Summary
Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.
Abstract
Le TGF-β a opposés rôles dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur dans la phase initiale, mais stimulant l'invasion et les métastases à 1,2 ultérieurement. Par ailleurs, le TGF-β est fréquemment surexprimé dans le cancer du sein et son expression est corrélée à un mauvais pronostic et les métastases 3,4. Les mécanismes par lesquels le TGF-β induit l'invasion ne sont pas bien comprises.
Le TGF-β provoque ses réponses cellulaires via le TGF-β de type II (TβRII) et de type I (TβRI) récepteurs. Sur le TGF-β induit la formation de complexes hétéromériques, TβRII phosphoryle la TβRI. Le TβRI activé initie sa voie de signalisation intracellulaire canonique par Smad récepteurs phosphorylant (R-Smad), c'est à dire Smad2 et Smad3. Ces activé R-Smad former des complexes avec les hétéromériques Smad4, qui s'accumulent dans le noyau et régulent la transcription des 5 gènes cibles. En plus des déjà described voie Smad, les résultats activation du récepteur dans l'activation de plusieurs autres non-Smad voies de signalisation, par exemple Mitogen protéine kinase activée (MAPK) voies 6.
Pour étudier le rôle du TGF-β dans les différents stades du cancer du sein, nous avons fait usage du système de pile à MCF10A. Ce système est constitué de cellules MCF10A1 spontanément immortalisé sein (M1) épithéliales 7, le H-Ras transformée M1 dérivés MCF10AneoT (M2), qui produit des lésions précancéreuses chez les souris 8, et le M2 MCF10CA1a dérivés (M4), qui a été établi à partir xénogreffes M2 et les formes de haute qualité avec des carcinomes de la capacité à métastaser au poumon 9. Cette série offre MCF10A la possibilité d'étudier les réponses des cellules avec différents grades de malignité qui ne sont pas biaisées par un fond génétique différent.
Pour l'analyse du TGF-β induite par l'invasion, nous avons généré homotypique MCF10A cellules sphéroïdes embe culturesdded dans une matrice de collagène 3D in vitro (figure 1). Ces modèles ressemblent tumeurs humaines in vivo par l'établissement d'un gradient d'oxygène et de nutriments, résultant en cellules actives et invasives sur les cellules à l'extérieur et de repos ou même nécrotiques dans l'intérieur du 10 sphéroïde. Sphéroïde tests basés ont également été montré pour une meilleure résistance aux médicaments que récapituler cultures en monocouche 11. Ce système MCF10 modèle 3D nous a permis d'étudier l'impact du TGF-β de signalisation sur les propriétés invasives des cellules mammaires à différents stades de malignité.
Protocol
1. Préparation de la solution méthocel (500 ml)
- Autoclave 6 g de méthylcellulose dans une bouteille de 500 ml contenant un agitateur magnétique.
- Dissoudre la méthylcellulose dans 250 ml de DMEM/F12 sans sérum préchauffé (60 ° C) pendant 20 min.
- Ajouter 250 ml de DMEM/F12 (RT) contenant du sérum de cheval à 10%. Mélanger la nuit (4 ° C).
- Effacer la solution par centrifugation (5000g, 2h, 4 ° C).
- Prenez la solution claire très visqueux dans un nouveau tube (environ 90-95% de la solution mère).
- Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. La culture Sphéroïde
- Préparer une solution à 20% Methocel (10 ml et 40 méthocel milieu de croissance ml).
- Laver les cellules deux fois avec PBS, ajouter 0,1% de trypsine et les cellules incuber à 37 ° C
- Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance et de compter les cellules.
- Préparer une suspension de 10 000 cellules par ml dans méthocel 20%.
- Ajouter la suspension cellulaire à la S 96 puits à fond rondplaques USPENSION (100 pi par puits).
- Le jour suivant, vérifiez la formation sphéroïde dans les plaques de suspension. Sphéroïdes sera prêt à l'emploi après 1-3 jours.
3. Préparation du collagène
- Préparer sur la glace une solution de collagène 8 ml, 1 ml PBS 10X, 1 ml de NaOH 0,1 N et 3 gouttes de HCl 0,1 N. Vérifiez si le pH est de 7,4 en repérant certains de la solution sur les bandes indicatrices de pH. Ajuster le pH si hors de portée.
- Ajouter 50 ul de solution de collagène neutralisé dans le puits d'une plaque à 96 puits
- Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est solidifié (90 min).
- Préparer méthocel-collagène-ligand des solutions sur la glace: pour chaque pipette ligand 1 partie de la solution de collagène. Ajouter 20 ng par ml de TGF-β collagène. Après dilution avec méthocel et la diffusion sur les différentes couches, la concentration finale de TGF-β sera de 5 ng / ml Mélanger au vortex. Ajouter une partie de méthocel-solution. Mélanger au vortex.
4. Sphéroïde intégrerDing
- Placez une extrémité 200 pi, qui a environ 5 mm de la pointe coupée, sur une pipette 200 pi. Aspirez une sphéroïde avec la pipette et soigneusement Répartir le milieu dans une assiette vide. Regardez si le sphéroïde reste à l'intérieur de la pointe. Le sphéroïde est visible comme un point blanc. Sans relâcher le piston, sucer jusqu'à 100 ul collagène méthocel mélange et se dispenser de l'ellipsoïde dans le mélange de collagène dans un revêtus de collagène de 96 puits. Faites cela pour 12 sphéroïdes pour chaque condition.
- Laissez collagène solidifier au moins 30 minutes à 37 ° C
- Retirer les bulles d'air avec une pointe de 200 pi.
- Ajouter 50 ul de milieu avec du sérum de 1,6% et les inhibiteurs dissous dans du DMSO. Pour le SB-431542 ajouter 4 ul de la solution mère (10 mm) à 1 ml de milieu. Après la diffusion, la concentration finale de l'inhibiteur sera de 10 uM. Le TGF-β et les inhibiteurs maintiendra le cap de l'expérimentation. Prenez des photos de sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X.
- Après 48h de stimulation par le TGF-β et / ou inhibiteurs, prendre des photos des sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X.
- Mesurer la surface des sphéroïdes envahir après 2 jours et soustraire la zone de départ. Mesure de la surface d'un sphéroïde: Ouvrir l'image à partir du sphéroïde dans Adobe Photoshop Extended (figure 2A) et sélectionnez l'outil Sélection rapide (figure 2B). Le pointeur de la souris se transforme en un cercle avec un «plus» (+) signe (figure 2C). Tout en faisant glisser le curseur sur le sphéroïde, Photoshop reconnaître les frontières de la sphéroïde. Si une zone à l'extérieur de l'ellipsoïde est sélectionné, cette région ne peut être exclu de la sélection en appuyant sur la touche Alt ou en utilisant l'outil de sélection négative qui est indiqué par un signe - dans la barre d'outils (). Le curseur se transforme en un cercle avec un «moins» (-) signe et en faisant glisser le curseur sur la zone sélectionnée à tort, cette zone est retiré de la sélection (figure 2D). Si nécessaire, plusieurs régions peuvent être sélectionnées en appuyant sur le ShBouton ift. Pour travailler avec plus de précision, de la taille du pointeur de la souris peut être ajustée en changeant le diamètre pinceau dans la barre d'outils (figure 2e). Lorsque le sphéroïde entier est sélectionné, la zone de la sélection est calculée par l'analyse-mesure dans la barre de menu ou en appuyant sur Ctrl + Maj + M (figure 2F). La fenêtre d'enregistrement de mesure apparaîtra indiquant le nom du fichier et le domaine de la sélection en pixels, ainsi que d'autres données (figure 2G). Si plusieurs sélections sont mesurées, la première ligne indique la somme de tous les domaines. Les mesures des sélections individuelles sont présentées dans les lignes ci-dessous. Les données de toutes les mesures peuvent être exportées dans un fichier texte et ouvert dans Excel.
5. Les résultats représentatifs:
Un exemple de l'essai sphéroïde MCF10A1 (M1) cellules mammaires normales épithéliales, H-Ras transformée MCF10AneoT (M2) et des cellules dérivées de M2 MCF10CA1a (M4) est donnée dans la Figure 3. Cellules M1 a montré que l'invasion faible sansstimulation, mais envahie significativement meilleure lors de la stimulation par le TGF-β. En revanche, le RAS-transformé M1-M2 dérivés ont envahi déjà efficacement sans plus de stimuli, et ce fut encore augmenté fois 4-5 lors du TGF-β traitement. Cellules M4 a montré la plus forte invasion, à la fois avec et sans le TGF-β plus.
Ensuite, nous avons examiné si nous pouvions interférer avec le TGF-β induite par l'invasion de ce modèle sphéroïde en utilisant des inhibiteurs chimiques. À cette fin, nous avons utilisé le SB-431 542, un analogue de l'ATP et inhibiteur sélectif de l'activité kinase de TβRI, ainsi que l'activine de type IB récepteur (ActRIB) et l'activine receptor-like kinase (ALK) 7 12. Comme prévu, le SB-431542 inhibe puissamment le TGF-β induit l'invasion de M1, M2 et M4 cellules (Fig. 4), indiquant que le TGF-β invasion induite est TβRI-kinase dépendante. En outre, l'invasion basale des sphéroïdes a également été fortement inhibée, ce qui suggère que l'invasion basale est également deindépendante sur le TGF-β.
Organigramme Figure 1. De l'analyse 3D sphéroïde. Tout d'abord, les cellules sont plaquées sous conditions non-adhérentes en plaques suspensions en forme de U. Cellules attestation globale en sphéroïdes multcellular et peuvent être intégrés dans une matrice de collagène. Dans cette matrice de collagène, ils sont capables d'envahir.
Figure 2. Quantification de la zone des sphéroïdes en utilisant Adobe Photoshop Extended. (A) L'image du sphéroïde est ouvert dans Adobe Photoshop élargie du (B) Choix de l'outil de sélection rapide (C) Glisser le curseur sur le sphéroïde pour sélectionner la zone du sphéroïde (D) Suppression d'une zone incluse wongly utilisant le négative outil Sélection rapide (E) Ajustement de la taille du pinceau de l'outil Sélection rapide pour sélectionner plus précisément la zone (F) Sélection de laMesure commande à enregistrer (G) Exemple d'un enregistrement de la mesure.
Figure 3. TGF-β induite par l'invasion de sphéroïdes spontanément immortalisé MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformé MCF10AneoT (M2 (B) et son dérivé métastatique MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 et M4 sphéroïdes embarqué en collagène ont été traités avec 5ng/ml du TGF-β pour les 48h comme indiqué. AC images représentant prises à la journée d'intégration et deux jours plus tard. D invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de 13.
Invasion de la figure 4. Sphéroïde basocellulaire et le TGF-β-induite est inhibée bSB-431542 Y. Sphéroïdes M1, M2 et M4 ont été intégrés dans le collagène et traités avec le TGF-β 5ng/ml et / ou 10 uM SB-431 542 comme indiqué. Images représentant prises après 2 jours (A). L'invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0 (B). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de 13.
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Discussion
Nous avons établi un modèle dans lequel sphéroïde MCF10A1 cellules malignes et de ses dérivés envahissent dans une matrice de collagène de manière TGF-β-dépendante. Tout d'abord, sphéroïdes sont formés dans les plaques rondes de 96 puits de suspension en bas, en présence de méthylcellulose. Bien sûr, aussi en forme de U en poly-HEMA plaques revêtues peuvent être utilisés à cette fin. La méthylcellulose est absolument nécessaire dans cette étape, puisque les cellules vont mourir en l'absence de méthylcellulose. Le TGF-β est ajouté directement au mélange collagène méthocel puisque nous avons trouvé que les cellules réagi moins bien à l'TGF-β lorsque ce facteur a été ajouté à la partie supérieure op moyenne du collagène. Cependant, il est conseillé d'ajouter des inhibiteurs chimiques dissous dans du DMSO pas directement dans le collagène, depuis le DMSO précipités dans le IceCold collagène méthocel mélange. Par conséquent, nous ajoutons ces composés dans le milieu sur le dessus du collagène.
Par la suite, les cellules sont intégrés dans un 3-dimensionnelle de collagèneional environnement pour leur permettre d'envahir dans la matrice de collagène. Lorsque l'on compare les propriétés invasives de l'MCF10A1 différentes lignées cellulaires nous avons constaté que l'invasion basale ainsi que le TGF-β induit l'invasion accrue des cellules relativement bénigne M1, à des niveaux supérieurs dans le dérivé RAS-transformé M2, à des niveaux encore plus élevés dans le métastatique M4 variante. Ainsi, les propriétés invasives corrélée avec l'état relatif de l'agressivité de ces trois lignées cellulaires 7,8,14.
L'intégration du sphéroïde dans le collagène est une étape critique dans le dosage. La détection du sphéroïde dans la pointe de la pipette peut être difficile lors de l'exécution du test pour la premières fois. On peut éviter cela en la collecte des sphéroïdes dans un tube, les filer vers le bas, enlever le surnageant et remettre en suspension les sphéroïdes de collagène méthocel mélange. Cela nécessite plus de sphéroïdes comme entrée que près de 50% des sphéroïdes est perdue au cours de ce processus. Par ailleurs, plusieurssphéroïdes peuvent se retrouver dans un puits et pourrait se trouver trop près les uns aux autres à analyser. En outre, il est préférable de ne pas avoir plus d'un sphéroïde par puits pour éviter la possibilité que les sphéroïdes peuvent interférer les uns avec les autres (par exemple en sécrétant des facteurs de croissance). Par conséquent, l'étape la remise en suspension est une étape critique en utilisant cette méthode.
Une limitation de ce test est que nous analysons un test en 3 dimensions dans un plan en 2 dimensions. Comme on peut le voir dans les figures 3 et 4, la plupart des cellules normalement envahissent dans le même plan. Toutefois, sphéroïdes qui sont situés très près du bord du puits envahissent généralement plus en profondeur et sont pour cette raison exclus de l'analyse. Bien sûr, il serait possible d'effectuer l'analyse en 3D, afin d'obtenir un résultat plus précis. Mais cela nécessite du matériel et des logiciels sophistiqués et le bénéfice de calculer le volume au lieu d'utiliser la zone ne peut pas l'emporter sur la peine. Surtout depuis que nous avons constaté que la variation de la taille de départdes sphéroïdes en 3 dimensions tel que mesuré en 2D, n'est généralement que de 5-10%.
Un autre inconvénient de cette méthode est que l'imagerie est une étape de temps, puisque les sphéroïdes sont situés à des hauteurs différentes, ce qui entrave l'imagerie automatisée. Aussi l'étape d'analyse prend du temps et nécessite des photos avec un bon contraste de sphéroïde à la matrice afin de rendre l'utilisation de la capacité de reconnaître automatiquement Photoshops la frontière du sphéroïde. Au cas où le contraste est trop faible, on peut facilement adapter la luminosité et le contraste en utilisant les niveaux et les commandes des courbes dans Photoshop. Une autre façon d'augmenter le contraste serait l'utilisation d'un colorant vital fluorescent.
Comme une façon alternative de quantification, on pourrait tirer la zone autour du sphéroïde manuellement en utilisant l'image J. Une avance de l'image J, c'est qu'il est un freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Toutefois, nous avons trouvé le dessin manuel de la forme irrégulière des sphéroïdes envahi en Image June étape de temps par rapport à l'outil Sélection rapide de Photoshop.
Le protocole peut être adapté pour enquêter sur l'invasion des autres lignées cellulaires, à condition que les cellules sont capables de former spheroids.Furthermore, la concentration optimale de TGF-β pour induire l'invasion de la lignée cellulaire pourrait être différente. Dans toutes nos lignées cellulaires, le TGF-β induit l'invasion à 5 ng / ml, bien M4 fonctionne mieux lorsque vous utilisez 2 ng / ml.
De plus, ce dosage peut être adapté pour mesurer les réponses envahissantes autres facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance épithélial (EGF) ou facteur de croissance des hépatocytes (HGF).
Dans nos essais de l'invasion et de TGF-basale β-induite a été fortement inhibée par le traitement avec le SB-431542, un inhibiteur de récepteur de type I du TGF-β. Ceci est une preuve de principe que les inhibiteurs chimiques peuvent être utilisés dans ce dosage. Autres inhibiteurs chimiques, tels que les inhibiteurs de MMP, ont également été utilisées avec succès à des concentrationstions recommandées par le fabricant pour la culture cellulaire monocouche.
Sur la maîtrise de cette technique, on peut tester l'effet des inhibiteurs chimiques, knockdown ou la surexpression de gènes sur l'invasion. Par ailleurs, en intensifiant le dosage d'un format de 24 puits, on peut isoler l'ARN en utilisant une méthode au phénol-chloroforme-base (par exemple Trizol ® ou Tripure) suivie d'une colonne de silice en fonction de nettoyage. Cet ARN peut être utilisé pour quantitatives PCR en temps réel.
Notre test d'invasion sphéroïde ressemble le procédé in vivo de plus près que l'invasion des modèles 2D, parce que les cellules en sphéroïdes sont dans différents états métaboliques et d'interagir de manière plus naturelle avec leur environnement 10. Nous avons effectué iodure de propidium et coloration diacétate de fluorescéine pour vérifier les cellules mortes et vivantes, après le test d'invasion et a observé que similaire à la situation in vivo, les cellules du centre sont mortes et nécrotique, alors que les cellules à l'instant tqu'il bord extérieur sont métaboliquement actives.
Nous avons utilisé collagène de type I plutôt matrigel, parce que plusieurs rapports ont montré que la composition de la matrice extracellulaire dans le cancer du sein est souvent altérée, ce qui fibrotiques raides foyers avec une haute teneur en collagène I contenu. Il a été démontré que le collagène contenu augmenté, je favorise la formation du cancer du sein et de l'invasion 15 et est associée à une plus grande incidence de métastases 16. Beaucoup de cellules tumorales ont donc à envahir par un collagène de type I environnement riche afin de se métastaser.
Plusieurs modèles 3D ont été développés au cours des dernières décennies. Les cellules peuvent être soit entièrement noyés dans une matrice ou placés sur le dessus d'une matrice polymérique ou un échafaudage 17,18. Dans un modèle 3D développé par Bissell et co-travailleurs, les cellules ont été cultivées dans une membrane basale reconstituée (RBM) de la matrice. Ce modèle fournit une analyse rapide de faire la distinction entre les normales et malignesépithélium mammaire, mais se concentre sur 19,20 morphologie cellulaire. Morphogenèse et l'organisation de la cellule de lignes distinctes MCF10A inversement corrélée à la malignité 21,22. En d'autres modèles 3D sphéroïdes multicellulaires ont la même résistance aux médicaments cytotoxiques que leur lignée cellulaire parentale in vivo, tandis que les cellules en monocouches omis de le faire 11. Aussi cultures 3D de lignées de cellules MCF10A ont été utilisés pour évaluer la sensibilité aux inhibiteurs de kinase 23. Notre modèle sphéroïde en complément de ces tests par les portant spécifiquement sur l'invasion.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, Etats-Unis) pour les réactifs et Fred Miller (Barbara Ann Intitute cancer Karmanos, Detroit, Etats-Unis) pour les lignées cellulaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96-well suspension plates | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates | Greiner Bio-One | 655 180 |
References
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