TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Özet

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

Özet

TGF-β başlangıç ​​aşamasında bir tümör baskılayıcı gibi davranan, ancak daha sonraki bir aşamada ^1,2 invazyon ve metastaz uyarıcı, meme kanseri ilerlemesinde rol karşı vardır . Ayrıca, TGF-β meme kanseri sık sık aşırı eksprese ve kendi ifadesini, kötü prognoz ^ve metastaz 3,4 ile ilişkilidir. TGF-β indükler işgali iyi anlaşılmış değildir hangi mekanizmaları.

TGF-β, TGF-β Tip II (TβRII) ve tip I (TβRI) reseptörleri aracılığıyla hücresel yanıtlar ortaya çıkarır. TGF-β indüklenen heteromeric kompleks oluşum üzerine, TβRII TβRI fosforile. Aktif TβRI reseptör Smads fosforilleyerek (R-Smads), yani Smad2 ve Smad3, onun hücre içi kanonik sinyal yolağı başlatır. Bu aktive R-Smads çekirdeğinde birikir ve hedef genlerin ⁵ transkripsiyonunu düzenleyen Smad4 heteromeric kompleksleri oluşturur. Buna ek olarak, daha önce described smad yolu olmayan bazı smad sinyalizasyon yolaklar aktivasyonu reseptör aktivasyonu sonuçları, örneğin Mitojen Protein Kinaz (MAPK) ⁶ yolakları.

Meme kanseri farklı aşamalarında TGF-β rolünü araştırmak için, biz MCF10A hücre sistemi kullanmak yaptı. Bu sistem kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A1 (M1), meme epitel hücreleri ⁷ oluşur, H-RAS farelerde ⁸ premalign lezyonları M1 türev MCF10AneoT (M2), ve gelen kurulmuştur M2 türev MCF10CA1a (M4) dönüştürdü M2 xenografts ve formlar ⁹ akciğer metastaz yeteneği ile yüksek dereceli karsinomlar. Bu MCF10A serisi hücre yanıtları farklı bir genetik arka önyargılı değildir malignite farklı sınıflarda eğitim imkanı sunuyor.

TGF-β indüklenen işgalinin analizi için, biz homotypic MCF10A sfero hücre kültürleri embe oluşturulan3D kollajen matriks in vitro (Şekil 1) dded. Bu modelleri yakından sfero ¹⁰ iç hatta dış nekrotik ve latent veya hücreleri üzerinde aktif ve invaziv hücrelerinde oksijen ve besin maddelerinin bir degrade kurarak in vivo insan tümörleri andırır. Sfero bazlı çalışmaları da tek tabaka kültürler ¹¹ ilaç direnci daha iyi özetlemek için gösterilmiştir. Bu MCF10 3D model sistem malignite farklı aşamalarında meme hücrelerinin invaziv özelliklerini TGF-β sinyal etkisini araştırmak için izin verdi.

Protokol

1. Methocel çözüm Hazırlama (500 mL)

1. Bir manyetik karıştırıcı içeren 500 ml şişe metilselüloz Otoklav 6 gr.
2. 20 dakika, önceden ısıtılmış DMEM/F12 250 ml serum (60 ° C) olmadan metilselüloz çözülür.
3. DMEM/F12 (RT),% 10 at serumu içeren 250 ml ekleyin. Mix gecede (4 ° C).
4. Santrifüj (5000g, 2h, 4 ° C) çözüm temizleyin.
5. Yeni bir tüp (stok solüsyonu yaklaşık% 90-95) açık oldukça viskoz bir çözüm atın.
6. Mağaza, 4 ° C kullanana kadar.

2. Sfero kültür

1. % 20 methocel solüsyonu (10 ml methocel ve 40 ml besi) hazırlayın.
2. Hücreler PBS ile iki kez yıkayın, 37 yaşında%....

Tartışma

Biz MCF10A1 hücreleri ve malign türevleri TGF-β bağımlı bir şekilde bir kollajen matriks içine işgal sfero bir model oluşturdu. Birincisi, parçacıklarının metilselüloz varlığı 96-kuyular yuvarlak alt süspansiyon plakaları oluşur. Tabii ki, aynı zamanda U-şekilli poli-HEMA kaplı plakaları bu amaç için kullanılabilir. Hücreler metilselüloz yokluğunda ölecek beri Metilselüloz kesinlikle, bu adım gereklidir. Hücreler bu faktör kolajen orta op üst eklendiğinde TGF-β daha iyi cevap verdiğini bulundu beri TGF-β kollajen methoc.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Metil selüloz	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Gelişmiş BioMatrix	5005-B
pH indikatörü şeritleri	Merck	9533
96-iyi süspansiyon plakalar	Greiner Bio-one	650 (185)
TC yapışma 96-well plakalar	Greiner Bio-one	655 180