Her vil vi beskrive en metode for å kvantifisere molekylær heterogenitet i histologiske deler av tumor materiale ved bruk av kvantitative immunfluorescens, bildeanalyse, og et statistisk mål på heterogenitet. Metoden er beregnet for bruk i klinisk utvikling av biomarkører og analyse.
Morfologiske heterogenitet innenfor den enkelte tumor er godt anerkjent av histopathologists i kirurgisk praksis. Selv om dette ofte tar form av områdene distinkte differensiering inn i anerkjente histologiske subtyper, eller forskjellige patologisk karakter, ofte er det mer subtile forskjeller i fenotype som trosser nøyaktig klassifisering (Figur 1). Til syvende og sist, da morfologi er diktert av den underliggende molekylære fenotypen, områder med synlige forskjeller vil trolig være ledsaget av forskjeller i uttrykket av proteiner som orkestrere cellular funksjon og adferd, og derfor utseende. Betydningen av synlig og usynlig (molekylær) heterogenitet for prognosen er ukjent, men nyere bevis tyder på at, i hvert fall på genetisk nivå, eksisterer heterogenitet i primærtumor 1,2, og noen av disse sub-kloner gi opphav til metastatisk ( og derfor dødelig) sykdom.
Dessuten, noen proteiner ermålt som biomarkører fordi de er utsatt for terapi (for eksempel ER og HER2 for tamoksifen og trastuzumab (Herceptin), henholdsvis). Dersom disse proteinene viser varierende uttrykk innenfor en svulst så terapeutisk respons kan også være variabel. Den brukte histopatologiske scoring ordninger for immunhistokjemi verken ignorere eller numerisk homogenisere kvantifisering av protein uttrykk. Tilsvarende, i destruktive teknikker, hvor svulsten prøvene homogenisert (som genekspresjon profilering), kan kvantitativ informasjon bli belyst, men romlig informasjon går tapt. Genetisk heterogenitet kartlegging tilnærminger i bukspyttkjertelkreft har stolt enten på generasjon av en enkelt celle suspensjon 3, eller på macrodissection fire. En fersk studie har brukt kvanteprikker for å kartlegge morfologisk og molekylært heterogenitet i prostata cancer vev 5, som gir bevis for prinsippet om at morfologi og molekylære kartleggingen er mulig, men faller erhort av kvantifisere heterogeniteten. Siden immunhistokjemi er i beste fall er bare semi-kvantitative og underlagt intra-og inter-observatør bias, mer følsom og kvantitative metoder som kreves for å nøyaktig kartlegge og kvantifisere vev heterogenitet in situ.
Vi har utviklet og anvendt en eksperimentell og statistisk metode for å systematisk kvantifisere heterogenitet av protein uttrykk i hele vev deler av svulster, basert på Automated Quantitative Analysis (AQUA) system seks. Tissue seksjoner er merket med spesifikke antistoffer rettet mot cytokeratins og mål av interesse, koblet til fluoroforen-merket sekundære antistoffer. Slides er avbildes ved hjelp av en hel-slide fluorescens skanner. Bildene er delt inn i hundrevis til tusenvis av fliser, og hver flis er deretter tildelt en AQUA poengsum som er et mål av protein konsentrasjon i de epiteliale (tumor) komponent av vev. Heatmaps genereres å representere vev uttrykk av proteiner og en heterogenitet poengsum tildelt, ved hjelp av en statistisk mål på heterogenitet opprinnelig brukt i økologi, basert på Simpson biologiske mangfold index 7.
Til dags dato har det vært noen forsøk på å systematisk kartlegge og kvantifisere denne variasjonen i tandem med protein uttrykk, i histologiske preparater. Her illustrerer vi den første bruken av metoden anvendt på ER og HER2 biomarkør uttrykk i eggstokkreft. Ved hjelp av denne metoden åpner for å analysere heterogenitet som en uavhengig variabel i studier av biomarkører uttrykk i translasjonell studier, for å fastslå betydningen av heterogenitet i prognose og prediksjon av respons på behandling.
Metoden beskrevet tillater kvantifisering av molekylær heterogenitet i standard formalin-fast, parafin-embedded histologisk deler av tumor materiale. Metoden tillater en verdi som skal tildeles graden av heterogenitet i et vev delen, slik at dette kan da tas i betraktning som en variabel i utvikling av biomarkører og analyse. Mens generelt er det å foretrekke at vevet biomarkører er homogene med hensyn til uttrykk, slik at analysen er mindre mottakelig for prøvetaking feil eller bias, kan det under visse omstendigheter være nyttig å kvantifisere heterogenitet som et parameter. For eksempel, som vist i illustrerende eksempel for ER og HER2, felles biomarkører viser betydelig heterogenitet uttrykksform og det er foreløpig ukjent hvorvidt dette representerer en selvstendig prognostisk eller prediktiv faktor med hensyn til klinisk utfall eller respons på behandling, henholdsvis. Likeledes, som illustrert, kan terapi i seg selv dynamisk endrebestanddel populasjoner av celler, og derfor måling av target berikelse kan være nyttig i guiding behandling beslutninger.
Imidlertid er teknikken begrenset av de samme faktorene som begrenser tradisjonell histopatologiske eller biomarkør (som immunhistokjemisk) analyser. Resultatet er avhengig av type, størrelse og kvalitet av vev som blir analysert, og dermed en enkel vev paragraf kan ikke være representativ for hele svulsten. Faktisk kan Simpson indeks være utilbørlig partisk av størrelsen på vev (antall rammer fanget og AQUA score målt). Immunogenisiteten av epitoper som måles kan være gjenstand for ukontrollerbare preanalytiske faktorer som artifactually endre sine uttrykk på tvers av vev delen (som kald iskemi tid, eller lengden på fiksering, og kant gjenstand). Dette er spesielt et problem for fosfor-epitoper, som er notorisk 14 labile, 15. Derfor teknikken kan være bedre egnettil reseksjon prøver snarere enn små biopsier, og opptrådte på flere seksjoner i stedet for bare én. I siste instans kan 3D-imaging teknikker gi en mulighet til å bedre kvantifisere denne parameteren.
Teknikken som presenteres kan også være begrenset av biologiske faktorer som variasjon i uttrykk for cytokeratin maskering epitop. Dette kan være spesielt opptatt av i disse kreftformer, blant annet eggstokkreft og brystkreft, som gjennomgår epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) eller er beriket for ikke-epiteliale komponenter eller stamceller 16, som nylig har vist seg å forekomme i kjemoterapi- behandlet eggstokkreft i 17 vitro, og hos brystkreftpasienter i respons på behandling 18. Denne begrensningen kan løses ved hjelp av alternative maskering antistoffer (eller cocktails av antistoffer), som cytokeratin pluss vimentin, som er oppregulert i EMT 16. I tillegg, siden andre komponenter i vevet (den microenvironment), som fibroblaster eller vaskulære endotelceller er også i økende grad angrepet av biologisk terapi, kan teknikken også utvides til å score disse komponentene, med bestemte masker for avdelinger av interesse, for eksempel PECAM / CD31 å farge for vaskulære endotelceller .
Selv om tilpasning av Simpson-indeksen har vært brukt som et mål av heterogenitet i gjeldende protokoll grunn av sin enkelhet, kan andre tiltak av heterogenitet brukes, slik som enkle målinger av sentraltendens (gjennomsnitt, varians, median, etc). I tillegg kunne Simpson indeks beregninger bli endret for bedre å passe til en bestemt test befolkning. Bruk av Z-score transformasjoner lar scoring å være mer aktuelt for flere markører siden heterogeniteten er basert på avvik rundt gjennomsnittet for et datasett. Imidlertid kan den totale spekter av scoring være begrenset i denne type transformasjon. Noen design kan være bedre egnetå bare bin selve AQUA score for alle prøver av en bestemt markør sett. Valget av antallet spannene og tidsavgrensninger er også en begrensning i verdiområde som kan føre til, og kan være optimalisert for alternative eksperimentelle design.
Vi har brukt ER og HER2 i den aktuelle studien som kandidat biomarkører, siden de er allerede brukt i klinikken, få svar på relevante kliniske spørsmål med hensyn til effekten av målrettet terapi, og er kjent for å vise betydelig heterogenitet og endring i grunnskolen og fjernt sykdom 19. Imidlertid fortsatt optimal markør av heterogenitet skal fastsettes. Andre muligheter kan omfatte cytogenetisk markører for clonality, slik som de tidligere har brukt i interfase FISH studier 20. Tilnærmingen krever videre validering i store, godt kommenterte kliniske kohorter eller kliniske studier for ytterligere å fastslå relevansen av denne parameteren i kreft biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet i en del av den skotske Funding Council (Grant Number HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), Medical Research Skottland ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), Kreftregisteret Forskning britiske Experimental Cancer Medicine Centre ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), og gjennombrudd Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |