Qui si descrive un metodo per quantificare l'eterogeneità molecolare in sezioni istologiche di materiale tumorale mediante immunofluorescenza quantitativa, analisi di immagine, e una misura statistica di eterogeneità. Il metodo è destinato ad essere utilizzato nello sviluppo di biomarker clinici e analisi.
Eterogeneità morfologica all'interno di un singolo tumore è ben riconosciuta da istopatologi nella pratica chirurgica. Anche se questo spesso assume la forma di aree di differenziazione riconosciuti distinte in sottotipi istologici, o differente grado patologico, spesso ci sono differenze più sottili nel fenotipo che sfidano classificazione accurata (Figura 1). In definitiva, poiché la morfologia è dettata dal fenotipo molecolare alla base, aree con differenze visibili sono suscettibili di essere accompagnata da differenze nell'espressione delle proteine che orchestrano le funzioni cellulari e di comportamento, e quindi, l'aspetto. Il significato del visibile e invisibile (molecolare) eterogeneità per la prognosi non è nota, ma studi recenti dimostrano che, almeno a livello genetico, l'eterogeneità esistente nel 1,2 tumore primario, e alcuni di questi sub-cloni dar luogo a metastasi ( e quindi letale) della malattia.
Inoltre, alcune proteine sonomisurata come biomarcatori perché sono gli obiettivi della terapia (ad esempio ER e HER2 per tamoxifene e trastuzumab (Herceptin), rispettivamente). Se queste proteine mostrano espressione variabile all'interno di un tumore poi risposte terapeutiche può essere anche variabile. Gli schemi ampiamente utilizzato punteggio istopatologici per immunoistochimica o ignorano, o numericamente omogeneizzare la quantificazione di espressione della proteina. Allo stesso modo, nelle tecniche distruttive, dove vengono omogeneizzati i campioni tumorali (come ad esempio profili di espressione genica), informazioni quantitative possono essere chiarito, ma le informazioni spaziali è perduto. Eterogeneità genetica approcci mappatura nel cancro del pancreas hanno fatto affidamento sia sulla generazione di una sospensione singola cella 3 o il 4 macrodissection. Un recente studio ha utilizzato punti quantici per mappare l'eterogeneità morfologica e molecolare nel tessuto cancro alla prostata 5, fornendo prova di principio che la mappatura morfologica e molecolare è fattibile, ma cadendo short di quantificare l'eterogeneità. Dal immunoistochimica è, nella migliore delle ipotesi, solo semi-quantitative e soggetti a bias intra-ed inter-osservatore, più sensibili e metodologie quantitative sono necessarie per mappare con precisione e quantificare l'eterogeneità dei tessuti in situ.
Abbiamo sviluppato e applicato una metodologia sperimentale e statistico per quantificare sistematicamente l'eterogeneità di espressione della proteina in sezioni di tessuto di tumori tutto, sulla base dell'analisi automatica quantitativa (AQUA) del sistema 6. Sezioni di tessuto sono etichettati con anticorpi specifici diretti contro citocheratine e gli obiettivi di interesse, accoppiato al fluoroforo marcati con anticorpi secondari. Le diapositive vengono esposte con un tutto-slide scanner fluorescenza. Le immagini sono suddivise in centinaia di migliaia di piastrelle, ed ogni tessera viene quindi assegnato un punteggio AQUA, che è una misura della concentrazione di proteine all'interno del epiteliale (tumore), componente del tessuto. Heatmaps sono generati per rappresentare l'espressione delle proteine dei tessuti e eterogeneità assegnato un punteggio, utilizzando una misura statistica di eterogeneità originariamente utilizzato in ecologia, in base indice di biodiversità del Simpson 7.
Ad oggi non ci sono stati tentativi di mappare sistematicamente e quantificare questa variabilità in tandem con l'espressione della proteina, in preparati istologici. Qui illustriamo il primo utilizzo del metodo applicato per ER e HER2 espressione biomarcatori nel carcinoma ovarico. Usando questo metodo apre la strada per analizzare l'eterogeneità come variabile indipendente negli studi di espressione dei biomarcatori negli studi traslazionali, al fine di stabilire il significato di eterogeneità nella prognosi e la previsione di risposte alla terapia.
Il metodo descritto qui di quantificazione permette di eterogeneità molecolare in standard fissati in formalina, incluse in paraffina, sezioni istologiche di materiale tumorale. Il metodo permette un valore da assegnare al grado di eterogeneità in una sezione di tessuto, in modo che questa possa poi essere preso in considerazione come una variabile nello sviluppo di biomarker e analisi. Mentre in generale è preferibile che i biomarcatori del tessuto sono omogenei rispetto a espressione, in modo che il saggio è meno soggetto a errori di campionamento o pregiudizi, potrebbe in alcune circostanze essere utile per quantificare l'eterogeneità come parametro. Per esempio, come mostrato nell'esempio illustrativo per ER e HER2, biomarcatori comuni mostrano una notevole eterogeneità di espressione ed è attualmente noto se questo rappresenta un fattore prognostico indipendente predittivo o riguardo al risultato clinico o la risposta alla terapia, rispettivamente. Allo stesso modo, come illustrato, la terapia si potrebbe modificare dinamicamente lapopolazioni costituente delle cellule, e quindi la misura di arricchimento obiettivo potrebbe essere utile nel guidare le decisioni terapeutiche.
Tuttavia, la tecnica è limitata dagli stessi fattori che limitano la tradizionale analisi istopatologica o biomarker (come la immunoistochimica). Il risultato dipende dal tipo, dimensione e qualità del tessuto in fase di analisi, e quindi una sezione di tessuto unico non può essere rappresentativo l'intero tumore. Infatti, l'indice di Simpson può essere indebitamente influenzati dalla dimensione del tessuto (numero di fotogrammi catturati e punteggi AQUA misurato). L'immunogenicità del epitopi misurato può essere soggetto a incontrollabili pre-analitica artifactually fattori che alterano la loro espressione attraverso la sezione di tessuto (come il tempo di ischemia fredda, o la lunghezza di fissazione, e artefatto bordo). Ciò è particolarmente un problema per fosfo-epitopi, che sono notoriamente labili 14, 15. Pertanto la tecnica potrebbe essere più adattoagli esemplari resezione piuttosto che piccole biopsie, ed eseguito su più sezioni piuttosto che uno solo. In ultima analisi, tecniche di imaging 3D può offrire l'opportunità di quantificare meglio questo parametro.
La tecnica come presentato può anche essere limitata da fattori biologici, come la variabilità nella espressione della citocheratina epitopo mascheramento. Questo potrebbe essere di particolare preoccupazione in quei tumori, tra cui il cancro al seno e alle ovaie, che subiscono epiteliali a mesenchimali transizione (EMT) o sono arricchiti per i non-epiteliali componenti o le cellule staminali 16, come è stato recentemente dimostrato che si verificano in chemioterapia trattamento del cancro ovarico in vitro 17, e nei pazienti con carcinoma mammario in risposta alla terapia 18. Questa limitazione può essere superata utilizzando anticorpi mascheramento alternativi (o un cocktail di anticorpi), come citocheratina più vimentina, che è upregulated in EMT 16. Inoltre, poiché gli altri componenti del tessuto (il microfonoroenvironment), come fibroblasti o cellule endoteliali vascolari sono sempre più presi di mira da terapie biologiche, la tecnica può anche essere ampliato per segnare questi componenti, utilizzando maschere specifiche per i comparti di interesse, come PECAM / CD31 a macchia di cellule endoteliali vascolari .
Anche se l'adattamento dell'indice della Simpson è stata utilizzata come misura di eterogeneità nel protocollo attuale grazie alla sua semplicità, altre misure di eterogeneità potrebbero essere utilizzati, come ad esempio semplici misure di tendenza centrale (media, varianza, mediana, ecc.) Inoltre, la Simpson calcoli dell'indice potrebbe essere modificato per adattarsi meglio una particolare popolazione di prova. L'uso di Z-score trasformazioni permette il punteggio di essere più applicabile per i marcatori multipli in quanto l'eterogeneità si basa sulla deviazione intorno alla media di un insieme di dati. Tuttavia, la gamma complessiva di punteggio può essere limitato in questo tipo di trasformazione. Alcuni progetti potrebbero essere più adattisemplicemente bin i punteggi AQUA reale per tutti i campioni di un insieme particolare marcatore. La scelta del numero di cassonetti e di tagli è anche una limitazione nella gamma di valori che può provocare e può essere ottimizzato per l'alternativa disegni sperimentali.
Abbiamo usato ER e HER2 in questo studio come biomarcatori candidato, dal momento che sono già utilizzati in clinica, aiutare a rispondere a quesiti clinici rilevanti rispetto alla efficacia delle terapie mirate, e sono noti per esibire notevole eterogeneità e il cambiamento nella scuola primaria e distanti malattia 19. Tuttavia, l'indicatore ottimale di eterogeneità Resta da stabilire. Altre possibilità possono includere i marcatori di clonalità citogenetica, come quelli già utilizzati negli studi PESCE interfase 20. L'approccio richiede la convalida ulteriormente in grandi coorti ben annotato cliniche o studi clinici al fine di stabilire ulteriormente la rilevanza di questo parametro nella biologia del cancro.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal finanziamento scozzese Consiglio (Grant Numero HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), Medical Research Scozia ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), il Cancro Research UK Cancer Centro di Medicina Sperimentale ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), e Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |