Summary
MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 다양한 생물 학적 과정에서 역할을 보여왔다. 더 miRNA - UTR의 상호 작용을 이해하기 위해서, 우리는 소설 루시페라제 유전자와 분석 시약, LightSwitch 시스템과 결합하여 3 UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다.
Abstract
MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 많은 생물 학적 과정에 역할을한다. 700 명 이상 인간 miRNAs는 각각 고유한 대상 mRNAs 수백까지 발생과 함께 지금까지 발견되었습니다. 전산 도구, 표현 및 proteomics assays, 그리고 염색질 - immunoprecipitation 기반 기술은 특정 miRNA의 직접적인 목표물 mRNAs을 확인하는 중요한 단서를 제공합니다. 그들이 기능 증거를 제공하고 셀 기반 시스템에서 특정 miRNA - 3'UTR 상호 작용의 영향을 quantitate 때문에 또한, 3'UTR - 기자 assays는 철저한 miRNA 대상 연구의 중요한 구성 요소가되고 있습니다. 활용 3'UTR - 기자 assays에 더 많은 연구를 활성화하고 규모 업 높은 처리량 수준에 이러한 assays의를 지원하기 위해, 우리는 고도로 최적화된 LightSwitch의 루시페라제 인간의 3'UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다 분석 시스템. 또한이 시스템은 긍정적인 컨트롤, 다양한 내생 3'UTR 기자의 구성, 그리고 표준화된 실험 프로토콜의 시리즈로 사용하기 위해 합성 miRNA 목표 기자의 구조를 포함합니다.
여기서 우리는 miRNA, 효율적인 재현성, 높은 처리량 분석 의무는 것을 모방과 함께 개별 3'UTR - 기자 구성 요소의 공동 transfection하는 방법을 설명합니다.
Protocol
소개
MicroRNAs는 많은 중요한 생물 학적 과정의 활동을 조절 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했습니다. 700 명 이상 인간 miRNAs 지금까지 1 확인을 통해, 그것은 변이와 miRNAs의 부적 절한 규제가 이러한 암, 심장 질환 2,3 등 생리 장애의 다양한 연결되었다는 놀라운 일이 아닙니다. 최근 연구는 miRNA 규제 바인딩 사이트의 대다수가 3'UTRs 4,5에서 발견되는 것으로 나타났습니다, 일부 연구자들은 세포 6 miRNA마다 대상의 수백이있다는 것을 예상했습니다. miRNAs의 생물 학적 중요성을 감안할 때, 존재 miRNAs하고 각각에 대한 대상의 다수의 다수가, 그것은 연구자들이 안정적으로 선호 높은 처리량 연구 의무 플랫폼에서 miRNAs의 내생적인 목표를 식별 수있는 것이 중요합니다.
miRBase, TargetScan 및 PicTar 1,6,7와 같은 전산 도구를 이용해도 miRNA에 대한 putative mRNA 목표의리스트를 생성하는 강력한 방법이지만, 예측은 아직 혼자 8시 의존 수있을 정도로 정확하지 않습니다. 따라서, 연구자들은 또한 목표 드 노보를 식별하거나 예측 목표를 확인하는 실험 방법의 숫자를 활용. 많은 팀들은 표현의 변화가 miRNA 활동 때 4,9,10를 불안정하게된다 는걸 알수있는 유전자를 식별하는 정상 상태 mRNA 또는 단백질 수준의 높은 처리량 측정에 의존합니다. 이러한 변화는 그러나 성적표 및 간접 또는 스트림 신호 효과에 miRNA의 직접적인 효과를 구분하지 않는 전반적인 표현의 변화를 측정, 의심의 여지가 생물 학적 의미 있고 중요한 첫 단계를 나타냅니다. 직접 miRNA - mRNA의 상호 작용에 대한 증거를 제공하는 다른 강력한 도구 miRNAs과 mRNAs로 상호 연결 argonaute 단백질은 (그리고 따라서 RISC 복합), 상호 작용하는 파트너를 식별하지만 즉시 기능 효과를 나타내는하지 않는 염색질 - immunoprecipitation (칩) 전략 아르 이러한 바인딩 이벤트 5,11니다. 따라서, 특정 UTR에서 miRNA의 효과에 대한 증거를 제공하는 기능 3'UTR - 기자 assays는 철저한 miRNA 연구의 중요한 구성 요소가되고 있습니다. 계산 대상 예측이나 표현 및 proteomics 데이터와 함께 찍은 이러한 세포 기반 분석 데이터는 특정 3'UTR 직접 관심의 miRNA에 의해 규제되어 강력한 증거를 제공합니다.
3'UTR - 기자 분석에서 관심의 유전자에서 3'UTR은 루시페라제 리포터 유전자의 끝에 융합이다. 3'UTR가 miRNA의 표적 경우, 기자의 성적표 안정성 및 / 또는 변환 효율은 기능적 miRNA 농도의 변화와 함께 변경됩니다. 그래서 성적 증명서 전용 기반 assays와는 달리 기자 assays는 안정 상태 mRNA와 단백질 수준 모두에 영향을 식별하는 데 도움이. 리포터 시스템은 또한 실제로 interaction8에 필요한 확인 3'UTR에 putative miRNA 바인딩 사이트를 mutagenizing의 기능 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 표현 배열, proteomics 기술과 argonaute 칩을 사용하는 대규모 연구 실험 조건, 셀 기반의 기자 assays 소수를위한 귀중한 게놈 - 광범위한 데이터를 제공하는 동안 그리고 miRNA - 3 '의 연구를 위해 스케일링 최대 가장 의무 아르 같은 조건의 수백 또는 수천 UTR의 상호 작용은 작은 분자 또는 다른 라이브러리를 기반 effectors의 높은 처리량 검사에 필요한 될 수 있습니다.
많은 과학자들은 miRNA - 3'UTR 상호 작용의 연구에 기자 분석 기술을 적용했습니다. 그러나 많은 miRNAs 다양한 성적의 각 대상 수백, 그것은 높은 처리량 규모의이 강력한 접근 방식을 활용하는 연구자에 대한 어려운 것으로 생각 다른 수천 만들기위한 복제, 검증 및 최적화 단계 때문에 3'UTR을 기자 벡터는 종종 금지 비용입니다. 소형 및 대형 3'UTR - 기자 공부하는 연구자에 액세스할 수를 만들기 위해 노력의 일환으로, 우리는 인간 3'UTRs 높은 최적화된 LightSwitch 루시페라제 분석 시스템에 미리 복제의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다. 기자 시스템은 검증된 제어 벡터, 긍정적인 컨트롤로 사용하기 위해 700 명 이상 합성 miRNA 목표 기자 구성 요소의 집합과 표준 실험 프로토콜의 시리즈를 포함하고 있습니다.
다음과 같은 프로토콜을 사용하여 특정 인간 3'UTR 관심의 miRNA의 대상인지 여부를 요청할 수 있습니다. 이 워크플로우의 중요한 단계는 실험 설계, 기자의 구성 및 miRNA 싫어하지의 transfection, 루시페라제 리포터 assays, 데이터 분석입니다. 실험 디자인, 그것은 신중 transfectable 세포주, 실험 및 제어 기자의 구성 및 miRNA의 모방이 아닌 타겟팅 컨트롤을 선택 중요합니다. 일반적인 높은 transfectable adhHT1080, HepG2 같은 erent 셀 라인, HCT - 116, HELA, 293, 그리고 다른 사람들은 종종이 프로토콜과 함께 잘 작동합니다.
실험 디자인에 관한 중요 사항
LightSwitch 루시페라제 분석 시스템 RenSP 루시페라제 유전자와 LightSwitch 루시페라제 분석 시약을 이용한 GoClone 구조를 포함하고있는 완벽하게 최적화된 리포터 시스템입니다. 로 최적의 기자 분석 결과를 얻기 위해 권장 LightSwitch 시스템의 모든 구성 요소를 사용합니다.
개폐 GoClone 기자 구성 요소가있는 모든 oligos / plasmids의 공동 transfection이 아닌 특정 방식으로 전체 루시페라제 신호를 감소시킵니다. 따라서 다음과 transfection 조합을 수행하는 것이 중요하다 : 기자뿐만 아니라, 기자가 +가 아닌 타겟 제어 miRNA, 그리고 기자 + 특정 miRNA.
우리 empty_3UTR 벡터는 (강력한 발기인, 아니 UTR) 루시페라제 신호의 매우 높은 수준을 제공하며, transfection 효율을위한 긍정적인 컨트롤 역할을하며, 합성 miRNA 목표 기자 벡터는 활동을 모방에 대한 긍정적인 제어 역할을 수 있습니다. 또한, 우리는 정확하게 순서대로 특정 대 비 특정 효과를 분리를위한 GoClone 3'UTR의 가사 컨트롤 및 임의의 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다.
귀하의 프로토콜과 가능한 마스터 pipetting 오류 또는 증발로 인해 데이터의 다양성을 감소 믹스 확인을 공부합니다.
이 프로토콜은 DharmaFect 듀오 transfection 시약 (Dharmacon)를 사용합니다.
1 일
중요 팁 : 현명하게 셀 라인을 선택합니다. 최상의 결과를 얻으려면, transfectable 할수 있는것으로 알려져있는 세포 라인을 사용합니다. 우리는 또한 miRNA로 3 'UTR 기자의 측정 반응은 특정 miRNA 높은 내생 수준 셀 라인에 감쇠는 모방 것으로 나타났습니다. 많은 휴대 라인 표현 miRNA 방법을 모르는 경우, 간접적으로 세포뿐만 아니라 분석의 동적 범위로 알려주에서 특정 miRNA의 풍부한를 측정 SGG의 합성 microRNA 타겟을 시도해보십시오.
1. 종자 세포는 transfection시 ≥ 80 % 합류를 얻을 수 있습니다.
- 100μl 전체 볼륨의 96 - 웰 화이트 TC 플레이트의 씨앗 세포.
- 병렬, 종자에 합류 평가에 대한 명확한 96 - 웰 플레이트에 세포의 적절한 수입니다.
중요 팁 : 1 합류는 모방 실험 좋은 결과를 달성하는 열쇠입니다. 최적의 최저 들어, 세포는 transfection시 100 % 합류한다.
중요 팁 2 : 최상의 결과 낮은 통로 전지를 사용합니다. 많이 passaged되었습니다 세포는 시끄러운 transfection 데이터를 얻을하는 경향이 있습니다.
날 2
GoClonereporter 구조와 miRNAs 준비 후 합류 세포에 transfect.
2. 구성 준비
- 실온에서 해동의 GoClone 구조 (플라스미드 DNA). 잘 섞는다.
- 뚜껑에서 결로를 제거하는 원심 분리기.
3. 마이크로 RNAs 준비
- 실내 온도와 뚜껑의 결로를 제거하는 원심 분리기에 해동의 microRNAs (특정 모방이 아닌 타겟팅 컨트롤).
- RNase없는 물 2 μm의의 작업 농도로 희석.
실험 miRNA 이외에 항상 비 타겟팅 miRNA 제어를 포함 모방. 공동 transfecting 플라스미드과 작은 RNA oligo 혼자 플라스미드를 transfecting보다 낮은 신호를 발생합니다.
하나 이상의 긍정적인 컨트롤을 포함합니다. SGG의 카탈로그에 합성 miRNA 목표 기자 벡터의 수백 중 하나를 사용하여 고려하십시오.
하나 이상의 음수 또는 이외의 특정 컨트롤을 포함합니다. SGG는 가사 유전자, 임의의 조각 및 / 또는 빈 (NO UTR 삽입) 제어 3 'UTRs 포함하여 컨트롤의 범위를하고 있습니다. 실험 구성과 함께 이러한 컨트롤 중 하나 이상의 사용은 특정 miRNA 또는 비 대상 컨트롤의 overexpression에 기인하지 않은 특정 효과에 대한 정상화 수 있습니다.
4. Transfections 준비
- 각각의 transfection에 대해 하나의 분석을 위해 다음과 같은 시약을 결합 :
혼합 1
| 개인 GoClone 기자 : | 3.33 μL |
| microRNA : | *이 다름 |
| 세럼 - 무료 미디어 : | 10 μL에 |
miRNA의 * 효과적인 농도는 10 NM - 100 nm의에서 다를 수 있습니다. 적절한 농도에 대한 miRNA 제조 업체에 문의하십시오.
중요 팁 : 모방 너무 많이 추가하지 마십시오. 모방 농도에 대한 합리적인 범위는 최종 100uL 반응에 10-50 NM입니다.
적어도 세 복제를 수행테 각각의 치료 / UTR 조합에 대한 transfections하고 오류를 pipetting 수 있도록 추가적인 볼륨이 포함됩니다.
예를 들어, 오류 또는 증발을 pipetting에 대한 추가를 포함한 세 복제 transfection의 우물에 대한 충분한 transfection 믹스를 3.5으로 단일 반응 볼륨을 곱하면됩니다.
각 기자 들어, 다음에 대한 복제 설정 : 기자뿐만 아니라, 기자가 +가 아닌 타겟 제어 miRNA와 기자 + 특정 miRNA.
비 타겟 제어 것과 동시에 타겟팅 microRNA에 대한 transfections를 설정합니다.
- DharmaFECT DUO (Dharmacon) 혼합물이 각 transfection에 대해 다음과 메이크업 :
혼합물이
| DharmaFect 듀오 : | 0.15 μL |
| 세럼 무료 미디어 : | 9.85 μL |
추가할 수 DharmaFECT 듀오의 양은 의존 세포 라인 수 있습니다.
위의 금액 표시는 HT1080 세포에 적합하고 있습니다.
휴대 라인에 해당하는 금액을 결정하기 위해 제조 업체의 설명서를 참조하십시오.
팁 : 기자의 숫자로 위의 볼륨을 곱하여 대형 transfection 혼합물을 만들고, 수가 복제 및 miRNAs의 수가 테스트합니다. 준비 transfection 믹스의 양을 계산할 때, 오류 및 증발을 pipetting을위한 계정을 추가 소량을 포함해야합니다.
- DharmaFECT 듀오 혼합 5 분 동안 상온에서 부화 수 있습니다.
- 5 분 후에, 10uL 플라스미드 및 / 또는 miRNA (혼합 1) 각각의 준비 튜브에 DharmaFECT 듀오 혼합물 (혼합 2) 10μL를 추가합니다. 각각의 튜브 다음 복제 transfection 당 20μL의 볼륨을 포함해야합니다.
- 상온에서 20 분 동안 각 혼합물을 품어.
- 20 분정도 후에 복제 transfection 당 100μL 총 각 튜브에 복제마다 미리 예열 (37 ° C), 항생제없는, 전체 미디어의 80 μL를 추가합니다. 깊이 잘 블록은 많은 사람들이 동시에를 복제 및 샘플의 준비를 위해 사용할 수 있습니다. 최대 pipetting 아래로 솔루션을 섞는다.
- 인큐베이터에서 씨앗을 품고 플레이트를 제거합니다. 세포가 적어도 80 % 합류되어 있는지 확인합니다.
- 각 우물에서 언론에서 조심스럽게 pipet.
- 각각 잘 수있는 transfection 혼합물 (20uL DNA / 시약 믹스 + 80uL 미디어)의 100μL를 추가합니다.
- 하룻밤 인큐베이터에 넣어 판.
오버 부화하지 마십시오. 대부분의 모방은 24 시간 이내에 타고난 대상에 대한 의미있는 결과를 생산합니다. 48 시간 측정 억압의 수준보다 수도 있지만 잘 변화에 잘됩니다.
모방 실험 억제제 실험을보다 쉽게하고 있습니다. 대부분의 모방은 크게 24 시간 이내에 진정한 목표를 주체할 수 있지만 억제제에 기인 드 억압 중대한 변화는 측정하는 48 시간 정도 걸릴 수 있으며, 거의 항상 모방의 효과보다 발음됩니다.
3 일
참고 : 루시페라제 assays 즉시 실시하거나 접시가 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C (동결은 일반적으로 세포 용해와 루시페라제 신호를 증가). 고정 및 최상의 결과를 얻으려면 시금하기 전에 세포를 녹여.
LightSwitch 분석 시약을 추가하기 전에 실내 온도에 동결 세포의 해동을하게해야합니다.
5. LightSwitch AssayReagents로 측정 루시페라제 활동
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 실내 온도에 가져와.
- LightSwitch 분석의 시약을 (LS010 키트에 대한 다른 키트 크기의 프로토콜을 온라인으로 찾을 수 있습니다) 준비 :
- 동결 건조된 분석 기판의 튜브에 솔벤트 기판의 100μL를 추가하여 Reconstitute 100X 기판. 빛으로부터 보호하고 실온에서 시간을 최소화. 100X 기판 2-3주을위한 - 20C에 저장된 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 재구성 기판을 사용합니다.
