Summary
定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。
Abstract
TGF -βは、初期段階の腫瘍抑制因子として作用するが、後の段階の1,2で浸潤や転移を刺激することによって、乳がんの進行の役割を反対している。また、TGF -βは、頻繁に乳癌において過剰発現し、その発現は予後不良と転移3,4と相関している。 TGF -β誘導の侵入はよく理解されていないメカニズム。
TGF -βはTGF -βII型（TβRII）とI型（TβRI）受容体を介してその細胞応答を誘発する。 TGF -βによって誘導されるヘテロ複合体形成時には、TβRIIはTβRIをリン酸化する。活性化TβRIはすなわちSmad2およびSmad3、受容性Smad（R - Smadの）をリン酸化することによって、その細胞内の標準的なシグナル伝達経路を開始します。これらの活性化R - Smadは核に蓄積し、標的遺伝子5の転写を調節であるSmad4とヘテロ複合体を形成。以前にDに加えていくつかの他の非のSmadシグナル伝達経路の活性化の傍接したのSmad経路、受容体の活性化の結果は、例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）は6パスウェイ。
乳癌の異なる段階におけるTGF -βの役割を研究するために、我々は、MCF10A細胞システムを利用していました。このシステムは、自発的に不死化MCF10A1（M1）乳房上皮細胞7から構成され、H - RASは、マウス8で前癌病変を生成するM1 -派生MCF10AneoT（M2）、、およびから設立されたM2 -派生MCF10CA1a（M4）を、変換M2異種移植片およびフォーム肺9に転移する能力を持つハイグレードの癌腫。このMCF10Aシリーズは、異なる遺伝的背景によってバイアスされていない悪性の異なるグレードの細胞の応答を研究する可能性を提供しています。
TGF -β誘発性浸潤の分析のために、我々はホモタイプMCF10Aスフェロイド培養細胞のembeを生成試験管内 （図1） における 3次元コラーゲンマトリックスにdded。このようなモデルは、密接に回転楕円体10の内部に外側と静止あるいは壊死細胞上でアクティブと浸潤細胞で、その結果、酸素や栄養素の勾配を確立することによりin vivoでヒトの腫瘍に似ています。回転楕円体ベースのアッセイはまた、単層培養11時薬剤耐性を向上を再現することが示されている。このMCF10 3Dモデルのシステムでは、私たちは悪性腫瘍のさまざまな段階で乳がん細胞の浸潤特性に関するTGF -βシグナル伝達の影響を調査することができました。
Protocol
1。メトセル溶液（500ml）の準備
- マグネチックスターラーを含む500mlのボトルにメチルセルロースのオートクレーブ6グラム。
- 20分間血清（60℃）なしで予熱DMEM/F12 250ml中にメチルセルロースを溶解する。
- 10％ウマ血清を含むDMEM/F12 250mlの（RT）を追加します。混ぜて一晩（4℃）。
- 遠心分離（5000グラム、2時間、4℃）でソリューションをクリアします。
- 新しいチューブ（ストック溶液の90〜95％程度）に透明な高粘度液を取る。
- 4℃、使用するまでC。
2。スフェロイド培養
- 20パーセントメトセル溶液（10mlメトセル、40 mlの増殖培地）を調製する。
- PBSで細胞を2回洗浄、37℃で0.1％トリプシンとインキュベートセルを追加° C
- 増殖培地中で細胞を再懸濁し、細胞を数えます。
- 20％メトセルにmlあたり10 000細胞の懸濁液を準備します。
- 96ウェル丸底のために細胞懸濁液を追加します。uspensionプレート（ウェルあたり100μl）。
- 翌日、サスペンションプレートの回転楕円体の形成を確認してください。スフェロイドは1-3日後に使用できるようになります。
3。コラーゲンの調製
- 氷上に8mlのコラーゲン、1mlの10倍PBS、1 mlの0.1 N NaOHおよび3滴0.1NのHClの溶液を調製します。 pHがpH指示薬ストリップ上の解の一部をスポッティングを7.4かどうかを確認します。範囲外の場合pHを調整する。
- 96ウェルプレートのウェル内で中和コラーゲン溶液50μlを加え
- コラーゲンが固化されるまで37℃でインキュベート（90分）。
- 氷の上メトセル - コラーゲン-リガンド溶液を調製：コラーゲン溶液のそれぞれのリガンドピペット1部のために。コラーゲンTGF -βの20ngのあたりのmlを加える。異なるレイヤー上のメトセルと拡散で希釈した後、TGF -βの最終濃度は、ボルテックスで5 ng / mlのミックスになります。 METHOCEL -ソリューションの1部を追加。ボルテックスにより混和する。
4。回転楕円体を埋め込む鼎
- 200μlのピペットに、カットオフ先端から約5 mmを持っている200μlの先端を置きます。ピペットを使用すると、ワンスフェロイドを吸うと慎重に空のプレートに培地を分注する。回転楕円体の先端の内側にとどまる場合観る。回転楕円体は、白いドットとして表示されます。プランジャーを解放せずに、100μlのコラーゲンメトセルの混合物を吸い取ると、コラーゲンコート96ウェルにコラーゲンの混合物中の回転楕円体を分注する。各条件に12回転楕円体に対してこれを行います。
- コラーゲンは37℃で少なくとも30分を凝固させて° C
- 200μlの先端で空気の泡を取り除く。
- DMSOに溶解した1.6％の血清と阻害剤と培地50μlを追加。 SB - 431542のためにストック溶液の4μlの（10mM）を培地1mlに追加します。拡散した後、阻害剤の最終濃度は10μMとなる。 TGF -βおよび阻害剤は、実験の過程であり続けるでしょう。 40X倍率を用いて顕微鏡下でスフェロイドの写真を撮ります。
- 4の後にTGF -βおよび/または阻害剤による刺激の8時間は、40倍の倍率を用いて顕微鏡下でスフェロイドの写真を撮る。
- 2日後に侵入する回転楕円体の面積を測定し、スタートエリアを引きます。の面積を測定する回転楕円体：Adobe Photoshopの拡張（図2A）の回転楕円体からの映像やクイック選択ツール（図2B）を選択し[開く。 "プラス"（+）記号（図2C）の円にマウスポインタの形が変化。回転楕円体の上にカーソルをドラッグしながら、Photoshopは回転楕円体の境界を認識します。 （ - ）ツールバーの[記号回転楕円体の外側の領域が選択されている場合は、この地域は、Altキーを押すかによって示される負の選択ツールを使用して、選択から除外することができます。 （ - ）"マイナス"の円にカーソルが変化記号と誤って選択した領域の上にカーソルをドラッグすることによっては、このエリアは、選択（図2D）から削除されます。必要に応じて、複数の領域はSHを押すことで選択できます。IFTのボタン。より正確に動作するように、マウスポインタのサイズは、ツールバーにあるブラシの直径（図2E）を変えることによって調整することができます。全体の回転楕円体が選択されている場合、選択の面積は、メニューバーの分析- MEASUREを介して、またはCtrl + Shiftキー+ M（図2F）を押すことによって計算されます。測定の記録ウィンドウには、ファイル名とピクセル単位で選択の領域だけでなく、他のデータ（図2G）を示すが表示されます。複数の選択が測定されている場合、最初の行はすべての領域の合計を示しています。個々の選択の測定は、下記の行で表示されます。すべての測定のデータはテキストファイルにエクスポートし、Excelで開くことができます。
5。代表的な結果：
MCF10A1（M1）、正常な乳房上皮細胞とスフェロイドアッセイの例、H - RASはMCF10AneoT（M2）細胞を形質転換し、M2由来MCF10CA1a（M4）は、図3に示します。 M1細胞はなくだけ弱い侵攻を示した刺激が、TGF -βによる刺激により有意に優れて侵入した。対照的に、M2は、刺激の添加なしに効率的にすでに侵入したM1 -派生RAS -変換、およびこれをさらにTGF -β治療時に4〜5倍に増加した。 M4の細胞が両方でとTGF -βを添加していない、最強の侵略を示した。
次に、私たちは化学物質の阻害剤を使用して、この回転楕円体モデルではTGF -βによって誘導される侵攻を妨害する可能性があるかどうかを検討した。この目的のために我々は、SB - 431542、ATPのアナログとTβRIのキナーゼ活性の選択的阻害剤だけでなく、アクチビン型IB受容体（ActRIB）とアクチビン受容体様キナーゼ（ALK）7〜12を使用していました 。予想通り、SB - 431542は強力M1のTGF -β誘発性浸潤、そのTGF -β誘発性浸潤を示すM2とM4の細胞（図4）、TβRI-キナーゼ依存を抑制した。さらに、スフェロイドの基底侵攻も強く基礎侵攻もDEがいることを示唆し、阻害されたTGF -βで独立。
3D回転楕円体アッセイの図1。フローチャート。最初に、細胞はU字型サスペンションプレートの非接着性の条件下で播種されています。細胞はmultcellularスフェロイドにaggregrateとコラーゲンマトリックスに埋め込むことができます。このコラーゲンマトリックス中に、彼らは侵入することができます。
図2：Adobe Photoshopを使用してスフェロイドの面積の定量化が拡張。 （A）回転楕円体の画像が使用wongly含まれる領域の回転楕円体（D）除去の領域を選択する回転楕円体の上にカーソルをドラッグしてクイック選択ツールのAdobe PhotoshopのExtendend（B）の選択（C）で開かれますのより正確に領域を選択するには、クイック選択ツールのブラシの大きさの負のクイック選択ツール（E）調整（F）の選択測定は、コマンド（G）測定記録の例を記録する。
図3。自発的に不死化MCF10A1（M1）（A）のスフェロイドのTGF -β誘発性浸潤、MCF10AneoT（M2（B）とその転移性微分MCF10CA1a（M4）（C）。M1、M2およびM4スフェロイドが埋め込 まRAS -変換示されるようにコラーゲンに48時間のためにTGF -βの5ng/mlで処理した。AC代表画像は埋め込 みの一日で撮影し、二日後。D相対侵入が2日目マイナス0日目に面積の差として定量した。結果が表現されているとして平均値± SDは、13から脚色。
図4基礎とTGF -βによって誘導される回転楕円体の侵入は、Bを阻害されるY SB - 431542。 M1、M2とM4球状体がコラーゲンに埋め込まれ、示されるように5ng/ml TGF -βおよび/または10μMSB - 431542で処理した。 2日間（）後に採取した代表的な写真。相対的な侵略は、2日目マイナス0日目（B）上の領域の差として定量化した。結果は平均± SDは、13から脚色として表現されています。
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Discussion
我々はMCF10A1細胞とその悪性誘導体はTGF -β依存的にコラーゲンマトリックス内に侵入した回転楕円体モデルを確立した。最初に、スフェロイドは、メチルセルロースの存在下で96ウェル丸底サスペンションプレートに形成されています。もちろん、またU字型のポリ- HEMAコートしたプレートは、この目的のために使用することができます。細胞はメチルセルロースのない状態で死んでしまうので、メチルセルロースは、絶対に、このステップが必要です。我々は細胞がこの因子はコラーゲンの培地オペアンプの上部に追加されたときにTGF -βにあまりよく応答することがわかったので、TGF -βはコラーゲン-メトセル混合物に直接追加されます。 DMSOはicecoldコラーゲンメトセルの混合物に沈殿物しかし、それは、コラーゲンに直接ではなくDMSOに溶解した化学物質の阻害剤を添加することをお勧めします。したがって、我々は、コラーゲンの上に培地中でこれらの化合物を加える。
その後、細胞はコラーゲン3 dimensに埋め込まれているそれらはコラーゲンマトリックスに侵入できるようにional環境。異なるMCF10A1細胞株の浸潤特性を比較するとき我々は、その基底侵攻と同様にTGF -β誘発性浸潤がでさらに高いレベルに、RAS形質転換M2誘導体より高いレベルに、比較的良性のM1細胞からの増加を発見転移性M4バリアント。このように、侵襲的な性質は、7,8,14、これら3つの細胞系の攻撃性の相対的な状態と相関していた。
コラーゲンに回転楕円体の埋め込みは、アッセイにおける重要なステップです。最初の数回のアッセイを行う際に、ピペットチップの回転楕円体の検出が難しくなる可能性があります。一つは、上清を除去し、それらをスピンダウンして、チューブ内にスフェロイドを集めることによって、この問題を回避し、コラーゲン-メトセル混合物中の球状体を再懸濁させることができる。スフェロイドの約50％がこのプロセス中に失われているので、これは入力としてより多くのスフェロイドが必要です。さらに、複数のスフェロイドはうまく一つになるかもしれませんし、分析するために近すぎて、お互いに嘘をつくかもしれない。さらに、それはスフェロイドが（分泌成長因子によるなど）がお互いに干渉する可能性を避けるために、ウェル当たりではないより多くの、1つ回転楕円体を有することが好ましい。したがって、再懸濁するステップは、このメソッドを使用して重要なステップです。
このアッセイの制限は、我々は2次元平面に3次元のアッセイを分析することです。図3と図4に見られるように、ほとんどの細胞は、通常、同一平面上に侵入。非常によく深さで一般的に侵入し、分析から除外その理由なのエッジ付近に配置されているしかし、スフェロイド。もちろん、それはより正確な結果を得るために、3Dで解析を実行することが可能になります。しかし、これは洗練されたハードウェアとソフトウェアを必要とし、体積を計算する代わりに、領域を使用する利点は、トラブルを上回っていない可能性があります。我々が見つかりました、特に以来、その初期サイズの変化として2次元で測定した3次元回転楕円体の、一般的にはわずか5〜10％です。
この方法のもう一つの欠点は、スフェロイドが自動化された画像を妨げ異なる高さ、に位置しているので撮影は、時間のかかるステップであるということです。また、解析ステップは時間がかかり、Photoshopsの能力の使用が自動的に回転楕円体の境界を認識するようにするために回転楕円体から行列への良好なコントラストを持つ写真が必要です。コントラストが低すぎる場合には、人は簡単にフォトショップのレベルと曲線のコマンドを使用して明るさとコントラストを適応させることができます。コントラストを向上させる別の方法は、極めて重要な蛍光色素の使用となります。
定量化の代替方法として、一つはイメージJ.の画像Jの前進を使用して手動で回転楕円体の周りを描くことができる、それはフリーウェアです（http://rsbweb.nih.gov/ij/）ということです。しかし、我々は、Image Jで侵入したスフェロイドの不規則な形状の取扱説明書の図面を発見時間のかかるステップは、Photoshopのクイック選択ツールと比較して。
プロトコルは、細胞がspheroids.Furthermore、異なる場合があります細胞株の浸潤を誘導するTGF -βの最適濃度を形成できることを提供し、他の細胞株の侵入を調査するために適応させることができます。 2 ngの/ mlを使用するときにM4のパフォーマンスが優れているが、すべて私たちの細胞株では、TGF -βは、5 ng / mlので侵略を誘発する。
さらに、このアッセイは、上皮成長因子（EGF）や肝細胞増殖因子（HGF）のような他の成長因子、に侵襲的な応答を測定するために適応させることができます。
私たちのアッセイでは基礎とTGF -β誘発性浸潤が強く、SB - 431542、TGF -βのI型受容体の阻害剤で処理することによって阻害された。これは、化学物質の阻害剤は、このアッセイで使用することができる原理の証明です。このようなMMP阻害剤として他の化学阻害剤は、、また濃度で成功裏に使用されている単層細胞培養のための製造業者が推奨するtions。
マスタリング時にはこのテクニックは、1つは、侵略上の遺伝子のノックダウンまたは過剰発現を化学的阻害剤の効果をテストすることができます。さらに、24ウェルフォーマットにアッセイをスケールアップすることで、一つはシリカカラムベースのクリーンアップに続いてフェノール - クロロホルムベースの方法（例えばトリゾール®またはTripure）を使用してRNAを分離することができます。このRNAは、定量的リアルタイムPCRに使用することができます。
スフェロイドの細胞が様々な代謝状態にあるとその周辺10で、より自然な形で相互作用するため、私たちの楕円体の浸潤アッセイは、より密接に2次元侵略のモデルよりも生体内でのプロセスに似ています。我々は、浸潤アッセイ後の死と生細胞を確認するために、ヨウ化プロピジウムおよびフルオレセインジアセテート染色を行い、同様にin vivoの状況でに、中央の細胞が死んで壊死していることを観察したのに対し、tにおけるセル彼外側のエッジは、代謝的に活性です。
いくつかの報告が高いコラーゲンIコンテンツと線維化硬い病巣の結果、乳癌における細胞外マトリックスの組成物はしばしば変更されることが示されているので、私たちは、その後かなりマトリゲルをI型コラーゲン使用。それは、増加コラーゲン私はコンテンツは乳がんの形成と浸潤15を促進し、転移16の大きな発生率に関連付けられていることが実証されている。多くの腫瘍細胞は、このように転移するためにコラーゲンを介してI豊かな環境に侵入する必要があります。
いくつかの3Dモデルは、過去数十年にわたって開発されている。細胞は、完全にマトリックスに内に埋め込 んだり、マトリクスまたはポリマー足場17,18の上部に配置することができます。ビッセルと共同研究者によって開発された3Dモデルでは、細胞が再構成基底膜（RBM）のマトリックス中で成長させた。このモデルは、正常および悪性を区別するために迅速なアッセイを提供する乳腺上皮が、細胞の形態19,20に焦点を当てています。逆に悪性腫瘍21,22との相関異なるMCF10A細胞株の形態形成と組織。単層の細胞は11これを行うには失敗したのに対し、他の3Dモデルでは多細胞スフェロイドは、 生体内で彼らの親細胞株として細胞傷害性薬剤に同じ抵抗性を示した。また、MCF10A細胞系の3次元培養は、キナーゼ阻害剤23〜感度を評価するために使用されている。私たちの回転楕円体モデルは、特に侵略に焦点を当て、これらのアッセイを補完します。
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Disclosures
利害の衝突は。
Acknowledgments
我々は、細胞株のための試薬とフレッドMillerのケン岩田（OSIファーマシューティカルズ、ニューヨーク、アメリカ）（バーバラアンカルマノスがんIntitute、デトロイト、米国）に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96-well suspension plates | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates | Greiner Bio-One | 655 180 |
References
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