Aqui nós descrevemos um método para quantificar a heterogeneidade molecular em cortes histológicos de material do tumor através de imunofluorescência quantitativos, análise de imagem, e uma medida estatística de heterogeneidade. O método é destinado ao uso no desenvolvimento de biomarcadores e análises clínicas.
Heterogeneidade morfológica dentro de um tumor individual é bem reconhecido por histopathologists na prática cirúrgica. Enquanto isso muitas vezes assume a forma de áreas de diferenciação distintas em reconhecida subtipos histológicos, ou grau patológico diferentes, muitas vezes há diferenças mais sutis no fenótipo que desafiam classificação precisa (Figura 1). Em última análise, uma vez que a morfologia é ditada pelo fenótipo molecular subjacente, áreas com diferenças visíveis são susceptíveis de ser acompanhadas por diferenças na expressão de proteínas que orquestram a função celular e comportamento, e, portanto, a aparência. O significado do visível e invisível heterogeneidade (molecular) para o prognóstico é desconhecida, mas evidências recentes sugerem que, pelo menos no nível genético, a heterogeneidade existente no 1,2 tumor primário, e alguns desses clones sub-dar origem a metástases ( e, portanto, letal) da doença.
Além disso, algumas proteínas sãomedida como biomarcadores porque eles são os alvos da terapia (por exemplo, ER e HER2 para o tamoxifeno e trastuzumab (Herceptin), respectivamente). Se estas proteínas mostram expressão variável dentro de um tumor, em seguida, respostas terapêuticas também podem ser variáveis. O amplamente utilizados sistemas de pontuação histopatológico em imuno-histoquímica ou ignoram, ou numericamente homogeneizar a quantificação da expressão da proteína. Da mesma forma, em técnicas destrutivas, onde as amostras são homogeneizadas tumor (tais como perfil de expressão gênica), informação quantitativa pode ser elucidado, mas a informação espacial é perdido. Abordagens de mapeamento heterogeneidade genética no câncer pancreático confiaram tanto na geração de uma suspensão única célula 3, ou em 4 macrodissection. Um estudo recente tem utilizado os pontos quânticos, a fim de mapear a heterogeneidade morfológica e molecular em tecido de câncer de próstata 5, fornecendo prova de princípio que o mapeamento morfologia e molecular é viável, mas caindo short de quantificar a heterogeneidade. Desde imuno-histoquímica é, na melhor das hipóteses, apenas semi-quantitativa e sujeito a viés intra-e inter-observador, mais sensível e metodologias quantitativas são necessárias, a fim de mapear com precisão e quantificar a heterogeneidade do tecido in situ.
Temos desenvolvido e aplicado uma metodologia experimental e estatística, a fim de quantificar sistematicamente a heterogeneidade da expressão da proteína em seções do tecido inteiro de tumores, com base na análise automatizada quantitativos (AQUA) sistema 6. Secções de tecido são rotulados com anticorpos específicos dirigidos contra citoqueratinas e alvos de interesse, acoplado a fluoróforo marcado com anticorpos secundários. Slides são gravadas usando um scanner de fluorescência de todo o slide. As imagens são subdivididos em centenas de milhares de telhas, e cada azulejo é então atribuído uma pontuação AQUA que é uma medida de concentração de proteínas dentro do componente (tumor) do tecido epitelial. Heatmaps são gerados para representar expressão tecidual de proteínas e uma pontuação atribuída a heterogeneidade, usando uma medida estatística de heterogeneidade originalmente usado em ecologia, com base no índice de Simpson biodiversidade 7.
Até à data não houve tentativas de mapear sistematicamente e quantificar essa variabilidade em conjunto com a expressão da proteína, em preparações histológicas. Aqui, ilustramos o primeiro uso do método aplicado para ER e HER2 expressão de biomarcadores em câncer de ovário. Usando este método abre caminho para analisar a heterogeneidade como uma variável independente em estudos de expressão de biomarcadores em estudos de translação, a fim de estabelecer o significado da heterogeneidade no prognóstico e previsão de respostas à terapia.
O método descrito aqui permite a quantificação da heterogeneidade molecular na norma fixadas em formalina, incluído em parafina cortes histológicos de material de tumor. O método permite um valor a ser atribuído o grau de heterogeneidade em uma seção de tecido, de modo que este pode então ser considerados como uma variável no desenvolvimento de biomarcadores e análise. Embora, em geral, é preferível que os biomarcadores de tecido são homogêneas no que diz respeito à liberdade de expressão, de modo que o ensaio é menos suscetível a erros de amostragem ou de viés, pode em algumas circunstâncias ser útil para quantificar a heterogeneidade como um parâmetro. Por exemplo, como mostrado no exemplo ilustrativo para ER e HER2, biomarcadores comuns mostram uma considerável heterogeneidade de expressão e é atualmente desconhecido se isto representa um fator prognóstico independente ou preditiva em relação à evolução clínica ou resposta à terapia, respectivamente. Da mesma forma, como ilustrado, a terapia em si pode alterar dinamicamente apopulações constituintes das células e, portanto, medição de enriquecimento de alvo pode ser útil para orientar as decisões de tratamento.
No entanto, a técnica é limitada pelos mesmos fatores que limitam tradicionais análises histopatológicas ou biomarcadores (tais como imuno-histoquímica). O resultado é dependente do tipo, tamanho e qualidade do tecido a ser analisado, e, portanto, uma secção de tecido única pode não ser representativa de todo o tumor. De fato, o índice de Simpson pode ser indevidamente influenciada por tamanho do tecido (número de quadros capturados e dezenas AQUA medido). A imunogenicidade da epítopos que está sendo medido pode estar sujeito a incontrolável fatores pré-analíticos que artificialmente alterar sua expressão através da secção de tecido (como o tempo de isquemia fria, ou o comprimento de fixação, e artefatos de borda). Isto é particularmente um problema para fosfo-epítopos, que são notoriamente instáveis 14, 15. Portanto, a técnica poderia ser mais adequadaaos espécimes de ressecção, em vez de pequenas biópsias, e realizado em várias seções, em vez de apenas um. Em última análise, técnicas de imagem 3D pode oferecer uma oportunidade para melhor quantificar este parâmetro.
A técnica, tal como apresentado também pode ser limitada por fatores biológicos, tais como variabilidade na expressão do epítopo mascaramento citoqueratina. Isso pode ser motivo de preocupação particular nos cânceres, incluindo câncer de mama e de ovário, que se submetem epitelial-mesenquimal to-transição (EMT) ou são enriquecidas para não-epiteliais componentes ou células-tronco 16, como foi recentemente demonstrado que ocorrem em quimioterapia tratados de câncer de ovário in vitro 17, e em pacientes com câncer de mama em resposta à terapêutica 18. Esta limitação pode ser superada através de anticorpos mascaramento alternativa (ou cocktails de anticorpos), tais como citoqueratina mais vimentina, que é regulada em EMT 16. Além disso, uma vez que outros componentes do tecido (o microenvironment), como fibroblastos ou células endoteliais vasculares são também cada vez mais sendo alvo de terapias biológicas, a técnica também pode ser expandida para marcar esses componentes, usando máscaras específicas para compartimentos de interesse, tais como PECAM / CD31 a mancha de células endoteliais vasculares .
Embora a adaptação do índice de Simpson foi usado como uma medida de heterogeneidade no protocolo atual, devido à sua simplicidade, outras medidas de heterogeneidade poderia ser usado, como medidas simples de tendência central (média, mediana variância, etc). Além disso, os cálculos do índice de Simpson poderia ser modificado para melhor atender uma população de teste particular. O uso de Z-score transformações permite o placar ser mais aplicável para múltiplos marcadores desde a heterogeneidade é baseado em desvio em torno da média para um conjunto de dados. No entanto, a gama global de pontuação pode ser limitado a este tipo de transformação. Alguns projetos podem ser mais adequadossimplesmente bin as pontuações AQUA real para todas as amostras de um conjunto marcador particular. A seleção do número de caixas e cortes também é uma limitação no intervalo de valores que pode resultar e pode ser otimizado para designs alternativos experimental.
Temos usado ER e HER2 no estudo atual como candidatos a biomarcadores, uma vez que já são utilizados na clínica, ajudar a responder questões clínicas relevantes com relação à eficácia de terapias específicas, e são conhecidos por apresentar uma considerável heterogeneidade e mudança no ensino primário e distante doença 19. No entanto, o marcador ideal de heterogeneidade permanece a ser determinado. Outras possibilidades podem incluir marcadores citogenéticos de clonalidade, como os anteriormente utilizados em estudos FISH interfásico 20. A abordagem requer uma validação adicional em grande, bem anotado coortes clínicos ou clínicos, a fim de apurar a relevância deste parâmetro na biologia do câncer.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento do Conselho Escocês (Grant Número HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), Medical Research Scotland ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), o câncer Cancer Research UK Experimental Medicine Centre ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), e Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |