여기 수량 immunofluorescence, 이미지 분석, 이질의 통계 측정을 사용하여 종양이 자료 histological 섹션에 분자 이질을 계량하는 방법을 설명합니다. 방법은 임상 biomarker 개발 및 분석에 사용하기위한 것입니다.
개별 종양 내에 Morphologic 이질은 외과 연습의 histopathologists에 의해 잘 인식됩니다. 이것은 종종 인식 histological subtypes에 뚜렷한 분화 영역의 형태로, 또는 다른 병리 학적 등급을 소요하는 동안 종종 정확한 분류 (그림 1)을 무시 표현형 더 미묘한 차이가있다. 형태가 기본 분자 표현형에 의해 결정되기 때문에 궁극적으로, 눈에 보이는 차이와 지역은 휴대 전화 기능과 동작을 조정 단백질의 표현의 차이, 따라서, 외모 동반 될 가능성이 높습니다. 예후에 대한 가시 성과 보이지 않는 (분자) 이질의 의미는 알 수 있지만, 최근의 증거는 적어도 유전자 수준에서 이질은 기본 종양의 1,2에 존재하며, 이러한 하위 클론의 일부가 전이성을 일으키다,하는 것이 좋습니다 ( 따라서 치명적인) 병.
또한, 일부 단백질은그들은 치료의 목표 (tamoxifen과 trastuzumab (Herceptin)에 대한 인스턴스 ER과 HER2, 각각에 대해) 때문에 생체로 측정. 이 단백질은 종양 내에서 변수 표현을 보여주면 치료 반응도 변수가있을 수 있습니다. immunohistochemistry을 위해 널리 사용되는 histopathologic 점수 제도도 무시, 또는 숫자 단백질 표현의 부량을 homogenize. 마찬가지로, 종양 샘플 (예 : 유전자 발현 프로 파일링 등) 균질 아르 파괴적인 기술에, 양적 정보 elucidated 수 있지만 공간 정보가 손실됩니다. 췌장암의 유전자 이질 매핑 접근 방식은 단일 세포 현탁액 3 세대에 의존하거나, 또는 macrodissection 4에있다. 최근 연구는 형태학 및 분자 매핑이 가능합니다 그 원리의 증거를 제공하고, 전립선 암 조직 5 morphologic와 분자 이질을지도하기 위해 양자 도트를 사용하지만, s를 떨어지고있다이질을 quantifying의 hort. immunohistochemistry이 있기 때문에, 최고만이 세미 양적 및 내부 및 간 관찰자 바이어스, 더 민감하고 정량 방법에 따라 정확하게 현장에서 조직 이질을지도와 수치하기 위해 필요합니다.
우리는 체계적으로 자동 정량 분석 (아쿠아) 시스템을 기반으로 6 종양 전체 조직 섹션에 단백질 표현의 이질을 계량하기 위해 개발하고 실험 및 통계 방법을 적용했습니다. 조직 섹션은 형광단 – 레이블 차 항체에 결합 cytokeratins와 관심 대상에 대한 감독 특정 항체와 표시하고 있습니다. 슬라이드는 슬라이드 전체를 형광 스캐너를 사용하여 몇 군데 있습니다. 이미지는 타일 수천 수백으로 세분화하고, 각 타일은 다음 조직의 상피 (종양) 구성 요소 내의 단백질 농도 측정하기위한 한 방법입니다 아쿠아 점수를 할당됩니다. Heatmaps은 심슨의 생물 다양성 지수 7을 기반으로 원래 생태학에서 사용되는 이질의 통계 측정을 사용하여, 단백질 및 할당 이질 점수의 조직 표현을 나타내기 위해 생성됩니다.
현재까지 histological 준비에 체계적으로 단백질 표정으로 나란히이 다양성을지도와 수치 아무런 시도를 한번도 가본 적이있다. 여기서 우리는 ER과 난소암에서 HER2 biomarker의 표현에 적용 방법의 첫 번째 사용을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 예후와 치료에 대한 반응의 예측에 이질의 중요성을 확립하기 위해, translational 연구 biomarker의 표현의 연구에서 독립 변수로 이질을 분석하는 방법을 불법 체류자.
방법은 여기에 종양 물질의 표준 포르말린 – 고정, 파라핀 – 임베디드 histologic 섹션에 분자 이질의 허가를 부량을 설명했다. 방법은 이것이 다음 biomarker 개발과 분석 변수로 고려 수 있도록 조직 섹션에 이질의 정도에 할당할 값을 수 있습니다. 일반적으로 그것이 조직의 생체는 분석이 샘플링 오류 또는 바이어스 적은 쉽습니다 있도록 표현과 관련하여 균질되는 것이 바람직하지만, 그것은 어떤 상황에서 매개 변수로 이질을 계량하는 것이 유용 하리라 생각됩니다. 예를 들어, 같은 ER과 HER2에 대한 설명의 예제와 같이, 일반적인 생체은 표현의 상당한 이질을 표시하고이 임상 결과를 또는 치료에 대한 응답에 대하여 독립적인 전조 또는 예측 요소 각각을 대표하는 여부를 현재 알 수있다. 마찬가지로, 그림과 같이, 치료 자체가 동적을 변경 수대상 농축의 구성 세포의 인구, 따라서 측정은 치료 결정을 유도에 유용하게 사용될 수 있습니다.
그러나, 기술은 전통적인 (예 : immunohistochemical 등) histopathological 또는 biomarker 분석을 제한 같은 요인에 의해 제한됩니다. 결과 유형, 크기 및 분석되는 조직의 품질, 따라서 하나의 조직 섹션에 의존하면 전체 종양의 대표되지 않을 수 있습니다. 사실, 심슨의 인덱스는 신체 조직의 크기 (캡처 및 아쿠아 점수가 측정 프레임 번호)에 의해 편향된 수 있습니다. 측정되는 epitopes의 immunogenicity는 artifactually 조직 부분 (예 : 감기 국소 빈혈 시간, 또는 고정 길이, 그리고 가장자리 유물 등)에 걸쳐 자신의 표현을 변경 지나치게 사전 분석 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이것은 특히 악명 불안 정한 14, 15아르 phospho – epitopes에 대한 문제입니다. 따라서 기술은 더 적합 수도 있습니다절제술의 표본보다는 작은 biopsies하고, 오히려 하나 이상의 여러 섹션에서 수행. 궁극적으로, 3D 영상 기술은 더이 매개 변수를 정할 수있는 기회를 제공할 수 있습니다.
로 제시 기술은 또한 cytokeratin 마스킹 에피토프 표현의 다양성 등 생물 학적 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 이것은 난소와 상피 – 투 – mesenchymal 전환 (EMT)을 받아야하거나 비 상피 구성 요소 또는 줄기 세포 16 풍부 아르 유방암을 포함하여, 그 암 특히 우려로 최근에 발생하는 표시되었습니다 수도 화학 요법 – 체외 17과 치료 18에 대한 응답으로 유방암 환자의 난소 암 치료. 이 제한은 이러한 구급대 16 upregulated 있습니다 cytokeratin 플러스 vimentin로 대체 마스킹 항체 (또는 항체의 칵테일)를 사용하여 극복할 수 있습니다. 또한, 조직의 다른 부품 (마이크 이후이러한 섬유아 세포 또는 혈관 내피 세포로 roenvironment)가도 점점 생물 학적 치료의 대상이되고, 기술은 또한 혈관 내피 세포 얼룩 이러한 PECAM / CD31와 같은 관심의 구획에 대한 구체적인 마스크를 사용하여 이러한 구성 요소를 점수로 확대 수 있습니다 .
심슨의 색인의 적응이 간단하기 때문에 현재의 프로토콜 이질의 척도로 사용되고 있지만, 이질의 다른 조치 (분산, 평균 등 평균) 등 중앙 경향의 간단한 측정으로 사용할 수 있습니다. 또한, 심슨의 인덱스 계산은 더 특정 테스트 인구에 맞게 수정할 수 있습니다. Z – 점수 변환의 사용은 이질이 데이터 집합에 대한 평균 주위 편차에 기반이기 때문에 채점 여러 마커에 대한 더 적용할 수 있습니다. 그러나, 점수의 전체 범위는 변환이 유형 제한될 수 있습니다. 일부 디자인은 더 나은 적합있을 수 있습니다단순히 특정 마커 세트의 모든 샘플에 대한 실제 아쿠아 점수를 빈 수 있습니다. 방식과 cutoffs의 수를 선택도 발생할 수 있습니다 값의 범위에서 제한하고 대체 실험 디자인에 최적화된 수 있습니다.
우리는 그들이 이미 병원에서 사용되기 때문에, 후보 생체로 현재의 연구에 응급실 및 HER2를 사용하여 타겟 요법의 효능과 관련하여 관련 임상 문제에 대한 해답을 얻을 수 있도록하고, 상당한 이질 변화를 전시한다고 알려져 있습니다이 기본 및 먼 19 질병. 그러나, 이질 최적의 마커가 결정 남아 있습니다. 다른 가능성은 이전에 계면 생선 연구 20에서 사용되는 것과 clonality의 cytogenetic 마커를 포함할 수 있습니다. 접근 방식은 더 이상 암 생물학이 매개 변수의 관련성을 확립하기 위해 크고 잘 주석 임상 동료 또는 임상 실험에서 추가 유효성 검사를 필요로합니다.
The authors have nothing to disclose.
,이 작품은 스코틀랜드 기금위원회 (부여 번호 HR07005에 의해 부분적으로 지원되었다 http://www.sfc.ac.uk/ , 의료 연구 스코틀랜드 () http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), 암 연구 영국의 실험 의학 암 센터 ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), 그리고 혁신적인 유방암 ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |