Aquí se describe un método para cuantificar la heterogeneidad molecular en los cortes histológicos de material tumoral mediante inmunofluorescencia cuantitativos, análisis de imágenes, y una medida estadística de la heterogeneidad. El método está pensado para su uso en el desarrollo de biomarcadores clínicos y estudios.
Heterogeneidad morfológica dentro de un tumor individual es bien reconocida por los histopatólogos en la práctica quirúrgica. Si bien esto suele adoptar la forma de las áreas de la diferenciación en distintos subtipos histológicos reconocido, o el grado patológico diferentes, a menudo hay diferencias más sutiles en el fenotipo que desafían la clasificación exacta (Figura 1). En última instancia, ya que la morfología está determinada por el fenotipo molecular subyacente, las zonas con diferencias visibles suelen ser acompañados por las diferencias en la expresión de proteínas que orquestan la función celular y la conducta, y por lo tanto, la apariencia,. La importancia de la visible y lo invisible (molecular) la heterogeneidad en el pronóstico se desconoce, pero la evidencia reciente sugiere que, al menos en el nivel genético, la heterogeneidad que existe en el 1,2 del tumor primario, y algunos de estos clones sub-dan lugar a metástasis ( y por lo tanto mortal) enfermedad.
Además, algunas proteínas sonmedida como biomarcadores, ya que son los objetivos de la terapia (por ejemplo, ER y HER2 para el tamoxifeno y el trastuzumab (Herceptin), respectivamente). Si estas proteínas muestran una expresión variable dentro de un tumor luego las respuestas terapéuticas también puede ser variable. Los esquemas utilizados histopatológico de puntuación de inmunohistoquímica o bien ignoran, o numéricamente homogeneizar la cuantificación de la expresión de la proteína. Del mismo modo, en las técnicas destructivas, donde las muestras se homogeneizan tumor (por ejemplo, perfiles de expresión génica), la información cuantitativa puede ser dilucidado, pero la información espacial se pierde. Enfoques de mapeo genético heterogeneidad en el cáncer de páncreas se han basado tanto en la generación de una suspensión de células individuales 3 o el 4 de macrodissection. Un reciente estudio ha utilizado los puntos cuánticos, para trazar la heterogeneidad morfológica y molecular en el cáncer de próstata tejido 5, aportando la prueba de principio de que la asignación de la morfología y la molecular es factible, pero que entren short de la cuantificación de la heterogeneidad. Dado que la inmunohistoquímica es, como mucho, sólo semi-cuantitativos y sujetos al sesgo intra-e inter-observador, más sensible y metodologías cuantitativas son necesarias con el fin de mapear con precisión y cuantificar la heterogeneidad del tejido in situ.
Hemos desarrollado y aplicado una metodología experimental y estadístico para cuantificar sistemáticamente la heterogeneidad de la expresión de proteínas en secciones de tejido conjunto de los tumores, con base en el análisis automatizado cuantitativo (AQUA) del sistema 6. Las secciones de tejido son marcadas con anticuerpos específicos dirigidos contra citoqueratinas y los objetivos de interés, junto al fluoróforo anticuerpos secundarios marcados. Las diapositivas son imágenes con un escáner de fluorescencia conjunto de diapositivas. Las imágenes se dividen en cientos de miles de azulejos, baldosas y cada uno se le asigna una puntuación de AQUA, que es una medida de la concentración de proteínas en las células epiteliales (tumor), componente de los tejidos. Heatmaps se generan para representar la expresión de las proteínas de los tejidos y una puntuación heterogeneidad asignado, utilizando una medida estadística de la heterogeneidad utilizado originalmente en la ecología, basado en el índice de Simpson biodiversidad 7.
Hasta la fecha no ha habido intentos de mapa de forma sistemática y cuantificar esta variabilidad junto con la expresión de proteínas, en las preparaciones histológicas. Aquí se ilustra el primer uso del método aplicado para ER y HER2 expresión de biomarcadores en cáncer de ovario. El uso de este método abre el camino para el análisis de la heterogeneidad como una variable independiente en los estudios de expresión de biomarcadores en estudios de traducción, a fin de establecer la importancia de la heterogeneidad en el pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento.
El método descrito en este documento permite la cuantificación de la heterogeneidad molecular en el estándar fijado en formol e incluido en parafina cortes histológicos de material tumoral. El método permite a un valor que se asigna el grado de heterogeneidad en una sección de tejido, por lo que este se pueda tomar en cuenta como una variable en el desarrollo de biomarcadores y el análisis. Aunque, en general, es preferible que los biomarcadores de tejidos son homogéneos con respecto a la expresión, por lo que el ensayo es menos susceptible a errores de muestreo o de sesgo, es posible que en algunas circunstancias, ser útil para cuantificar la heterogeneidad como un parámetro. Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo ilustrativo de ER y HER2, los marcadores biológicos comunes muestran una considerable heterogeneidad de expresión y actualmente se desconoce si esto representa un factor independiente de pronóstico o predictivo con respecto a los resultados clínicos o la respuesta al tratamiento, respectivamente. Del mismo modo, como se ilustra, la terapia se podría alterar la dinámicapoblaciones constituyentes de las células, y por lo tanto la medición de enriquecimiento de destino puede ser útil para guiar las decisiones de tratamiento.
Sin embargo, la técnica está limitada por los mismos factores que limitan el tradicional análisis histopatológico o biomarcadores (por ejemplo, inmunohistoquímica). El resultado depende del tipo, tamaño y calidad del tejido que se analiza, y por lo tanto una sección de tejido sola puede no ser representativa de todo el tumor. De hecho, el índice de Simpson puede ser excesivamente sesgado por el tamaño de los tejidos (número de fotogramas capturados y midieron los índices de AQUA). La inmunogenicidad de los epítopos que se está midiendo puede ser objeto de pre-analítica incontrolables factores que artificialmente alterar su expresión a través de la sección de tejido (por ejemplo, tiempo de isquemia fría, o la longitud de la fijación, y el artefacto de borde). Esto es particularmente un problema para la fosfo-epítopos, que son muy lábiles 14, 15. Por lo tanto, la técnica podría ser más adecuadade muestras de resección en lugar de pequeñas biopsias, y se realizó en varias secciones en lugar de uno solo. En última instancia, las técnicas de imagen en 3D podría ofrecer una oportunidad a una mejor cuantificación de este parámetro.
La técnica que se presenta también puede estar limitado por factores biológicos, como la variabilidad en la expresión del epítopo enmascaramiento citoqueratina. Esto puede ser especialmente preocupante en aquellos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de ovario y de mama, que se someten a la transición epitelio-mesenquimal de transición (EMT) o se enriquecen por falta de componentes epiteliales o células madre de 16 años, como ha sido recientemente demostrado que se producen en la quimioterapia tratar el cáncer de ovario in vitro 17, y en pacientes con cáncer de mama en la respuesta al tratamiento 18. Esta limitación puede ser superada utilizando anticuerpos alternativa adhesiva (o cócteles de anticuerpos), como citoqueratina vimentina además, que es regulada en EMT 16. Además, dado que los otros componentes del tejido (el micrófonoroenvironment), como los fibroblastos o células del endotelio vascular son también cada vez más el blanco de las terapias biológicas, la técnica también puede ser ampliado para anotar estos componentes, el uso de máscaras específicas para los compartimientos de interés, tales como PECAM / CD31 a las manchas de las células endoteliales vasculares .
A pesar de la adaptación del índice de Simpson se ha utilizado como una medida de la heterogeneidad en el protocolo actual, debido a su simplicidad, otras medidas de heterogeneidad podría ser utilizado, como las mediciones simples de tendencia central (media, la varianza, la mediana, etc.) Además, los cálculos del índice de Simpson podría ser modificado para adaptarse mejor a una población de prueba en particular. El uso de la Z-score transformaciones permite el marcador sea más aplicable a múltiples marcadores ya que la heterogeneidad se basa en la desviación alrededor de la media de un conjunto de datos. Sin embargo, el rango de general de puntuación puede ser limitada en este tipo de transformación. Algunos diseños pueden ser más adecuadossimplemente bin los resultados AQUA reales para todas las muestras de un conjunto marcador particular. La selección del número de papeleras y los cortes es también una limitación en el rango de valores que puede dar lugar y puede ser optimizado para diseños alternativos de experimentación.
Hemos utilizado ER y HER2 en el presente estudio como biomarcadores candidatos, puesto que ya se utilizan en la clínica, ayudar a responder preguntas relevantes clínicos con respecto a la eficacia de las terapias dirigidas, y se sabe que presentan una considerable heterogeneidad y el cambio en la educación primaria y distante la enfermedad 19. Sin embargo, el marcador óptimo de la heterogeneidad que queda por determinar. Otras posibilidades podrían incluir marcadores citogenéticos de clonalidad, tales como los utilizados anteriormente en el estudio de los peces interfase 20. El enfoque requiere una validación adicional en grandes cohortes, clínicas bien anotado o ensayos clínicos con el fin de consolidar aún más la relevancia de este parámetro en la biología del cáncer.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por el Consejo Escocés de Financiación (número de concesión HR07005; http://www.sfc.ac.uk/ ), de Investigación Médica de Escocia ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), el cáncer Investigación Experimental del Cáncer del Reino Unido Centro de Medicina ( http://www.cancerresearchuk.org/ ), y el cáncer de mama Breakthrough ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
Protein block | Dako | X0909 | |
Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |