Summary
우리는 mycobacteria의 열거에 대한 대안적인 접근 방식을 설명
Abstract
기능성 assays 오래 주어진 백신 immunogenicity의 측정에 중요한 역할을했습니다. 이것은 통상 혈청 bactericidal titers으로 표시됩니다. 어린 시절 백신에 대한 응답으로 혈청 bactericidal titers의 연구는 일상적인 사용에 우리가 보호 면역 반응과 같은 컷 오프에 대한 수준을 개발하고 차단 확인할 수있게했습니다. 그런 assays는 그러한 TB 백신으로 효과기 T 세포 응답의 형태로 주로 세포 매개 면역을 유발 백신의 일상적인 평가에 앞으로 이동되지 않았습니다. 동물 모델에서 특정 백신 후보의 성능은 정기적으로 표준 bactericidal assays에서 평가되며, 현재의 모든 소설 TB - 백신 후보는 1 인체에 실험을 위상하기 전에 자신의 평가에서이 단계를 받게되었습니다. immunogenicity 따라서 소설 안티 - TB 백신의 보호 효능 가능성의 평가는 이상적으로 bactericidal assays의 측정을 포함하여, 지금은 인간의 모델과 유사한 단계 현명한 평가를 받아야한다.
그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays은 이미 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소. 그러나, 그러한 assays 데이트 소설 안티 - 결핵 백신에 대한 임상 실험에 포함되지 않았습니다.
인간의 macrophages 내부 mycobacteria의 살인으로 이어지는 정확한 메커니즘에 대한 불확실성이 여전히 있지만, mycobacteria과 macrophages 및 T 세포의 상호 작용은 명확하게 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 분석들은 상대적으로 개인의 기여에 대한 가정을하지 않고 전체 피에 다른 모든 세포와 체액성 요소와 같은 주요 세포 구성 요소의 연구를 가능하게 bactericidal assays의 소설 세대를 나타냅니다. 우리의 그룹에 의해 설명하는 분석은 전체 혈액의 작은 볼륨을 사용하여 이미 TB - 지방병 설정에서 성인과 어린이의 연구에 채용되었습니다. 우리는 BCG 백신의 immunogenicity를 볼 HIV 양성 환자에서 mycobacteria의 성장뿐만 아니라 체외에서 mycobacterial 생존에 방지 retroviral 요법과 비타민 D의 효과를 증가하고있다. 여기서 우리는 방법론을 요약하고이 비교적 간단하고 저렴한 비용 및 현장 친화적인 모델을 사용하여 우리의 재현성 데이터를 제시한다.
참고 : 정의 / 약어
BCG 럭스 = M. bovis BCG, 몬트리올 변형은 mycobacterial GroEL (hsp60) 발기인의 통제하에, 장염 harveyi에서 luxAB 유전자를 나르는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 바꾸었다.
CFU =의 콜로니 형성 단위 (mycobacterial 생존의 측정).
Protocol
1. BCG 럭스 기자 mycobacteria 재고 준비
- BCG 성장 럭스 미들 7H9 국물이 0.2 % 글리세롤, 0.05 % 십대 초반 80와 10 %의 ADC 농축을 포함하는 중간에 로그 단계로 200rpm에서 잡고 (셔틀 플라스미드 pSMT1로 변환 M. bovis BCG 몬트리올 변형).
- 중복에 luminometer 튜브 (900μl PBS + 100μl BCG 룩스 문화)에서 멸균 PBS에서 BCG 럭스 문화의 1시 10분 희석의 1ml를 준비합니다.
- 컴퓨터의 뒷면에 N - decyl 알데히드 (루시페라제 효소 기판)이있는 튜브를로드하고 뚜껑이 자리에 안전하고 튜브 있는지 확인하십시오.
- luminometer에 배치 3 빈 마중물 튜브의 각으로 100 ucl X 3 주입으로 설정 주요 프로그램을 통해 기판과 수상 luminometer 주입기.
- luminometer로 2 튜브를로드하고 각 튜브에 기판의 100 ucl을 주입에서 설정 프로그램을 통해 신호를 1 초 간격 20 초위한 읽어보십시오.
- 주식 1x10 8 RLU / ML에 2x10 8 RLU / ML을 (이것은 성장의 3~4일에 대한 소요)에 도달되면, 50ml 팔콘 튜브의 문화 멸균 30 % 글리세롤의 동일한 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다.
- -80에서 레이블 2ml 나사 캡 microtube하고 저장 ° C.으로 나누어지는 1.5ml 볼륨을
2. 결정 재고 RLU / CFU 상관 관계 및 aliquots의 내용
- 통풍 모자와 200ml Erlenmeyer 플라스크 10 % ADC의 보완과 함께 미들 7H9 문화 매체 15ml를 추가합니다.
- 20 %의 십대 초반의 hygromycin와 30μl의 15μl를 추가합니다.
- 안전 캐비닛에 실내 온도 (RT)에서 냉동고와 서리를 없애다에서 BCG 럭스의 병을 제거합니다. 매체에 유리병의 내용을 추가하고 뚜껑을 조입니다.
- 37 200rpm에서 흔들어 ° C를 4 일간 함께 품어.
- 매일, CFU 결정을위한 일련 10 배 dilutions을 (1시 10분, 1:100, 1:1000, 1:10,000과 1:100,000)까지합니다.
- 병렬 같은 dilutions을 설정하고 (일부 1.2-1.6 참조) 발광을 결정하기 위해 중복.
- 미들 7H11 한천 배지 (0.5 % 글리세롤 10 % OADC 보완, 20 % 십대 초반과 hygromycin 1 ML 1 ML을 포함하는 액체 매질 1 L)의 두 3 구획 접시를 준비합니다.
- 각 챔버에 걸쳐 균등하게 액체를 배포 별도 밧침대를 사용하여 각 접시의 세그먼트에 각 희석의 100μl, 나가 플레이트.
- parafilm 각 접시, 멸균 플라스틱 봉투에 장소, 압력솥 테이프와 인감 도장, 37에서 품어 ° C를 2 주 동안 다운 향하게 뚜껑과 함께.
- CFUs이 (2-3 주) 나타날 때까지 정기적으로 검사합니다.
- 식민지를 계산하려면, 보육과 식민지 카운터에 장소에서 접시를 제거합니다. 중복 접시에서 각 희석에 대한 의미를 계산합니다.
- 각각의 희석에 대한 동등한 RLU 및 CFU 카운트를 사용하여 RLU / CFU 비율을 계산합니다. 비율은 3과 5 RLU / CFU 사이 여야합니다.
3. 전체 혈액에 대한 BCG 접종 럭스 문화의 준비
- 통풍 모자와 200ml Erlenmeyer 플라스크 10 % ADC의 보완과 함께 미들 7H9 문화 매체 15ml를 추가합니다.
- 20 %의 십대 초반의 hygromycin와 30μl의 15μl를 추가합니다.
- 안전 캐비닛에 RT에서 냉장고와 서리를 없애다에서 BCG 럭스의 병을 제거합니다. 매체에 유리병의 내용을 추가하고 뚜껑을 조입니다.
- 37 200rpm에서 흔들어 ° C를 2-4일 위해 함께 품어.
- 중복에 luminometer 튜브 (900μl PBS + 100μl BCG 룩스 문화)에서 멸균 PBS에서 BCG 럭스 문화의 1시 10분 희석의 1ml를 준비합니다.
- 기판과 프라임 luminometer (위에서 설명한 것처럼), 부드럽게 2 튜브 소용돌이와 luminometer로로드하고 판독을 (위에서 설명한 것처럼) 가져가라.
- 7x10 6 RLU의 등가를 (이것은의 단핵구 수를 가정, 1시 1분 약 monocytes에 2x10 약 5 CFU / ML 혈액과 BCG의 비율 inoculum를 제공합니다 제공하는 PBS의 문화를 희석이 읽기를 사용하여 혈액 ML 당 4x10 5 2x10 약 5 monocytes).
4. 전체 혈액의 준비
- 방부제없는 헤파린이 들어있는 튜브에 정맥 혈액 5ml 3을 가져가라.
- 50ml 팔콘 튜브에 혈액을 전송 및 글루타민과 25mM HEPES를 (없음 펜 / strep)이 포함된 RPMI 1640의 동일한 볼륨 희석.
- . 0hrs 3과 96hrs 3 필요한 경우, 추가 timepoints에 대한 추가 튜브를 설정합니다. 때마다 포인트 살균 보석 튜브 (총 6 튜브에 세중의에 희석 혈액 나누어지는의 900μl
- 에서 10 % ADC 보충 + 50μg/ml hygromycin (BCG 럭스 문화 사용된 같은 매체)와 미들 브룩 7H9 문화 매체 나누어지는에 900μl의 성장 제어를위한 중복.
- 혈액의 각 튜브에 희석 BCG 럭스의 100μl를 추가하고 2 성장 제어튜브.
- 잘 믹스 37의 락을 인큐베이터에서 쪽에서 시간 - 포인트 96hr과 2 성장 컨트롤 3 bijous을 배치 ° C, 20 레브 / 분 (CO 2는 필요하지 않습니다.)
5. 측정 발광 (0hr 및 96hrs에서)
- 10 분 2,000그램에서 3 bijous을 원심 분리기.
- 조심스럽게 -80시 동결에 2ml 나사 캡 microtubes의 펠렛과 장소를 방해하지 않고 뜨는의 300μl 제거 ° C 후속 시토킨 분석.
- 삭제 뜨는의 볼륨을 교체하기 위해 각 보석에 PBS의 300μl를 추가합니다.
- 해당 50ml 팔콘 튜브에 각 보석의 내용을 대기음 각 튜브에 8ml 증류수를 추가합니다. 10 분 타이머를 시작합니다.
주의 사항 : 이것은 시간에 민감한 단계이며,이 부화는 세포가 먼저 물과 접촉했을 때부터 시작, 더 이상보다 10 분해서는 안됩니다. - 해당 팔콘 튜브에 팁 전에 5 초 동안 증류수와 소용돌이 2ml 각 보석을 씻어.
- 10 분 부화 끝에, 10 분 동안 2천그램에서 팔콘 튜브를 원심 분리기.
- Surfanios의 살균제에 가만히 따르다에 뜨는.
- 각 펠렛과 와동에 몇 유리 구슬을 추가합니다.
- 각각의 튜브와 와동에 멸균 PBS의 1ml을 추가합니다.
- luminometer 튜브에서 PBS (PBS 900μl가 + 100μl 샘플)와 중복의 시간과 포인트 96hr 각 샘플에 대한 1시 10분 dilutions합니다. 성장 컨트롤 각각에 대해 동일한 dilutions하십시오.
- 부드럽게 튜브 소용돌이와 luminometer로로드하고 판독을 (위에서 설명한 것처럼) 걸릴
주의 : 동일한 샘플 triplicates 사이의 수치가 서로의 15 % 이내에 있어야합니다.
6. 대표 결과 :
그것은 대사 활동이 suboptimal 한, 즉 이전에 샘플을 inoculating하는 48-72시간 이상 성장, 전체 혈액 럭스 assays를위한 성장 단계에 로그 박테리아를 사용하는 것이 중요합니다 냉동고의 직선 밖으로 하나 경우 또는 고정 단계 인치 이전 성장 다양성을 피하기 위해 48 또는 72시간 중 하나에 일련의 실험을 위해 표준화되어야합니다. 그림 1은 BCG 럭스의 대표 문화의 성장 곡선을 보여줍니다. 고정 단계에 도달할 때까지 두 배로 시간은 24 시간 정도입니다.
BCG의 그림 1. 대표 성장 곡선 럭스 7H9 매체와 RLU와 CFU의 상관 관계에 96시간 이상.
RLU 값이 항상 CFU와 연관 있지만, 하나의 CFU에 해당 RLU의 숫자는 감염의 일관된 다중성을 보장하기 위해 일련의 실험을 통해 같은 냉동 주식을 사용하는 것이 좋습니다 이유있는가 (즉, 주식에 따라 달라질 수 입니다만).
표 1은 접종 시간 (T 0)에서, 96시간에서 원료 날짜의 예를 보여줍니다. 성장 비율은 공식 T 96 / T 0을 사용하여 계산하지만, 다른 시간 간격은 물론도 측정할 수 있습니다. 중요한 세포 사망이 발생하는대로이 단, 권장, 96시간 넘어 문화를 사용하지 않습니다.
표 1. 접종 (T0)의 시간과 96시간 (T96) 3 성인 기증자로부터 계산의 성장 비율에 원시 데이터의 예.
사용할 수있는 항원 - 특정 메모리 반응과 가능성 또한 호중구 카운트에 따라 성장 비율과 함께 아이들의 혈액에서 그림 2와 HIV 감염없이 여기 그림과 같이, 개인 간의 차이가 있습니다. 평균, 어린 아이들이 성인보다 높은 성장 비율을 가지고, 투베르쿨린 피부 반응 검사 (TST) +했습니다 개인이 TST - 봤어요 개인보다 낮은 성장 비율을 갖고 있으며 HIV에 감염된 환자는 CD4 T 세포 인구의 결핍으로 인해 성장 비율을 가지고 mycobacteria에 세포 면역 반응의 핵심 중재자 중 하나.
그림 2 인터 기증자 다양성 :. 기본 HIV 상태에 따라 환자의 집합에 대한 T 0 대 96시간의 성장 비율.
일정 기간 동안 성장 비율의 재현성은 12 개월 이상 단일 기증자 제어 실험 반복 출혈에서 출혈이 64 회 기증자의 결과를 요약한 그림 3에 표시됩니다. 다양성의 잠재적인 원인은 많은 bioassays에서 관찰 호스트 크린 시토킨의 수준 이내 mycobacterial sensitization이나 다양성의 변화 수 있습니다.
그림 3. 12 개월 동안 12 차례에 (A) 단일 기증자. 12m 이상의 두 경우에 (B) 복합 (64) 기증자onths.
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Discussion
그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소.
인간 bactericidal assays의 첫 번째 세대 M. 감염, 혼자 macrophages을 사용하여 설계되었다 결핵. CFU 3 주 최소 시간이 지나면 mycobacterial 생존의 읽기 밖의 주요 역임 하였다. 이러한 assays은 주어진 시간 지점 1,2에 PBMC, 자기편 monocytes / macrophages 및 용해의 준비에 의존.
macrophages 및 M.를 포함하는 T 세포 사이의 좀 더 복잡한 상호 작용에 대한 우리의 이해로서 결핵이 진화하고, 자기 구슬을 사용하여 여러 가지 세포 집단의 분리 지금 가능, 이러한 시스템은 assays에 다시 T 세포를 추가하고 CFU 3,4,5를 측정하여 수정되었습니다. 이러한 assays 중 일부는 라이브 M.를 사용한 결핵하지만, M. 작업의 주요 방해물 중 하나 bactericidal assays의 결핵 억제 시설과 CFU 문화의 3 주 후에에서만 사용할 수있다는 사실이 필요합니다. 또한, PBMC 기반 assays은 혈액의 다량을 요구하면서 읽기 아웃, 3 주 정도 소요되는 등 CFU에 의존하고 있습니다.
대사 활동에 기초하여 더 빠른 읽기 아웃을 촉진하기 위하여, 새로운 assays이 설계되었습니다. 유라실의 설립 중 하나가 4,5을 사용하여 지난 10 년 동안 설계되었습니다 가능한 mycobacterial과 세 가지 시스템의 상호 연관 이러한 assays에서 대사 활동 측정, 기자 - 유전자 mycobacteria 6-11 또는 / BacTec 통해 radiometric 탐지 시스템 태그 MDGIT 병 7,8.
전체 혈액 럭스 분석이 성공적으로 TB - 지방병 설정 전송 어린이 9,10에서 사용되었습니다 날짜 수있는 유일한 분석이다. 또한, 다른 분석은 일정 기간 동안 내부 기증 다양성의 데이터를 출판 없다.
럭스 분석의 한계는 유전자 변형 생물체에 대한 의존도와 문화 접종하기 전에 유기체를 필요합니다. 그러나, 생물의 정확한 양을 정함으로 인해, 그것은 comparability과 재현성을 에이즈 실험의 각 시리즈의 각 배치에 대한 감염의 매우 정확한 다중성을 계산하는 것이 가능합니다. 지침은 분석의 성공적인 구현을 위해 필수적이며, 주식의 좋은 가능성을 달성하기 위해 긴장의 준비에 밀접하게 따라해야합니다. 분석은 신선한 혈액 수행되기 때문에, 그것은 시간에 민감한이며 분야에서 샘플의 저장이 가능하지 않습니다. 이상적으로, 혈액 4 시간 이내에 연구소에 도착해야합니다. 그것은 더 이상 필요한 혈액의 볼륨을 줄이기 위해 미래에 가능한 것, 우리 연구소는 현재이 일에 노력하고 있습니다.
작은 샘플로 낮은 비용과 적용 감안할 때, 그것은 새로운 결핵 백신 10 방지 TB의 개입 11 임상 실험에이 분석을 통합하는 기술적으로 가능합니다. 이것은 백신으로뿐만 아니라 호스트 응답을 평가하기 위해 추가적인 기회를 제공하는 것처럼 면역 및 분자 기술의 배열 (예 : 유동세포계측법, ELISPOT 및 microarray 등)를 사용하여 현재의 관행은,하지만 기능은 mycobacterial 밖으로 읽기에 추가 호스트 병원체 상호 작용 다음의 생존. 이것은 동물 모델이나 세포 면역 반응에 의존하지 다른 감염에 대한 혈청 억제에 따라 bactericidal assays를 사용하여 사전 임상 연구에서 백신 평가를위한 일반적인 방법입니다.
그것은 소설 결핵 백신이 접근 방식을 적용하기 위해 시의 적절합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Wellcome 트러스트에서 비테 Kampmann (056608, GRO77273) 개인 장학금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
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