Här beskriver vi en metod för att kvantifiera molekylära heterogenitet i histologiska avsnitt av tumörvävnad med hjälp av kvantitativa immunofluorescens, bildanalys och ett statistiskt mått av heterogenitet. Metoden är avsedd för användning i kliniska biomarkörer utveckling och analys.
Morfologiska heterogenitet inom en enskild tumör är väl erkänd av histopathologists vid kirurgiska praktiken. Även om detta ofta sker i form av områden med tydliga differentiering till erkänd histologiska subtyper, eller olika patologiska klass, ofta finns det mer subtila skillnader i fenotyp som trotsar korrekt klassificering (figur 1). I slutändan, eftersom morfologi dikteras av den underliggande molekylära fenotyp, områden med synliga skillnader kommer sannolikt att åtföljas av skillnader i uttrycket av proteiner som orkestrera cellulär funktion och beteende, och därför utseende. Betydelsen av synliga och osynliga (molekylära) heterogenitet för prognosen är okänd, men senare tyder på att, åtminstone på genetisk nivå, finns heterogenitet i den primära tumören 1,2, och några av dessa sub-kloner ge upphov till metastaser ( och därför dödlig) sjukdom.
Dessutom är vissa proteinermätt som biomarkörer för att de är målen för terapi (t.ex. ER-och HER2 för tamoxifen och trastuzumab (Herceptin), respektive). Om dessa proteiner visa rörliga uttryck inom en tumör då terapeutisk Åtgärderna kan också variera. Den utbredda histopatologiska scoring system för immunohistokemi ignorera heller, eller numeriskt homogenisera kvantifiering av proteinuttryck. Även i destruktiva metoder, där tumören proverna homogeniseras (såsom profilering av genuttryck), kan kvantitativ information belysas, men geografisk information går förlorad. Genetisk heterogenitet kartläggning metoder i pankreascancer har förlitat sig antingen på generering av en enda cellsuspensionen 3, eller på macrodissection 4. En färsk studie har använt kvantprickar för att kartlägga morfologiska och molekylära heterogenitet i prostatacancer vävnad 5, som ger bevis på principen att morfologi och molekylära kartläggning är genomförbart, men faller sHort kvantifiera heterogenitet. Eftersom immunohistokemi är i bästa fall bara är semi-kvantitativa och föremål för intra-och inter-observatör bias, känsligare och kvantitativa metoder krävs för att exakt kartlägga och kvantifiera vävnad heterogenitet på plats.
Vi har utvecklat och tillämpat en experimentella och statistiska metoder för att systematiskt kvantifiera heterogenitet proteinuttryck i hela vävnadssnitt av tumörer, baserat på Automated kvantitativ analys (Aqua) System 6. Vävnadssnitt är märkta med specifika antikroppar riktade mot cytokeratins och mål av intresse, kopplad till fluoroforen-märkta sekundära antikroppar. Diabilder är avbildas med en hel-bild fluorescens skanner. Bilderna är uppdelade i hundratals till tusentals kakel, och varje kakel tilldelas sedan en AQUA poäng vilket är ett mått av protein koncentration inom epitelceller (tumör) del av vävnaden. Heatmaps genereras för att representera vävnad uttryck av proteiner och en heterogenitet poäng tilldelas, med hjälp av ett statistiskt mått av heterogenitet som ursprungligen användes i ekologi, baserat på Simpsons index för biologisk mångfald 7.
Hittills har inga försök att systematiskt kartlägga och kvantifiera detta variabilitet i takt med protein uttryck i histologiska preparat. Här illustrerar vi den första användningen av metoden tillämpas på ER och HER2 biomarkör uttryck i äggstockscancer. Med denna metod banar väg för analys av heterogenitet som en oberoende variabel i studier av biomarkör uttryck inom den överbryggande studier för att fastställa betydelsen av heterogenitet i prognos och prediktion av respons på behandlingen.
Metoden beskrivs här tillåter kvantifiering av molekylära heterogenitet i standard formalinfixerade, paraffininbäddade histologisk delar av tumörvävnad. Metoden medger ett värde som ska tilldelas graden av heterogenitet i en vävnad avsnitt, så att denna sedan kan beaktas som en variabel i biomarkör utveckling och analys. I allmänhet är det bättre att vävnaden biomarkörer är homogena med avseende på uttryck, så att analysen är mindre känslig för urvalsfel eller partiskhet, kan det under vissa omständigheter vara användbart att kvantifiera heterogenitet som en parameter. Till exempel som visas i belysande exempel för ER och HER2, gemensamma biomarkörer uppvisar betydande heterogenitet uttryck och det är för närvarande okänt om detta är en oberoende prognostisk eller prediktiv faktor med avseende på kliniska resultat eller svar på terapi, respektive. På samma sätt som bilden visar, kan terapi sig ändra dynamisktkonstituerande populationer av celler, och därmed mätning av målet anrikning kan vara användbara i att vägleda behandlingen beslut.
Dock är den teknik begränsas av samma faktorer som begränsar traditionella histopatologiska eller biomarkör (t.ex. immunhistokemiska) analyser. Resultatet är beroende på typ, storlek och kvaliteten på vävnaden som analyseras, och därför en enda vävnad paragraf får inte vara representativ för hela tumören. I själva verket kan Simpsons index i onödan påverkade av storleken på vävnad (antal bilder fångade och Aqua poäng uppmätts). Immunogenicitet av epitoper som mäts kan vara föremål för okontrollerbar pre-analytiska faktorer som artifactually förändrar sitt uttryck över vävnaden avsnittet (som kall ischemi tid, eller längden till upptagning, och kant artefakt). Detta är särskilt ett problem för fosfor-epitoper, som är notoriskt instabilt 14, 15. Därför tekniken kan vara bättre lämpadetill resektion exemplar snarare än små biopsier, och utförs på flera avsnitt i stället för bara en. Ytterst kan 3D avbildningstekniker ger en möjlighet att bättre kvantifiera denna parameter.
Tekniken som presenteras kan också begränsas av biologiska faktorer, såsom variation i uttryck av Cytokeratin maskering epitop. Detta kan vara särskilt angeläget i dessa cancerformer, bland annat äggstockscancer och bröstcancer, som genomgår epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) eller anrikas för icke-epitelceller komponenter eller stamceller 16, vilket nyligen visats förekomma vid kemoterapi- behandlad äggstockscancer in vitro-17 och i bröstcancer patienter med svar på behandlingen 18. Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av alternativa maskering antikroppar (eller cocktails av antikroppar), som Cytokeratin plus vimentin, som uppregleras i EMT 16. Dessutom, eftersom andra delar av vävnad (MICroenvironment), såsom fibroblaster eller vaskulär endotelcellerna också allt oftare måltavla för biologiska behandlingsmetoder, kan tekniken också utvidgas till att göra mål dessa komponenter med specifika masker för fack intresse, såsom PECAM / CD31 att färga för vaskulära endotelceller .
Även anpassning av Simpsons index har använts som ett mått på heterogenitet i det nuvarande protokollet på grund av dess enkelhet, skulle andra åtgärder av heterogenitet användas, såsom enkla mätningar av central tendens (medelvärde, varians, median, etc). Dessutom kunde Simpsons indexberäkningen modifieras för att bättre passa ett visst test befolkning. Användningen av Z-score transformationer ger poäng att vara mer tillämpliga för flera markörer eftersom heterogenitet är baserad på avvikelser kring medelvärdet för en datamängd. Däremot kan den totala sortimentet av scoring vara begränsat i denna typ av omvandling. Vissa konstruktioner kan vara bättre lämpadeatt helt enkelt bin själva AQUA poäng för alla prover av en viss markör set. Valet av antal lådor och cutoffs är också en begränsning i de värden som kan orsaka och kan optimeras för alternativa experimentell design.
Vi har använt ER och HER2 i den aktuella studien som kandidat biomarkörer, eftersom de redan används i kliniken, hjälpa till att besvara relevanta kliniska frågeställningar med avseende på effektiviteten av riktade behandlingar, och är kända för att uppvisa betydande olikheter och förändring i grundskolan och fjärran sjukdom 19. Dock fortfarande den optimala markör för heterogenitet som skall fastställas. Andra möjligheter kan omfatta cytogenetisk markörer för clonality, såsom de som tidigare använts i interfas FISH studier 20. Den metod som kräver ytterligare validering i stora, väl kommenterad kliniska kohorter eller kliniska prövningar i syfte att ytterligare fastställa relevansen av denna parameter i cancer biologi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av den skotska Funding Council (licensnummer HR07005, http://www.sfc.ac.uk/ ), Medical Research Skottland ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), Cancerföreningen Forskning Storbritannien Experimentell cancermedicin Centre ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) och Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |