نحن هنا وصف طريقة لقياس التباين الجزيئية في المقاطع النسيجية من المواد السرطانية باستخدام كمية المناعي ، وتحليل الصور ، والإحصائي لقياس عدم التجانس. ويهدف الأسلوب لاستخدامها في تطوير العلامات البيولوجية السريرية والتحليل.
Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease.
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson’s biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.
وصف الأسلوب هنا تصاريح الكمي للتغايرية الجزيئية في الفورمالين القياسية الثابتة أقسام البارافين جزءا لا يتجزأ ، من مواد نسيجية الورم. الأسلوب يسمح القيمة التي سيتم تعيينها لدرجة التجانس في قسم الأنسجة ، بحيث يمكن بعد هذا أن تؤخذ بعين الاعتبار كمتغير في تنمية العلامات البيولوجية وتحليلها. بينما في العام فمن الأفضل أن المؤشرات الحيوية الأنسجة متجانسة فيما يتعلق التعبير ، بحيث يكون الفحص أقل عرضة للخطأ المعاينة أو التحيز ، قد يكون في بعض الظروف أن تكون مفيدة لقياس التباين كمعلمة. على سبيل المثال ، كما هو مبين في المثال التوضيحي لائحة وHER2 ، تظهر المؤشرات الحيوية المشتركة تجانس كبير من التعبير و هو الآن غير معروف ما إذا كان هذا يمثل عاملا مستقلا النذير أو التنبؤية فيما يتعلق بنتائج سريرية أو الاستجابة للعلاج ، على التوالي. وبالمثل ، كما يتضح ، ربما يغير العلاج نفسه حيويقد السكان المكونة للخلايا ، وبالتالي قياس تخصيب الهدف مفيدا في توجيه قرارات العلاج.
ومع ذلك ، يقتصر هذا الأسلوب من قبل نفس العوامل التي تحد من التحليلات التقليدية النسجية أو العلامات البيولوجية (مثل المناعى). قد تكون النتيجة تعتمد على نوع وحجم ونوعية الأنسجة التي يجري تحليلها ، وبالتالي قسم الأنسجة واحدة لا تكون ممثلة للورم بالكامل. في الواقع ، قد يكون مؤشر سمبسون منحازة على نحو غير ملائم من حيث الحجم من الأنسجة (عدد الإطارات الملتقطة وقياس درجات اكوا). قد استمناع من الحواتم يجري قياسه يخضع لعوامل لا يمكن السيطرة عليها قبل التحليلية التي تغير artifactually التعبير عنها عبر قسم الأنسجة (مثل وقت نقص التروية الباردة ، أو طول التثبيت ، وحافة قطعة أثرية). هذا في حد ذاته مشكلة بالنسبة الحواتم ، الفوسفات ، والتي تشتهر عطوب 14 و 15. ولذلك قد تكون في وضع أفضل تقنيةعلى العينات بدلا من استئصال الخزعات صغيرة وأجريت على مقاطع متعددة بدلا من واحدة فقط. في نهاية المطاف ، قد 3D تقنيات التصوير فرصة لتحديد أفضل هذه المعلمة.
ويمكن أيضا هذه التقنية على النحو تكون محدودة بسبب العوامل البيولوجية ، مثل التغير في التعبير عن cytokeratin حاتمة اخفاء. هذا قد يكون مصدر قلق خاص في تلك السرطانات ، بما في ذلك المبيض وسرطان الثدي ، والتي تخضع لالظهارية إلى الوسيطة الانتقالية (EMT) أو غير المخصب لالظهارية المكونات أو الخلايا الجذعية 16 ، كما تم مؤخرا أظهرت أن يحدث في العلاج الكيماوي علاج سرطان المبيض في المختبر 17 عاما ، ولدى مرضى سرطان الثدي في الاستجابة للعلاج 18. ويمكن التغلب على هذا القيد باستخدام الأجسام المضادة اخفاء البديلة (أو خليط من الأضداد) ، مثل cytokeratin vimentin زائد ، وهو upregulated في EMT 16. بالإضافة إلى ذلك ، منذ غيرها من مكونات النسيج (هيئة التصنيع العسكريكما roenvironment) ، مثل الخلايا الليفية أو خلايا بطانة الأوعية الدموية على نحو متزايد هدفا للعلاجات البيولوجية ، يمكن أيضا هذه التقنية يمكن أن تتسع لدرجة أن هذه المكونات ، وذلك باستخدام أقنعة محددة لمقصورات في المصالح ، مثل PECAM / CD31 إلى وصمة عار للخلايا بطانة الأوعية الدموية .
على الرغم من استخدام تكييف مؤشر سمبسون كمقياس لعدم تجانس في البروتوكول الحالي نظرا لبساطتها ، يمكن أن تستخدم تدابير أخرى من عدم التجانس ، مثل قياسات بسيطة النزعة المركزية (المتوسط ، التباين ، متوسط ، الخ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل حسابات مؤشر سمبسون لتتناسب مع أفضل مجموعة من السكان اختبار معينة. استخدام التحولات – Z درجة تسمح للتسجيل لتكون أكثر قابلية للتطبيق لعلامات متعددة منذ يستند إلى الاختلاف في الانحراف نحو الوسط لمجموعة البيانات. ومع ذلك ، يمكن أن تكون محدودة النطاق الإجمالي للتسجيل في هذا النوع من التحول. قد يكون بعض التصاميم تكون في وضع أفضلبن لمجرد عشرات AQUA الفعلية لجميع العينات من مجموعة علامة خاصة. اختيار عدد من صناديق والانقطاع هو أيضا قيد في مجموعة من القيم التي يمكن أن تؤدي ويمكن أن يكون الأمثل للتصاميم التجريبية البديلة.
وقد استخدمنا ER وHER2 في الدراسة الحالية والمؤشرات الحيوية مرشح ، حيث تستخدم فعلا في العيادة ، تساعد الإجابة عن الأسئلة ذات الصلة فيما يتعلق السريرية لفعالية العلاجات المستهدفة ، ومن المعروف أن تظهر التباين الكبير والتغيير في مجال التعليم الابتدائي والبعيد مرض 19. ومع ذلك ، علامة الأمثل للتجانس ما زال يتعين تحديدها. قد تشمل الاحتمالات الأخرى علامات خلوي من قابلية التنسيل ، مثل تلك التي استخدمت سابقا في دراسات الطور البيني السمكية 20. النهج يتطلب التحقق من صحة كبيرة كذلك في الأفواج والسريرية مشروحة بشكل جيد أو تجارب سريرية من أجل إقامة مزيد من أهمية هذه المعلمة في بيولوجيا السرطان.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل في جزء من التمويل المقدم من المجلس الاسكتلندي (عدد المنح HR07005 ؛ http://www.sfc.ac.uk/ ) ، البحوث الطبية اسكتلندا ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ) ، والسرطان أبحاث السرطان التجريبية في المملكة المتحدة مركز الطب ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) ، واختراق سرطان الثدي ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |