在这里,我们描述了一种方法来量化分子异质性肿瘤的材料组织部分采用定量免疫荧光图像分析,和一个异质性的统计措施。该方法用于临床生物标志物的开发和分析。
在个别肿瘤的形态学异质性,在外科实习histopathologists公认。虽然这往往需要形成鲜明的差异化领域,为公认的组织学亚型或不同的病理分级,往往存在表型更细微的差别,无法准确的分类(图1)。最终,由于形态是由潜在的分子表型决定的,明显的差别的地区可能会在协调细胞的功能和行为的蛋白表达的差异,因此,外观陪同。有形及无形(分子)预后的异质性的意义是未知的,但最近的证据表明,至少在基因水平,异质性的存在在原发肿瘤1,2,和一些这些子克隆引起转移性(因此致命)的疾病。
此外,一些蛋白质作为生物标志物的测量,因为它们是治疗的目标(例如ER和HER2的他莫昔芬和曲妥珠单抗(赫赛汀),分别)。如果这些蛋白质显示变量的表达式,然后在肿瘤治疗的反应也可能是变量。广泛用于免疫组化病理组织学评分计划,要么忽略,或数字均质蛋白表达的定量。同样,在破坏性的技术,均质肿瘤样本(如基因表达分析),定量信息可以澄清,但空间信息丢失。胰腺癌的遗传异质性的映射方法都依赖一个单细胞悬液 3代,或macrodissection 4 。最近的一项研究量子点,以图在前列腺癌组织5中的形态学和分子异质性,提供证据原则,形态学和分子映射是可行的,但下降小号园艺量化的异质性。由于免疫组化,充其量只是半定量和内和观察者间的偏见,更敏感和定量方法是需要以准确的地图和量化组织在原地的异质性。
我们已经开发和应用实验和统计方法,以系统量化的基础上的自动定量分析系统(水族)6,在整个肿瘤组织切片中的蛋白表达的异质性。组织切片是针对角蛋白和利益目标的特异性抗体,再加荧光标记的二抗标记。使用整个幻灯片的荧光扫描仪成像幻灯片。图片分为几百到成千上万的瓷砖,每个tile,然后分配一个AQUA的得分,这是一种蛋白浓度的措施,组织内的上皮细胞(肿瘤)组件。 HEAtmaps产生代表组织表达的蛋白质和分配异质性得分,使用的统计异质性措施最初用于在生态学,基于辛普森多样性指数7。
到目前为止,一直没有尝试系统地图和量化这种变化与蛋白表达的同时,在组织学的准备。在这里,我们首先使用说明ER和HER2基因在卵巢癌的生物标志物表达方法。使用这种方法铺平了道路,分析异质性翻译研究的生物标志物表达的研究作为一个独立的变量的方式,以建立异质性的预后和对治疗的反应预测的意义。
本网站所描述的方法允许量化标准福尔马林固定,石蜡包埋肿瘤材料的组织切片的分子异质性。该方法允许一个被分配到的异质性程度在组织部分,所以这可能是考虑到在生物标志物的开发和分析的变量的值。虽然在一般情况下最好是组织的生物标志物来表达,都是同质化,使检测不容易受到抽样误差或偏见,在某些情况下,它可能是有用的量化参数的异质性。例如,在ER和HER2的例证表明,常见的生物标志物显示相当大的异质性表达,目前尚不清楚这是否代表一个独立的预后预测因子与临床结果或对治疗的反应,分别。同样,作为说明,治疗本身可能动态改变细胞组成的人群,因此,测量目标富集可能是有用的指导治疗决定。
然而,技术的限制传统的病理组织学或生物标志物(如免疫组化)分析同样的因素是有限的。结果是依赖于分析组织的类型,大小和质量,并因此,一个单一的组织部分,可能无法代表整个肿瘤。事实上,Simpson指数可能过分偏袒组织的大小(帧捕获和测量AQUA的分数)。被测量表位的免疫原性,可能会受到无法控制的分析前因素artifactually改变整个组织切片(如冷缺血时间,或固定的长度,和边缘神器)的表达。这是特别为磷酸化表位,这是出了名的不稳定14,15的问题。因此,该技术可能更适合切除标本,而不是小的活组织切片检查,以及对多个部分而不仅仅是一个进行。最终,三维成像技术,可以提供一个机会,以更好地量化这个参数。
所提交的技术也可能是由生物因素,如变性的角蛋白掩蔽抗原表位的表达,有限的。特别关注,这可能是这些癌症,包括卵巢癌和乳腺癌,接受上皮间质转化(EMT),或丰富的非上皮成分或干细胞16,最近被证明在发生化疗在体外培养 17和乳腺癌患者在治疗18的治疗卵巢癌。使用替代掩蔽抗体(或抗体鸡尾酒),如角蛋白加波形,这是在EMT 的 16上调,可以克服这个限制。此外,由于该组织的其他组件(麦克风roenvironment),如成纤维细胞或血管内皮细胞也越来越多地被生物疗法的目标,该技术可能也将扩大到得分这些组件,使用车厢的利益,如PECAM / CD31,血管内皮细胞染色具体口罩。
虽然已适应Simpson指数作为衡量异质性,在目前的协议由于其简单,可用于异质性的其他措施,如简单的测量集中趋势,(平均值,方差,中位数,等)。此外,Simpson指数计算可以修改,以更好地满足特定的测试人群。允许使用的Z – score模型转换的得分,以更适用多个标记,由于异质性是围绕一个数据集的平均值的偏差的基础上。然而,整体得分范围可以限制在这种类型的转换。有些设计可能更适合简单bin中的一个特定的标记集所有样品的实际AQUA的分数。箱和截止的选择也是一个范围值,这可能会导致的限制,可用于替代实验设计优化。
我们使用ER和HER2在目前的候选生物标志物研究,因为它们已经在临床上使用,帮助回答与靶向治疗的疗效有关的临床问题,并表现出相当大的异质性和变化,在小学和遥远疾病19。然而,异质性的最佳指标仍有待确定。其他的可能性包括克隆的细胞遗传学标记,如以前在间期FISH 研究 20 。这种方法需要在大,以及注明的临床同伙或临床试验的进一步验证,以进一步建立此参数在癌症生物学相关。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的,一部分由苏 格兰拨款委员会(项目编号HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ),医学研究苏格兰( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ),癌症英国的实验研究癌症医学中心( http://www.cancerresearchuk.org/ ),并突破乳腺癌( http://breakthrough.org.uk/ )。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |