Her beskriver vi en metode til at kvantificere molekylære heterogenitet i histologiske dele af tumor materiale ved hjælp af kvantitative immunfluorescens, billedanalyse, og et statistisk mål for heterogenitet. Metoden er beregnet til brug i klinisk biomarkør udvikling og analyse.
Morfologiske heterogenitet inden for den enkelte tumor er godt anerkendt af histopathologists i kirurgisk praksis. Mens det ofte tager form af områder med forskellige differentiering i anerkendte histologiske undertyper, eller forskellige patologiske kvalitet, ofte er der mere subtile forskelle i fænotypen, som trodser nøjagtig klassificering (Figur 1). I sidste ende, da morfologi er dikteret af den underliggende molekylære fænotype, områder med synlige forskelle, der sandsynligvis vil blive ledsaget af forskelle i ekspression af proteiner, som iscenesætte cellulære funktion og adfærd, og derfor udseende. Betydningen af synlige og usynlige (molekylær) heterogenitet for prognosen er ukendt, men nye oplysninger tyder på, at i det mindste på det genetiske niveau, heterogenitet findes i den primære tumor 1,2, og nogle af disse sub-kloner give anledning til metastatisk ( og derfor dødelige) sygdom.
Desuden er nogle proteiner ermålt som biomarkører, fordi de er mål for behandling (for eksempel skadestuen og HER2 for tamoxifen og trastuzumab (Herceptin), henholdsvis). Hvis disse proteiner vise variable udtryk inden for en tumor så terapeutisk Reaktionerne kan også være variabel. Den udbredte histopatologiske scoring ordninger for immunhistokemi enten ignorere eller numerisk homogenisere en kvantificering af protein udtryk. Tilsvarende i destruktive teknikker, hvor tumorprøver er homogeniseret (såsom genekspression profilering), kan kvantitative oplysninger være belyst, men geografisk information er gået tabt. Genetisk heterogenitet kortlægning tilgange inden for bugspytkirtelkræft har påberåbt sig enten på generering af en enkelt celle suspension 3, eller på macrodissection 4. En nylig undersøgelse har anvendt kvantepunkter for at kortlægge morfologiske og molekylære heterogenitet i prostata cancer væv 5, giver bevis for princippet om, at morfologi og molekylær kortlægning er muligt, men faldende sHort at kvantificere den heterogenitet. Siden immunhistokemi er i bedste fald er kun semi-kvantitativ og genstand for intra-og inter-observatør bias, mere følsomme og kvantitative metoder, der kræves for at præcist at kortlægge og kvantificere væv heterogenitet in situ.
Vi har udviklet og anvendt en eksperimentel og statistiske metoder med henblik på systematisk at kvantificere heterogenitet af protein udtryk i hele vævssnit af tumorer, baseret på Automated Kvantitativ analyse (Aqua) system 6. Vævssnittene er mærket med specifikke antistoffer rettet mod cytokeratiner og mål af interesse, koblet til fluoroforen-mærkede sekundære antistoffer. Slides er filmede med en hel-slide fluorescens scanner. Billederne er opdelt i flere hundrede til tusinder af fliser, og hver flise er derefter tildelt en AQUA score, som er en måling af protein koncentration inden for epithelial (tumor) komponent i væv. HEAtmaps genereres til at repræsentere væv udtryk for proteiner og en heterogenitet tildelte score ved hjælp af en statistisk måling af heterogenitet oprindeligt brugt i økologi, baseret på Simpson biodiversitet indeks 7.
Til dato har der ikke været nogen forsøg på systematisk at kortlægge og kvantificere denne variation i tandem med protein udtryk i histologiske præparater. Her viser vi den første brug af den anvendte metode til skadestuen og HER2 biomarkør udtryk i kræft i æggestokkene. Med denne metode baner vejen for at analysere forskellighed som en uafhængig variabel i studier af biomarkør udtryk i translationelle undersøgelser med henblik på at fastslå betydningen af heterogenitet i prognosen og forudsigelse af respons på behandlingen.
Metoden er beskrevet heri tillader kvantificering af molekylære heterogenitet i standard formalinfikserede, paraffinindstøbte histologisk dele af tumor materiale. Metoden tillader en værdi, der skal tildeles til graden af heterogenitet i et væv afsnit, således at dette så kan tages i betragtning som en variabel i biomarkør udvikling og analyse. Mens det generelt er at foretrække, at vævs-biomarkører er homogene med hensyn til udtryk, således at analysen er mindre modtagelige for prøvetagning fejl eller partiskhed, kan det under visse omstændigheder være nyttigt at kvantificere forskellighed som en parameter. For eksempel, som vist i illustrativt eksempel på skadestuen og HER2, fælles biomarkører udviser stor heterogenitet udtryk og det er i øjeblikket uvist, om dette udgør en selvstændig prognostisk eller prædiktiv faktor med hensyn til klinisk udfald eller respons på behandlingen, hhv. På samme måde, som illustreret, kan terapi i sig selv dynamisk ændrebestanddel populationer af celler, og derfor måling af målet berigelse kunne være nyttigt at vejlede behandlingen beslutninger.
Men den teknik, begrænset af de samme faktorer, som begrænser traditionel histopatologiske eller biomarkør (f.eks immunhistokemiske) analyser. Resultatet er afhængig af den type, størrelse og kvaliteten af det væv, der analyseres, og derfor et enkelt vævssnit kan ikke være repræsentative for hele tumor. Faktisk kan Simpson-indeks være urimelig skævhed efter størrelse af væv (antallet af billeder taget til fange og AQUA scores målt). Immunogeniciteten af de epitoper, der måles kan være genstand for ustyrlige præanalytiske faktorer, som artifactually ændre deres udtryk på tværs af vævssnit (såsom kolde iskæmi tid, eller længden af fiksering, og kant artefakter). Dette er især et problem for fosfor-epitoper, som er notorisk labile 14, 15. Derfor teknikken kunne være bedre egnettil resektion prøver snarere end små biopsier, og udføres på flere sektioner i stedet for kun én. I sidste ende kan 3D-billeddiagnostiske teknikker giver mulighed for bedre at kvantificere denne parameter.
Den teknik, som præsenteres kan også være begrænset af biologiske faktorer, såsom variation i udtryk for cytokeratin maskering epitop. Dette kan være af særlig bekymring i de kræftformer, herunder ovarie og brystkræft, der undergår epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), eller er beriget til ikke-epitelial komponenter eller stamceller 16, som har for nylig vist sig at forekomme i kemoterapi- behandles kræft i æggestokkene in vitro-17, og i brystkræftpatienter som reaktion på behandlingen 18. Denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af alternative maskering antistoffer (eller cocktails af antistoffer), som f.eks cytokeratin plus vimentin, der er opreguleret i EMT 16. Hertil kommer, da andre dele af væv (MICroenvironment), såsom fibroblaster eller vaskulære endotelceller er også i stigende grad ramt af biologiske behandlinger, kan teknikken også blive udvidet til at score disse komponenter, brug af særlige masker til rum af interesse, såsom PECAM / CD31 til pletten for vaskulære endotelceller .
Selv om tilpasning af Simpson-indekset har været brugt som et mål for heterogenitet i den nuværende protokol på grund af sin enkelhed, kan andre foranstaltninger af heterogenitet skal anvendes, såsom simple målinger af centrale tendens (middelværdi, varians, median, osv.). Derudover kunne Simpson indeks beregninger ændres til bedre passer til en bestemt testpopulationen. Brugen af Z-score transformationer gør det muligt at score at være mere relevant for flere markører, da heterogeniteten er baseret på afvigelse omkring middel for et datasæt. Dog kan den samlede vifte af scoring være begrænset i denne type transformation. Nogle mønstre kan være bedre egnetblot bin selve AQUA score for alle prøver af en bestemt markør sæt. Udvælgelsen af antallet af beholdere og cutoffs er også en begrænsning i det område af værdier, som kan medføre og kan være optimeret til alternativ eksperimenterende designs.
Vi har brugt skadestuen og HER2 i den aktuelle undersøgelse som kandidat biomarkører, da de allerede anvendes i klinikken, hjælpe med at besvare relevante kliniske spørgsmål med hensyn til effekten af målrettede behandlinger, og er kendt for at udstille en betydelig heterogenitet og forandringer i folkeskolen og fjern sygdom 19. Men den optimale markør af heterogenitet er endnu ikke fastslået. Andre muligheder kunne være cytogenetiske markører for clonality, såsom dem, der tidligere blev anvendt i mellemfasen FISH undersøgelser 20. Den tilgang kræver yderligere validering i store, godt kommenteret kliniske kohorter eller kliniske forsøg for yderligere at fastlægge relevansen af denne parameter i cancer biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af den skotske Funding Rådet (Grant Number HR07005, http://www.sfc.ac.uk/ ), Medicinsk Forskning Skotland ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), Kræftens Forskning Storbritannien Forsøgscenter Cancer Medicin Centre ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), og Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |