Nous décrivons ici une méthode pour quantifier l'hétérogénéité moléculaire dans des coupes histologiques de matériel tumoral par immunofluorescence quantitative, analyse d'image, et une mesure statistique de l'hétérogénéité. La méthode est destinée à être utilisée dans le développement de biomarqueurs cliniques et analyses.
L'hétérogénéité morphologique au sein d'une tumeur individuelle est bien reconnu par histopathologistes dans la pratique chirurgicale. Bien que cela prend souvent la forme de zones de différenciation distincts en sous-types histologiques reconnues, ou différents de grade pathologique, souvent il ya des différences plus subtiles dans le phénotype qui défient classification précise (figure 1). En fin de compte, puisque la morphologie est dicté par le phénotype moléculaire sous-jacent, les zones avec des différences visibles sont susceptibles d'être accompagnés par des différences dans l'expression de protéines qui orchestrent la fonction cellulaire et le comportement, et donc, de l'apparence. L'importance de visible et invisible (moléculaire) l'hétérogénéité pour le pronostic est inconnue, mais des données récentes suggèrent que, au moins au niveau génétique, l'hétérogénéité existe dans la tumeur primaire 1,2, et certains de ces clones sous-donnent lieu à des métastases ( et donc mortel) de la maladie.
En outre, certaines protéines sontmesurées en tant que biomarqueurs, parce qu'ils sont les cibles de la thérapie (par exemple pour ER et HER2 pour le tamoxifène et le trastuzumab (Herceptin), respectivement). Si ces protéines montrent une expression variable au sein d'une tumeur, puis les réponses thérapeutiques peuvent également être variable. Les régimes largement utilisé score histopathologique pour l'immunohistochimie ou ignorer, ou numériquement homogénéiser la quantification de l'expression des protéines. De même, dans les techniques destructrices, où les échantillons tumoraux sont homogénéisés (telles que le profilage d'expression génique), les informations quantitatives peut être élucidé, mais l'information spatiale est perdue. Approches de cartographie génétique hétérogénéité dans le cancer du pancréas ont compté ni sur la génération d'une suspension cellulaire unique 3 ou le 4 macrodissection. Une récente étude a utilisé des boîtes quantiques dans le but de cartographier l'hétérogénéité morphologique et moléculaire dans les tissus de la prostate 5, fournissant la preuve de principe que la cartographie morphologie et moléculaire est réalisable, mais la chute de lHort de quantifier l'hétérogénéité. Depuis l'immunohistochimie est, au mieux, que semi-quantitative et sujettes à des biais intra-et inter-observateur, plus sensibles et les méthodologies quantitatives sont nécessaires afin de cartographier avec précision et de quantifier l'hétérogénéité des tissus in situ.
Nous avons développé et appliqué une méthodologie expérimentale et statistiques afin de mesurer systématiquement l'hétérogénéité d'expression des protéines dans des coupes de tissus ensemble des tumeurs, basée sur l'analyse automatisée quantitatives (AQUA) du système 6. Des sections de tissu sont marquées avec des anticorps spécifiques dirigés contre les cytokératines et des cibles d'intérêt, couplée à un fluorophore anticorps secondaires marqués. Les lames sont imagées par un scanner de fluorescence entière-diapositive. Les images sont subdivisés en centaines de milliers de tuiles, et chaque carreau est ensuite attribué un score AQUA qui est une mesure de la concentration en protéines dans le épithéliales (tumeur) composante du tissu. Heatmaps sont générés afin de représenter l'expression tissulaire des protéines et un score hétérogénéité affecté, en utilisant une mesure statistique de l'hétérogénéité à l'origine utilisée en écologie, basé sur l'indice de Simpson biodiversité 7.
À ce jour il n'ya eu aucune tentative de cartographier systématiquement et quantifier cette variabilité en tandem avec l'expression de protéines contenues dans des préparations histologiques. Ici, nous illustrons la première utilisation de la méthode appliquée à l'ER et HER2 l'expression de biomarqueurs dans le cancer de l'ovaire. En utilisant cette méthode ouvre la voie à l'analyse de l'hétérogénéité comme une variable indépendante dans les études d'expression de biomarqueurs dans les études translationnelles, afin d'établir l'importance de l'hétérogénéité dans le pronostic et la prédiction des réponses au traitement.
Le procédé décrit ici la quantification permet d'hétérogénéité moléculaire dans la norme fixés au formol et inclus en paraffine coupes histologiques de matériel tumoral. Le procédé permet une valeur à attribuer au degré d'hétérogénéité dans une coupe de tissu, de sorte que cela peut alors être pris en compte comme une variable dans le développement de biomarqueurs et d'analyse. Bien qu'en général il est préférable que les biomarqueurs tissulaires sont homogènes par rapport à l'expression, de sorte que le dosage est moins sensible aux erreurs d'échantillonnage ou de partialité, il pourrait, dans certaines circonstances être utile pour quantifier l'hétérogénéité comme un paramètre. Par exemple, comme le montre l'exemple d'illustration pour ER et HER2, les biomarqueurs communes montrent une hétérogénéité considérable d'expression et il est actuellement inconnu si cela représente un facteur pronostique indépendant ou prédictive par rapport au résultat clinique ou la réponse au traitement, respectivement. De même, comme l'illustre, la thérapie elle-même pourrait modifier dynamiquement lapopulations constituantes des cellules, et donc la mesure de l'enrichissement cible pourrait être utile pour guider les décisions thérapeutiques.
Cependant, la technique est limitée par les mêmes facteurs qui limitent traditionnelle analyses histopathologiques ou biomarqueur (comme immunohistochimiques). Le résultat est dépendant du type, la taille et la qualité du tissu en cours d'analyse, et donc une section de tissu unique peut ne pas être représentatifs de toute la tumeur. En effet, l'indice de Simpson peut être indûment biaisées par la taille du tissu (nombre d'images capturées et les scores mesurés AQUA). L'immunogénicité des épitopes mesurée peut être soumis à incontrôlables pré-analytique des facteurs qui modifient leur artifactually expression à travers la section de tissu (comme le temps d'ischémie froide, ou la longueur de la fixation, et les artéfacts de bord). Ceci est particulièrement un problème pour les phospho-épitopes, qui sont notoirement instable 14, 15. Par conséquent, la technique pourrait être mieux adaptéeaux pièces d'exérèse plutôt petites biopsies, et effectué sur plusieurs sections plutôt qu'un seul. Finalement, les techniques d'imagerie 3D peut offrir une occasion de mieux quantifier ce paramètre.
La technique présentée peut également être limitée par des facteurs biologiques, tels que la variabilité dans l'expression de l'épitope de masquage cytokératine. Cela pourrait être une préoccupation particulière dans ces cancers, notamment de l'ovaire et le cancer du sein, qui subissent épithélio-mésenchymateuses de transition (EMT) ou sont enrichis pour les non-épithéliales des composants ou des cellules souches 16, comme cela a été démontré récemment de se produire dans la chimiothérapie cancer de l'ovaire traités in vitro, 17 ans, et chez les patients du cancer du sein dans la réponse au traitement 18. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des anticorps de masquage alternative (ou un cocktail d'anticorps), tels que la cytokératine ainsi vimentine, qui est régulée positivement dans EMT 16. En outre, depuis les autres composantes du tissu (le microroenvironment), telles que les fibroblastes ou les cellules endothéliales vasculaires sont également de plus en plus ciblé par les thérapies biologiques, la technique peut aussi être élargi pour marquer ces composants, en utilisant des masques spécifiques pour les compartiments de l'intérêt, comme PECAM / CD31 à la coloration pendant les cellules endothéliales vasculaires .
Bien que l'adaptation de l'indice de Simpson a été utilisé comme une mesure de l'hétérogénéité dans le protocole actuel en raison de sa simplicité, d'autres mesures d'hétérogénéité pourrait être utilisé, comme de simples mesures de tendance centrale (moyenne, variance, médiane, etc.) En outre, les calculs d'indice de Simpson pourrait être modifié pour mieux s'adapter à une population test particulier. L'utilisation de Z-score permet le pointage des transformations pour être plus applicable pour les marqueurs multiples depuis l'hétérogénéité est basé sur l'écart autour de la moyenne pour un ensemble de données. Cependant, la gamme globale de notation peut être limitée dans ce type de transformation. Certains modèles peuvent être mieux adaptésben tout simplement les scores AQUA réelle pour tous les échantillons d'un ensemble marqueur particulier. Le choix du nombre de bacs et de seuils est aussi une limitation dans la fourchette de valeurs qui peuvent entraîner et peuvent être optimisées pour des modèles expérimentaux alternatifs.
Nous avons utilisé ER et HER2 dans l'étude actuelle comme biomarqueurs candidats, car ils sont déjà utilisés en clinique, aider à répondre à des questions pertinentes cliniques à l'égard de l'efficacité des thérapies ciblées, et sont connus pour présenter une hétérogénéité et le changement dans l'enseignement primaire et lointain la maladie 19. Toutefois, le marqueur optimal de l'hétérogénéité reste à déterminer. D'autres possibilités pourraient inclure des marqueurs cytogénétiques de clonalité, tels que ceux utilisés précédemment dans des études FISH interphasique 20. L'approche requiert une validation plus poussée dans les grandes, bien annotée cohortes cliniques ou essais cliniques afin de continuer à établir la pertinence de ce paramètre dans la biologie du cancer.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par le Conseil écossais de financement (subvention Nombre HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), la recherche médicale en Ecosse ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), le cancer recherche expérimentale contre le cancer au Royaume-Uni Centre de médecine ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) et Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |