Hier beschreiben wir eine Methode zur molekularen Heterogenität in histologischen Schnitten von Tumormaterial mittels quantitativer Immunfluoreszenz, Bildanalyse und ein statistisches Maß an Heterogenität quantifizieren. Die Methode ist für den Einsatz in klinischen Biomarker-Entwicklung und Analyse bestimmt.
Morphologische Heterogenität innerhalb eines individuellen Tumors wird durch Histopathologen in der chirurgischen Praxis gut erkannt. Während dies oft in Form von Bereichen deutliche Differenzierung in anerkannten histologischen Subtypen oder anderen pathologischen Grad, oft gibt es mehr subtile Unterschiede im Phänotyp, die genaue Klassifizierung (Abbildung 1) trotzen. Letztlich, da Morphologie durch die zugrunde liegenden molekularen Phänotyp bestimmt wird, sind Bereiche mit sichtbaren Unterschiede wahrscheinlich durch Unterschiede in der Expression von Proteinen, die zelluläre Funktion und Verhalten aufeinander abstimmen und somit Erscheinungsbild begleitet werden. Die Bedeutung der sichtbaren und unsichtbaren (molekularen) Heterogenität für die Prognose ist nicht bekannt, aber die jüngsten Anzeichen dafür, dass zumindest auf der genetischen Ebene, Heterogenität in den Primärtumor 1,2 existiert, und einige dieser Sub-Klone führen zu Metastasen ( und damit tödliche) Erkrankung.
Darüber hinaus sind einige Proteinegemessen als Biomarker, weil sie die Ziele der Therapie (z. B. ER-und HER2 für Tamoxifen und Trastuzumab (Herceptin), genannt) sind. Wenn diese Proteine variable Expression zeigen innerhalb eines Tumors dann therapeutische Reaktionen können auch variabel sein. Die weit verbreitete histopathologischen Scoring Systeme für die Immunhistochemie entweder ignorieren oder numerisch homogenisieren die Quantifizierung der Proteinexpression. Auch in destruktive Techniken, bei denen der Tumor Proben homogenisiert (wie Genexpressions-Profiling), können quantitative Informationen aufgeklärt werden, aber räumliche Information ist verloren. Genetische Heterogenität Mapping Ansätze bei Bauchspeicheldrüsenkrebs haben entweder auf die Erzeugung von einer einzigen Zelle Suspension 3 verlassen, oder auf macrodissection 4. Eine aktuelle Studie hat Quantenpunkte verwendet, um morphologische und molekulare Heterogenität bei Prostatakrebs Gewebe 5 Karte und bietet proof of principle, dass die Morphologie und molekulare Zuordnung möglich ist, aber fallen short zur Quantifizierung der Heterogenität. Da Immunhistochemie ist im besten Fall nur semi-quantitative und unterliegt intra-und inter-observer bias, empfindlicher und quantitative Methoden erforderlich, um zu einer genauen Kartierung und zu quantifizieren Gewebe Heterogenität in situ.
Wir haben uns entwickelt und die Anwendung eines experimentellen und statistischen Methoden, um systematisch quantifizieren die Heterogenität der Proteinexpression in ganze Gewebeschnitte von Tumoren auf der Automated quantitative Analyse (AQUA) System 6 basiert. Gewebeschnitte werden mit spezifischen Antikörpern gegen Zytokeratine und Ziele von Interesse gerichtet ist, gekoppelt mit Fluorophor-markierten sekundären Antikörpern markiert. Slides sind abgebildet mit einem Ganzkörper-Rutsche Fluoreszenz-Scanners. Die Bilder werden in Hunderten bis Tausenden von Kacheln unterteilt und jede Fliese ist dann eine AQUA-Score, ein Maß für die Protein-Konzentration ist in den Epithelzellen (Tumor-) Komponente des Gewebes zugeordnet. Heatmaps generiert werden, um Gewebe Expression der Proteine und eine Heterogenität des Gastes zugeordnet dar, wenn ein statistisches Maß an Heterogenität ursprünglich in der Ökologie verwendet, auf der Simpson Biodiversität Index 7 basiert.
Bisher gibt es keine Versuche, systematisch Karte und quantifizieren diese Variabilität im Tandem mit Protein-Expression wurde in histologischen Präparaten. Hier zeigen wir den ersten Einsatz der Methode angewendet, um ER-und HER2-Biomarker Ausdruck bei Eierstockkrebs. Mit dieser Methode ebnet den Weg für die Analyse von Heterogenität als eine unabhängige Variable in Studien von Biomarker-Ausdruck in translationale Studien, um die Bedeutung von Heterogenität in Prognose und Vorhersage von Reaktionen auf die Therapie zu etablieren.
Das hier beschriebene Verfahren erlaubt die Quantifizierung molekularer Heterogenität in Standard-Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten von Tumormaterial. Das Verfahren erlaubt ein Wert, der den Grad der Heterogenität in einem Gewebeschnitt zugeordnet werden, so dass diese dann berücksichtigen kann als Variable in Biomarker Entwicklung und Analyse entnommen werden. Während im Allgemeinen ist es vorzuziehen ist, dass Gewebe Biomarker homogen sind in Bezug auf Ausdruck, so dass der Test weniger anfällig für Stichprobenfehler oder Voreingenommenheit ist, könnte es unter Umständen sinnvoll sein, Heterogenität als Parameter zu quantifizieren. Zum Beispiel, wie in der illustrativen Beispiel für ER-und HER2 gezeigt, zeigen gemeinsame Biomarker beträchtliche Heterogenität der Meinungsäußerung und es ist derzeit nicht bekannt, ob diese ein unabhängiger prognostischer oder prädiktiver Faktor in Bezug auf klinische Ergebnisse oder Ansprechen auf die Therapie bzw. darstellt. Ebenso, wie dargestellt, könnte eine Therapie sich dynamisch verändernBestandteil Populationen von Zellen und damit die Messung der Ziel-Anreicherung kann nützlich sein, in Führung Therapieentscheidungen treffen.
Allerdings ist die Technik, die von den gleichen Faktoren, die traditionellen histopathologischen oder Biomarker (z. B. immunhistochemische) analysiert Grenze begrenzt. Das Ergebnis ist abhängig von der Art, Größe und Qualität des Gewebes, die analysiert werden, und somit ein einzelnes Gewebe Abschnitt möglicherweise nicht repräsentativ für den gesamten Tumor sein. In der Tat kann die Simpson-Index über Gebühr nach der Größe des Gewebes (Anzahl der Frames erfasst und AQUA Scores gemessen) vorgespannt werden. Die Immunogenität der Epitope gemessen unterliegen können unkontrollierbare präanalytischen Faktoren, die artifactually verändern deren Ausdruck über den Gewebeschnitt (wie kalte Ischämiezeit, oder die Länge der Fixierung und Rand Artefakt). Dies ist vor allem ein Problem für phospho-Epitope, die notorisch labile 14, 15. Deshalb ist die Technik könnte besser geeignet seinzu Resektionsproben eher als kleine Biopsien und durchgeführt in mehreren Abschnitten statt nur einem. Letztlich kann 3D-Bildgebung bieten die Möglichkeit zur besseren Quantifizierung dieser Parameter.
Die Technik, wie dargestellt kann auch durch biologische Faktoren, wie Schwankungen in der Expression des Zytokeratin Maskierung Epitop beschränkt werden. Dies könnte von besonderer Bedeutung in diesen Tumoren, einschließlich Eierstock-und Brustkrebs, die epithelial-zu-mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen sind oder für nicht-epithelialen Komponenten oder Stammzellen Zellen 16 angereichert, wie kürzlich gezeigt wurde, treten in der Chemotherapie- behandelt Eierstockkrebs in vitro 17, und bei Patientinnen mit Brustkrebs in Ansprechen auf die Therapie 18. Diese Einschränkung kann zu überwinden Verwendung alternativer Maskierung Antikörper (oder Cocktails von Antikörpern), wie Zytokeratin und Vimentin, die in EMT 16 hochreguliert wird. Darüber hinaus, da andere Komponenten des Gewebes (der microenvironment), wie Fibroblasten oder Endothelzellen sind auch zunehmend von biologischen Therapien gezielter kann die Technik auch erweitert werden, um diese Komponenten Score, mit Masken für Fächer von Interesse, wie PECAM / CD31 für vaskuläre Endothelzellen Fleck .
Obwohl die Anpassung der Simpson-Index als ein Maß für die Heterogenität in der aktuellen Protokoll wegen ihrer Einfachheit verwendet worden, könnten auch andere Maßnahmen der Heterogenität eingesetzt werden, wie einfache Messungen der zentralen Tendenz werden (Mittelwert, Varianz, Median, etc). Darüber hinaus könnte die Simpson-Index-Berechnungen modifiziert werden, um besser an einen bestimmten Test Bevölkerung. Die Verwendung von Z-score-Transformationen ermöglicht das Punktesystem zu sein gilt für mehrere Marker, da die Heterogenität auf Abweichung um den Mittelwert für einen Datensatz beruht. Allerdings kann die gesamte Palette von Scoring in dieser Art von Transformation begrenzt werden. Einige Designs besser geeignet seineinfach bin die eigentliche AQUA Noten für alle Proben einer bestimmten Markierung zu setzen. Die Auswahl der Anzahl der Bins und Abschaltungen ist auch eine Einschränkung im Bereich der Werte, die können die Folge sein und kann für alternative experimentelle Designs optimiert werden.
Wir haben ER und HER2 in der aktuellen Studie als Biomarker-Kandidaten verwendet, da sie bereits in der Klinik eingesetzt werden, zu beantworten relevante klinische Fragen in Bezug auf die Wirksamkeit von gezielten Therapien, und sind dafür bekannt, eine beträchtliche Heterogenität und Wandel in weisen primäre und entfernte Krankheit 19. Allerdings bleibt die optimale Marker der Heterogenität zu bestimmen. Andere Möglichkeiten könnten auch zytogenetische Marker der Klonalität, wie sie zuvor in der Interphase FISH-Studien 20 verwendet. Dieser Ansatz erfordert eine weitere Validierung in großen, gut kommentierte klinischen Kohorten oder klinischen Studien, um weiter zu etablieren die Relevanz dieses Parameters in der Krebs-Biologie.
The authors have nothing to disclose.
; Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Scottish Funding Council (Grant Number HR07005 unterstützt http://www.sfc.ac.uk/ , Medical Research Scotland () http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), die Krebs- Research UK Experimental Cancer Medicine Centre ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) und Breakthrough Breast Cancer ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |