כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.
ההטרוגניות מורפולוגיים בתוך הגידול הפרט היא מוכרת היטב על ידי histopathologists בפועל כירורגית. אמנם זה לוקח בדרך כלל צורה של אזורים של בידול מובהק לתוך תת היסטולוגית מוכר, או כיתה פתולוגיים שונים, לעתים קרובות ישנם הבדלים דקים יותר פנוטיפ אשר להתריס סיווג מדויק (איור 1). בסופו של דבר, מאז מורפולוגיה מוכתב על ידי פנוטיפ המולקולרית הבסיסית, אזורים עם הבדלים נראים צפויים להיות מלווה ההבדלים בביטוי של חלבונים אשר לתזמר פונקציה התנהגות הסלולר, ולכן המראה. המשמעות של ההטרוגניות (מולקולרית) נראים ובלתי נראים על הפרוגנוזה אינו ידוע, אך הראיות האחרונות עולה כי, לפחות ברמה הגנטית, קיימת הטרוגניות 1,2 הגידול הראשוני, וכמה אלה משנה שיבוטים להצמיח גרורתי ( וקטלני לכן) המחלה.
יתר על כן, חלבונים מסוימיםכפי שנמדד על סמנים כי הם מטרות הטיפול (למשל עבור ER ו HER2 עבור טמוקסיפן ו trastuzumab (הרצפטין), בהתאמה). אם חלבונים אלו מראים ביטוי משתנה בתוך הגידול אז התגובות טיפולית יכול להיות גם משתנה. תוכניות בשימוש נרחב הבקיע היסטופתולוגיות עבור אימונוהיסטוכימיה או להתעלם, או מספרית homogenize כימות של ביטוי חלבונים. באופן דומה, טכניקות הרסניות, שבו דגימות הגידול הם הומוגני (כגון פרופיל ביטוי גנים), מידע כמותי ניתן הובהר, אך מידע מרחבי אבוד. מיפוי גנטי ההטרוגניות גישות בסרטן הלבלב יש לסמוך גם על דור של השעיה תא בודד 3, או 4 macrodissection. מחקר שנערך לאחרונה השתמשה נקודות קוונטיות כדי למפות ההטרוגניות מורפולוגיים מולקולרית ברקמת סרטן הערמונית 5, לספק הוכחה של עקרון זה מיפוי מורפולוגיה מולקולרית אינו ריאלי, אבל נפילה שלhort של לכימות ההטרוגניות. מאז אימונוהיסטוכימיה הוא, במקרה הטוב, רק חצי כמותית ובכפוף ההטיה התוך והבין הצופה, יותר רגישים ו – מתודולוגיות כמותיות נדרשים על מנת למפות במדויק ולכמת ההטרוגניות רקמות באתרם.
פיתחנו מתודולוגיה ויושמו ניסויים סטטיסטיים על מנת לכמת את ההטרוגניות באופן שיטתי ביטוי חלבון בסעיפים רקמה שלמה של גידולים, בהתבסס על ניתוח כמותי אוטומטי (AQUA) מערכת 6. סעיפים רקמות מסומנים עם נוגדנים ספציפיים כנגד cytokeratins ויעדים של עניין, מצמידים את fluorophore שכותרתו נוגדנים משני. שקופיות הם צילמו באמצעות סורק כל שקופית פלואורסצנטי. תמונות מחולקים מאות עד אלפי אריחים, וכל אריח מוקצה אז ציון AQUA שהיא מדד של ריכוז חלבון בתוך הרכיב (גידולים) של רקמת האפיתל. Heatmaps נוצרות לייצג ביטוי רקמות של חלבונים ציון ההטרוגניות מוקצה, באמצעות מדד סטטיסטי של ההטרוגניות ששימשו במקור אקולוגיה, בהתבסס על מדד סימפסון המגוון הביולוגי 7.
עד כה לא היו ניסיונות שיטתי למפות ולכמת את השתנות בד בבד עם ביטוי חלבון, בהכנות היסטולוגית. כאן, אנו ממחישים את השימוש הראשון בשיטה להחיל ER ו HER2 ביטוי סמן ביולוגי בסרטן השחלות. באמצעות שיטה זו סוללת את הדרך לניתוח ההטרוגניות כמשתנה בלתי תלוי מחקרים הביטוי סמן במחקרים translational, כדי להקים את המשמעות של ההטרוגניות על הפרוגנוזה וחיזוי התגובות לטיפול.
השיטה המתוארת להלן היתרי כימות הטרוגניות מולקולרית ברמת פורמלין-קבוע, פרפין, משובצים קטעים היסטולוגית של חומר הגידול. השיטה מאפשרת הערך יוקצו מידת ההטרוגניות בקטע הרקמה, כך זה עשוי אז להילקח בחשבון כמשתנה בפיתוח סמן ביולוגי וניתוח. אמנם באופן כללי עדיף כי הם סמנים רקמה הומוגנית מבחינת הביטוי, כך assay הוא פחות רגישים טעות הדגימה או משוא פנים, זה עלול בנסיבות מסוימות להיות שימושי לכמת ההטרוגניות כפרמטר. לדוגמה, כפי שמוצג בדוגמה המחשה של ER ו – HER2, סמנים נפוצים להראות הטרוגניות רבה ביטוי זה כרגע לא ידוע אם זה מהווה גורם מנבא עצמאי או חזוי לגבי התוצאה הקלינית או התגובה לטיפול, בהתאמה. כמו כן, כפי שמודגם, הטיפול עצמו עלול לשנות באופן דינמיאוכלוסיות המרכיבים של תאים, ולכן מדידה של העשרה היעד עשוי להיות שימושי המנחה החלטות הטיפול.
עם זאת, הטכניקה היא מוגבלת על ידי אותם גורמים אשר מגבילים מנתח histopathological או סמנים ביולוגיים (כגון immunohistochemical) המסורתית. התוצאה היא תלויה בסוג, גודל, איכות של הרקמה להיות מנותח, ולכן קטע רקמה יחיד לא יכול להיות נציג של הגידול כולו. ואכן, המדד סימפסון עשוי להיות מוטה יתר על המידה על ידי גודל של הרקמה (מספר מסגרות בשבי עשרות AQUA נמדד). Immunogenicity של epitopes הנמדדים עשויים להיות כפופים טרום ניתוח גורמים בלתי נשלט אשר artifactually לשנות את הביטוי שלהם על פני קטע הרקמה (כגון זמן איסכמיה קר, או את האורך של קיבעון, ו חפץ קצה). זוהי בעיה במיוחד עבור-epitopes phospho, אשר ידוע לשמצה יציב 14, 15. לכן הטכניקה עשוי להיות מתאים יותרעל דגימות ביופסיה כריתה ולא קטן, שבוצעו על מספר מקטעים ולא רק אחד. בסופו של דבר, 3D שיטות הדמיה עשויות להציע הזדמנות טובה יותר לכמת בפרמטר זה.
הטכניקה כפי שהוצגה עשוי להיות מוגבל על ידי גורמים ביולוגיים, כגון השתנות בביטוי של epitope מיסוך cytokeratin. זה עלול להיות מדאיג במיוחד בסוגי סרטן אלה, כולל סרטן השחלות וסרטן השד, אשר עוברים אפיתל ל-mesenchymal המעבר (EMT) או מועשרים שאינם אפיתל רכיבים או בתאי גזע 16, כמו לאחרונה הוכח להתרחש כימותרפיה טיפול בסרטן השחלות ב 17 במבחנה, ועל חולי סרטן השד בעקבות טיפול 18. מגבלה זו ניתן להתגבר באמצעות נוגדנים מיסוך חלופה (או קוקטיילים של נוגדנים), כגון cytokeratin פלוס vimentin, אשר שהוגברו ב EMT 16. בנוסף, מאז רכיבים אחרים של הרקמה (את המיקרופוןroenvironment), כגון fibroblasts או בתאי האנדותל בכלי הדם הם גם יותר ויותר ממוקדים על ידי טיפולים ביולוגיים, הטכניקה עשויה גם להיות מורחבת כדי להבקיע רכיבים אלה, באמצעות מסכות ספציפיות תאים של עניין, כגון PECAM / CD31 להכתים עבור לתאי אנדותל של כלי הדם .
למרות העיבוד של מדד סימפסון שימש כמדד ההטרוגניות בפרוטוקול הנוכחי בשל פשטותה, אמצעים אחרים של ההטרוגניות יכול לשמש, כגון מדידות פשוטה של נטייה מרכזית (ממוצע, חציון השונות, וכו '). בנוסף, חישובי מדד סימפסון יכול להיות שונה כדי להתאים טוב יותר אוכלוסייה מבחן בפרט. השימוש Z-ציון טרנספורמציות מאפשר הניקוד יהיה רלוונטי יותר עבור מספר רב של סמנים מאז ההטרוגניות מבוסס על סטיית סביב הממוצע עבור ערכת נתונים. עם זאת, בטווח הכולל של מניה יכולה להיות מוגבלת בסוג זה של טרנספורמציה. עיצובים מסוימים עשויים להיות מתאימים יותרפשוט בן עשרות AQUA בפועל עבור כל דגימות של קבוצה סמן מסוים. בחירת מספר פחי הפסקות גם הגבלה בטווח של ערכים אשר עלולה לגרום ועלול להיות מותאם עיצובים ניסיוניים חלופיים.
השתמשנו ER ו HER2 במחקר הנוכחי כמו סמנים מועמד, כיוון שהם משמשים כבר במרפאה, לעזור לענות על שאלות קליניות רלוונטי לגבי היעילות של טיפולים ממוקדים, ידועים להפגין ההטרוגניות שינוי ניכר והן הראשוני רחוק המחלה 19. עם זאת, סמן אופטימלי של ההטרוגניות נותר נחוש. אפשרויות אחרות עשויות לכלול סמנים cytogenetic של clonality, כגון אלו המשמשים בעבר במחקרים FISH שלבי הביניים 20. הגישה דורשת אימות נוסף, קבוצות גדולות קליניים המבואר טוב או ניסויים קליניים על מנת להמשיך ולבסס את הרלוונטיות של פרמטר זה בביולוגיה של הסרטן.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון המועצה הסקוטית (מספר גרנט HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), למחקר רפואי סקוטלנד ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), הסרטן מחקר בבריטניה Experimental Medicine מרכז הסרטן ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), וכן סרטן השד פריצת דרך ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |