעל 48-72 שעות לפני inoculating דגימות, כמו הפעילות המטבולית הוא הכי מוצלח, אם את או ישר מהמקפיא או בשלב נייח. הגידול לפני צריכה להיות סטנדרטית עבור סדרה של ניסויים כדי או 48 או 72 שעות כדי למנוע השתנות. איור 1 מציג את עקומת הגידול של התרבות נציג BCG לוקס. זמן ההכפלה הוא כ 24 שעות עד השלב נייח הוא הגיע.

1. איור נציג צמיחה עקומה של BCG לוקס מעל 96 שעות בינוני 7H9 ואת המתאם של RLU ו CFU.

למרות הערכים RLU תמיד לתאם עם CFU, מספר RLU המתאים CFU יחיד יכול להשתנות בהתאם למלאי, ולכן הוא מומלץ להשתמש המניות קפוא אותו לאורך סדרה של ניסויים כדי להבטיח ריבוי עקביים של זיהום ( משרד הפנים).

טבלה 1 מציגה דוגמא תאריך הגלם בזמן של חיסון (ט ₀₎ ו - ב 96 שעות. יחסי הצמיחה מחושבים באמצעות הנוסחה T ₉₆ / T _0, אך מרווחי הזמן אחרים יכולים כמובן גם להימדד. היא, לעומת זאת, מומלץ לא להשתמש תרבויות מעבר 96 שעות, כמו מוות של תאים משמעותי מתרחש.

טבלה 1. דוגמא של נתונים גולמיים בזמן של חיסון (T0) ו ב 96 שעות (T96) ויחסים הצמיחה מחושב מ 3 תורמים מבוגר.

בהתאם זמין אנטיגן ספציפי לערמונית התגובות זיכרון לספור ואולי גם נויטרופילים, יחס צמיחה להשתנות בין יחידים, כפי שמוצג כאן באיור 2 בדמם של ילדים עם ובלי זיהום HIV. בממוצע, ילדים צעירים יש יחס צמיחה גבוה יותר מאשר מבוגרים, מבחן טוברקולין עור (TST) + אנשים יש להם יחסי צמיחה נמוך מ-TST יש אנשים, ו-HIV-נגועים יש יחס צמיחה גבוה בשל מחסור של האוכלוסייה תא T מסוג CD4, אחד המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית התאית mycobacteria.

איור 2 Inter-התורם השתנות:. יחסי צמיחה של T ₀ לעומת 96 שעות עבור קבוצה של חולים, בהתאם למצב HIV הבסיסית.

שחזור של יחסי צמיחה על פני תקופה של זמן מוצג באיור 3, אשר מסכם את התוצאות של 64 תורמים זוב דם פעמיים במשך תקופה של 12 חודשים מאותו תורם דימם שוב ושוב ניסויים שליטה. סיבות אפשריות של השתנות יכול להיות שינויים רגישות השתנות mycobacterial או בתוך רמות ציטוקינים המארח, כפי שנצפה ב bioassays רבים.

איור 3. (א) תורם יחיד על 12 מקרים במשך 12 חודשים. (ב) מרובות (64) תורמים על 2 מקרים מעל 12 מ 'onths.

Discussion

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר החיסון לשחפת מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity.

הדור הראשון של מבחני bactericidal אדם עוצבו באמצעות מקרופאגים לבד, נגוע מ שחפת. CFU שימש הראשי לקריאה מתוך הישרדות mycobacterial לאחר פרק זמן מינימלי של 3 שבועות. מבחני אלה הסתמכו על הכנת, מונוציטים PBMC חסיד / מאקרופאגים תמוגה בנקודות זמן נתון ^1,2.

כפי הבנתנו את יחסי הגומלין המורכבים יותר בין מקרופאגים ותאי T להכיל מ שחפת התפתחה, הפרדת אוכלוסיות תאים שונות באמצעות חרוזים מגנטיים עכשיו האפשר, מערכות אלה שונו על ידי הוספת בתאי T בחזרה מבחני מדידה CFU ^3,4,5. חלקם של מבחני אלה השתמשו לחיות מ שחפת, אבל אחד המכשולים העיקריים של העבודה עם מ ' שחפת מבחני bactericidal הוא הצורך מתקני הבלימה והעובדה CFU זמינים רק לאחר 3 שבועות של תרבות. בנוסף, PBMC מבוססי מבחני דורשים כמות גדולה של דם עדיין מסתמכים על CFU לקריאה החוצה, אשר לוקח 3 שבועות.

כדי להקל מהירה יותר לקרוא-outs, המבוסס על פעילות מטבולית, מבחני חדש תוכננו. מבחני אלה, הפעילות המטבולית נמדדת כמו לתאם קיימא של מערכות שונות mycobacterial ושלושה עוצבו ב 10 השנים האחרונות או באמצעות שילוב אורציל ^4,5, עיתונאי, גן מתויג ^6-11 mycobacteria או מערכת איתור רדיומטרי דרך BacTec / MDGIT בקבוקי ^7,8.

Assay כל lux דם הוא assay רק לאותו מועד הועבר בהצלחה TB-אנדמיים ההגדרות המשמשים ילדים ^9,10. יתר על כן, אין assay אחרים פרסמה נתונים של השתנות פנים התורם על פני תקופה של זמן.

הגבלה של assay לוקס הוא הסתמכות על אורגניזמים מהונדסים גנטית לבין הצורך בתרבות האורגניזם לפני חיסון. עם זאת, בשל כימות מדויק של אורגניזמים, ניתן לחשב את ריבוי מדויק מאוד של זיהום לכל סדרה של ניסויים כל אצווה, אשר מסייע השוואה ו reproducibility. הוראות צריך להיות במעקב צמוד בהכנה של זנים על מנת להשיג טובות הכדאיות של מניות, אשר חיוני עבור יישום מוצלח של assay. מאז assay מתבצעת על דם טרי, זה זמן רגיש אחסון של דגימות בתחום אינו אפשרי. באופן אידיאלי, הדם צריך להגיע למעבדה בתוך 4 שעות. זה עשוי להיות אפשרי בעתיד לצמצם עוד יותר את נפח הדם הנדרש, במעבדה שלנו הוא עובד כרגע על זה.

בהתחשב בעלות ישימות נמוכה כדי דגימות קטנות, זה אפשרי מבחינה טכנית לשלב את זה לתוך assay ניסויים קליניים של חיסון שחפת רומן ¹⁰ או שחפת נגד התערבות ^11. זה יספק הזדמנות נוספת להעריך לא רק את התגובה לארח לחיסון, כפי שנהוג כיום באמצעות מערך של טכניקות אימונולוגיות מולקולרית (כגון cytometry זרימה, ELISPOT ו microarray), אלא להוסיף פונקציונלי לקרוא מתוך mycobacterial הישרדות הבאים אינטראקציה מארח הפתוגן. זהו מנהג נפוץ הערכות החיסון טרום קליניים מחקרים במודל חיה או באמצעות מבחני bactericidal מבוסס על עיכוב נסיוב לטיפול בדלקות אחרות לא להסתמך על המערכת החיסונית התאית.

זה בזמן ליישם גישה זו חיסונים TB רומן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	BD Biosciences	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	BD Biosciences	212240
Tween 80	Sigma-Aldrich	274364
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche Group	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR international	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma-Aldrich	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold Technologies
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD Biosciences	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD Biosciences	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR international	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	Sigma-Aldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	Any Supplier
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	Any Supplier
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures