Summary
Vi beskriver en alternativ metod till i uppräkningen av mykobakterier
Abstract
Funktionella analyser har länge spelat en nyckelroll i att mäta immunogenicitet av en viss vaccin. Detta är konventionellt uttryckt som serum bakteriedödande titrar. Studier av serum bakteriedödande titrar som svar på barnvacciner har gjort det möjligt för oss att utveckla och validera cut-off nivåer för skyddande immunsvar och sådant cut-off är i rutinmässig användning. Inga sådana analyser har tagits fram i rutinen bedömning av vacciner som inducerar främst cell-medierad immunitet i form av effektor T cells svar, såsom tuberkulos vacciner. I djurmodell, är resultatet av ett visst vaccin kandidat rutinmässigt utvärderas i standardiserade bakteriedödande analyser, och alla nuvarande nya tbc-vaccinkandidater har utsatts för detta steg i sin utvärdering före fas 1 försök på människa. Bedömningen av immunogenicitet och därmed sannolikheten för skyddande effekten av nya anti-tbc vaccin bör helst genomgå en liknande stegvis utvärdering i den mänskliga modeller nu, även mätningar i bakteriedödande analyser.
Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen redan är väl etablerade i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet. Dock har inga sådana analyser införlivats i kliniska prövningar för nya anti-tbc vaccin hittills.
Även om det fortfarande osäkerhet om de exakta mekanismer som leder till dödandet av mykobakterier inne mänskliga makrofager, är interaktionen mellan makrofager och T-celler med mykobakterier klart krävs. Analysen som beskrivs i detta dokument representerar en ny generation av bakteriedödande analyser som möjliggör studier av sådana viktiga cellulära komponenter med alla andra cellulära och humorala faktorer i helblod utan att göra antaganden om deras relativa individuella bidrag. Analysen beskrivs av vår grupp använder små mängder av blod och har redan använts i studier av vuxna och barn i TB-endemiska inställningar. Vi har visat immunogenicitet av BCG-vaccinet, ökad tillväxt av svamp inom HIV-positiva patienter, samt effekten av antiretroviral behandling och vitamin D på mykobakteriella överlevnad in vitro. Här kan vi sammanfatta metoden och presentera våra reproducerbarhet data med hjälp av denna relativt enkla, billiga och fält-vänlig modell.
OBS: Definitioner / Förkortningar
BCG-lux = M. bovis BCG, Montreal stam, förvandlas med skyttel plasmid pSMT1 bär luxAB gener från Vibrio harveyi, under kontroll av mykobakteriell GroEL (hsp60) promotor.
CFU = Colony Forming enhet (ett mått på mykobakteriella bärkraft).
Protocol
1. Beredning av BCG-lux reporter mykobakterier lager
- Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam förvandlas med rymdfärjan plasmiden pSMT1) med skakning på 200rpm till mitten av logaritmiska fas i Middlebrook 7H9 buljong innehåller 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 och 10% ADC anrikning.
- Förbered 1 ml av en 1:10 spädning av BCG-lux kultur i sterila PBS i en luminometer rör (900μl PBS + 100μl BCG lux kultur) i två exemplar.
- Ladda röret med N-decyl aldehyd (luciferas enzymsubstrat) på baksidan av maskinen och se till att locket sitter fast och rör på plats.
- Prime luminometer injektor med substrat via prime-programmet, som att injicera 100 UCL x 3 i vardera av 3 tomma priming rören placeras i luminometer.
- Lägg i 2 rör i luminometer och ta avläsningar via ett program inställd på att injicera 100 UCL av substrat i varje rör och läsa för 20 sek i 1 sek intervall.
- När beståndet har nått 1x10 8 RLU / ml till 2x10 8 RLU / ml (detta tar ca 3-4 dagar av tillväxt), lägg en lika stor volym av steril 30% glycerol till kulturen i en 50ml falk röret och blanda försiktigt.
- Alikvotera 1,5 ml volymer i märkta 2ml skruvkork mikrorör och förvara vid -80 ° C.
2. Bestämma lager RLU / CFU korrelation och innehållet i alikvoter
- Tillsätt 15ml av Middlebrook 7H9 odlingsmedium med 10% ADC komplement till en 200 ml E-kolv med ett ventilerat lock.
- Tillsätt 15μl av hygromycin och 30μl 20% Tween.
- Ta en flaska med BCG lux från frysen och tina i rumstemperatur (RT) i säkerhetsbänk. Tillsätt innehållet i flaskan för mediet och skruva åt locket.
- Inkubera med skakning på 200rpm vid 37 ° C under 4 dagar.
- Vid varje dag, smink seriell 10-faldigt utspädningar (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 och 1:100,000) för CFU beslutsamhet.
- Ställ in samma spädningar parallellt och två gånger för att bestämma luminiscens (se del 1,2 till 1,6).
- Förbered två 3-fack plattor av Middlebrook 7H11 agar (1 liter vätska innehållande 0,5% glycerol, 10% OADC komplettera, 1 ml 20% Tween och 1 ml hygromycin).
- Plattan 100μl av varje utspädning till en del av varje platta med separata spridare, fördela vätskan jämnt över de enskilda kammare.
- Försegla varje tallrik med parafilm och placera i en steril plastpåse, förslut med autoklav tejp, och inkubera vid 37 ° C i 2 veckor med lock nedåt.
- Inspektera regelbundet tills CFUs visas (2-3 veckor).
- Att räkna kolonier, ta bort plattorna från kuvösen och lägg på en koloni disk. Beräkna medelvärdet för varje utspädning från de dubbla plattor.
- Beräkna RLU / CFU ratio med motsvarande RLU och CFU räknas för varje spädning. Förhållandet bör vara mellan 3 och 5 RLU / CFU.
3. Beredning av BCG lux kultur för ympning på helblod
- Tillsätt 15ml av Middlebrook 7H9 odlingsmedium med 10% ADC komplement till en 200 ml E-kolv med ett ventilerat lock.
- Tillsätt 15μl av hygromycin och 30μl 20% Tween.
- Ta en flaska med BCG lux från frysen och tina vid RT i säkerhetsbänk. Tillsätt innehållet i flaskan för mediet och skruva åt locket.
- Inkubera med skakning på 200rpm vid 37 ° C under 2 till 4 dagar.
- Förbered 1 ml av en 1:10 spädning av BCG-lux kultur i sterila PBS i en luminometer rör (900μl PBS + 100μl BCG lux kultur) i två exemplar.
- Prime luminometer med substrat (enligt ovan), Vortexa försiktigt de 2 rören och ladda in i luminometer och ta avläsningar (enligt ovan).
- Använd denna läsning för att späda ner kultur i PBS för att ge en motsvarande 7x10 6 RLU (detta kommer att ge ett inokulat av ca 2x10 5 cfu / ml blod och ett förhållande på BCG till monocyter på ca 01:01, förutsatt en monocyt räkna av ca 2x10 5 till 4x10 5 monocyter per ml blod).
4. Beredning av helblod
- Ta 3 till 5 ml venöst blod i ett rör som innehåller konserveringsmedel heparin.
- Överför blod till ett 50 ml falk rör och späd med en lika stor volym RPMI 1640 innehåller glutamin och 25mm HEPES (ingen penna / STREP).
- Alikvotera 900μl av utspätt blod i tre exemplar till sterila bijou rör för varje tidpunkt (6 tuber totalt:. 3 för 0hrs och 3 för 96hrs Ställ in ytterligare rör för ytterligare tidpunkter om det behövs.
- Alikvotera 900μl av Middlebrooks 7H9 odlingsmedium med 10% ADC tillägg + 50μg/ml hygromycin (samma medium som används till kultur BCG-lux) i duplikat för tillväxt kontroller.
- Tillsätt 100μl av den utspädda BCG lux till varje rör med blod, och till 2 Growth Controlrör.
- Blanda väl och placera 3 bijous för 96hr tid punkt och 2 kontroller tillväxten på sin sida i den gungande inkubator vid 37 ° C, 20 varv / min (CO 2 krävs inte).
5. Mätning luminiscens (vid 0hr och 96hrs)
- Centrifugera 3 bijous vid 2000g i 10 min.
- Ta försiktigt bort 300μl av supernatanten utan att störa pelleten och lägg i 2 ml skruvkork mikrorör att frysa vid -80 ° C för senare cytokin analys.
- Tillsätt 300μl PBS till varje bijou att ersätta den volym av supernatanten tas bort.
- Aspirera innehållet i varje bijou till motsvarande 50ml falken röret och tillsätt 8ml destillerat vatten till varje rör. Börja en timer för 10 min.
OBS: Detta är en tidskänslig steg, och denna inkubation får inte vara längre än 10 min, med början från det att cellerna först kommer i kontakt med vatten. - Skölj varje bijou med 2 ml destillerat vatten och skaka i 5 sekunder innan tippa till motsvarande falk röret.
- I slutet av 10 minuters inkubation, centrifugera falk rören vid 2000g i 10 minuter.
- Dekantera supernatanten i Surfanios desinfektionsmedel.
- Lägg i några glaspärlor för att varje pellet och skaka.
- Tillsätt 1 ml steril PBS till varje rör och skaka.
- I luminometer rör, gör 1:10 spädningar för varje prov i duplikat med PBS (900μl PBS + 100μl prov) och vid 96hr tid-punkten. Gör samma spädningar för varje tillväxt kontroller.
- Vortexa försiktigt rören och ladda in i luminometer och ta avläsningar (enligt ovan)
OBS: Avläsningar mellan tre exemplar av samma prov ska ligga inom 15% av varandra.
6. Representativa resultat:
Det är viktigt att använda bakterier i logaritmiska tillväxtfas för helblod lux-analyser, dvs vuxit under 48-72 timmar före inokulering proverna, som metabolisk aktivitet är suboptimal om antingen direkt ur frysen eller i stationär fas. Den tidigare tillväxten bör standardiseras för en serie experiment till antingen 48 eller 72 timmar för att undvika variabilitet. Figur 1 visar tillväxtkurvan av en företrädare kultur av BCG-lux. Fördubblingen är ca 24 timmar tills stationär fas är nådd.
Figur 1. Representant tillväxtkurva av BCG lux under 96 timmar i 7H9 medelstora och korrelation RLU och CFU.
Även RLU värden alltid korrelerar med CFU, kan antalet RLU motsvarar en enda CFU variera beroende på lager, varför det är bra att använda samma frysta bestånd under en serie experiment för att garantera en konsekvent mångfald av infektion ( MOI).
Tabell 1 visar ett exempel på rå datum vid tidpunkten för ympning (t 0) och på 96 timmar. Tillväxten nyckeltal beräknas enligt formeln T 96 / T 0, men andra tidsintervall kan naturligtvis också mätas. Det är dock tillrådligt att inte använda de kulturer än 96 timmar, som betydande celldöd inträffar.
Tabell 1. Exempel på rådata vid tidpunkten för ympning (T0) och på 96 timmar (T96) och beräknade nyckeltal tillväxt från 3 vuxna givare.
Beroende på tillgänglig antigenspecifika minne reaktioner och möjligen också neutrofila granulocyter, tillväxten förhållandet varierar mellan individer, som visas här i figur 2 i blodet hos barn med och utan HIV-infektion. I genomsnitt små barn har högre tillväxt kvoter än vuxna, tuberkulintest (TST) + ve individer har en lägre tillväxt förhållanden än TST-ve individer, och HIV-infekterade patienter har hög tillväxt nyckeltal på grund av brist på CD4 T-cell population, en av de viktigaste medlare av cellulära immunsvaret mot mykobakterier.
Figur 2 Inter-givare variation:. Tillväxt nyckeltal av T 0 jämfört med 96 timmar för en uppsättning av patienter, beroende på underliggande HIV-status.
Reproducerbarhet av tillväxt nyckeltal över en period visas i figur 3, som sammanfattar resultaten från 64 donatorer blödde två gånger under en period av 12 månader och från en enda donator blödde flera gånger för kontroll experiment. Möjliga orsaker till variation kan vara förändringar i mykobakteriella allergi eller en förändring inom nivåer värd cytokiner, som observerats i många biologiska testsystem.
Figur 3. (A) enskild givare vid 12 tillfällen under 12 månader. (B) flera (64) givare på 2 tillfällen under 12 months.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen är väl etablerat i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet.
Den första generationen av mänskliga bakteriedödande analyser har utformats med hjälp av makrofager ensam, infekterade med M. tuberkulos. CFU var den viktigaste avläsning av mykobakteriell överlevnad efter en minsta tid av 3 veckor. Dessa analyser förlitat sig på beredning av PBMC, anhängare monocyter / makrofager och lys vid givna tidpunkter 1,2.
Som vår förståelse av de mer komplexa interaktioner mellan makrofager och T-celler att innehålla M. tuberkulos utvecklats och separation av olika cellpopulationer med magnetiska kulor nu var möjligt, har dessa system ändras genom att lägga till T-celler tillbaka in i analyser och mäta CFU 3,4,5. Några av dessa tester har använt levande M. tuberkulos, men ett av de största hindren i arbetet med M. tuberkulos i bakteriedödande analyser är behovet av inneslutning anläggningar och det faktum att CFU endast är tillgängliga efter 3 veckor av kultur. Dessutom PBMC-baserade analyser kräver en stor mängd blod och fortfarande är beroende av CFU som läst-out, som tar tre veckor.
För att underlätta en snabbare läs-outs, baserade på metaboliska aktiviteten har nya analyser utformade. I dessa analyser är metabolisk aktivitet mäts som ett nödvändigt korrelat för livskraftig mykobakteriella och tre olika system har utvecklats under de senaste 10 åren med hjälp av antingen uracil införlivande 4,5, reporter-genen taggade mykobakterier 6-11 eller en radiometrisk detektionssystem via Bactec / MDGIT flaskor 7,8.
Hela blod lux-analysen är det enda test hittills som har framgångsrikt överförts till TB-endemiska inställningar och användas på barn 9,10. Dessutom har ingen annan analys publicerade data av interna givare variation över en tidsperiod.
En begränsning av lux-analysen är dess beroende av genetiskt modifierade organismer och behovet av att kulturen organismen före ympningen. Men på grund av exakt kvantifiering av organismer, är det möjligt att beräkna en mycket exakt mängd av infektion för varje serie av experiment och varje parti, som stöd jämförbarhet och reproducerbarhet. Instruktioner måste följas noga vid utarbetandet av stammarna att uppnå en god lönsamhet för aktier, vilket är viktigt för ett framgångsrikt genomförande av analysen. Eftersom analysen görs på färskt blod, är det tidskänsliga och lagring av prover i fält är inte möjligt. Helst behöver blod för att nå laboratoriet inom 4 timmar. Det kan vara möjligt i framtiden för att ytterligare minska den mängd blod som behövs, och vårt laboratorium arbetar för närvarande med detta.
Med tanke på den låga kostnaden och tillämplighet för små prover, är det tekniskt möjligt att integrera denna analys i kliniska prövningar av nya tbc-vaccin 10 eller anti-tuberkulos interventioner 11. Detta skulle ge ytterligare en möjlighet att bedöma inte bara värd svar på vaccinet, vilket är nuvarande praxis med hjälp av en rad immunologiska och molekylära tekniker (såsom flödescytometri, ELISPOT och microarray), men att lägga till den funktionella läste ur mykobakteriella överlevnaden efter värd-patogen interaktion. Detta är allmän praxis för vaccin bedömningarna i prekliniska studier i djurmodell eller genom att använda bakteriedödande analyser baserade på serum hämning för andra infektioner som inte förlitar sig på cellulära immunsvaret.
Det är lämpligt att tillämpa denna metod på nya tbc-vacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av personliga stipendier från Wellcome Trust till Beate Kampmann (056.608, GRO77273).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