- 상온의 물을 욕조에서 분석 버퍼의 10mL 병을 해동하여 분석 솔루션을 준비하고 사용하기 전에 재구성 100X 기판의 100μL를 추가합니다. 잘 섞는다.
- 직접 화이트 96 - 웰 플레이트에 잘 각 샘플 (100uL 세포 + 미디어를 포함)에 100μL LightSwitch 분석 솔루션 (버퍼 + 기판)을 추가하는 멀티 채널 pipettor을 사용합니다. 전지는 다른 판이나 플라스크 형식, 전송 샘플에서 재배면 100μL 총 볼륨 (미디어 또는 PBS)에 흰색 96 - 웰 플레이트에.
- 플레이트 커버, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 30 분 알을 품다. 하나 이상의 접시를 시금 경우 각 접시 읽기 전에 30 분 incubates 있도록 분석 솔루션의 추가 서다.
- 접시 lumi 2 초 동안 각 잘 읽어nometer (SpectraMax L 또는 동급).
- (발광은 = 특정 miRNA / 제어를하지 않는 타겟) 이외의 타겟팅 제어할 특정 miRNA에 대한 각 구성에 대한 루시페라제 신호 비율을 계산하여 최저를 계산합니다. 비 UTR 특정 치료 효과에 대한 제어 임의의 가사, 그리고 빈 구조에서 데이터를 사용합니다.
대표 결과
대상으로 miRNA의 존재에 3'UTR 목표는 루시페라제 최저를 보여줍니다.
하자 - 7A로 3'UTR - 루시페라제 리포터 활동의 최저는 다음 발광 기자를 읽고, 24 시간 동안 잠복기, 20nM 보자 - 7A 모방하거나 비 타겟팅 제어 구조 각 기자의 공동 transfecting 100ng로 HT1080 세포로 측정되었다 LightSwitch 루시페라제 분석 시약을 사용하여 신호.
그림 1. PUNC 및 ARID3B 인간 3'UTRs의하자 - 7A microRNA의 목표입니다. PUNC 및 ARID3B 유전자에 대한 인간의 3'UTR 기자의 신호가 크게 보자 - 7A microRNA의 존재에 무너뜨렸다하는 것은 모방하면서 가사와 임의의 시퀀스에 대한 신호 UTRs가 없습니다.
Discussion
우리는 살아있는 세포에서 miRNA - 3'UTR 상호 작용 연구를 활성화하기 위해 사전에 복제된 인간 3'UTR - 기자 구성 요소의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다. 여기 루시페라제 기자 시스템을 사용 3'UTR - 기자 공동 transfecting miRNA 싫어하지에 대한 재현성 및 높은 처리량 방법을 보여주었다.
이 방법은 높은 transfectable 세포 라인을 사용하고 overexpression 기술과 miRNA 활동을 perturbing 연구에 의존합니다. 저조한 transfectable 세포 라인을 사용하는 연구자들은 시그마 (미션 3'UTR Lenti GoClones)와 함께 만든 우리의 동반자 lentiviral 3'UTR - 기자 컬렉션을 사용하는 것이 좋습니다. miRNA와 세포를 치료하면 overexpression 타입 실험 결과를 모방하고, 그러한 연구와 연구자들은 이것이 아니면 실제 생리 조건을 대표하지 않을 수 있습니다 수도 고려합니다. overexpression의 문제를 해결하기 위해, 연구자들은 섭동 12-14의 두 가지 종류의 상호 작용을 연구하기 위해 모방 이외에 miRNA 억제제를 사용할 수 있습니다.
일단 가능성이 miRNA 목표를 식별, 연구진은 사이트가 기능적 상호 작용에 필요한 있는지 여부를 확인하기 위해 putative miRNA 바인딩 사이트를 mutagenize하실 수 있습니다. 그들은 또한 다른 잠재적인 대상 UTRs (Boutz)의 수백을 테스트까지 확장하실 수 있습니다. 연구진은 miRNA가 성적표 안정성 또는 변환 효율에 영향을 미치는 것인 지에 관심이있다면 또한, 루시페라제 리포터 데이터가 정상 상태 증명서 수준의 조치에 비해 수 있습니다. 사본 레벨에 비례 변화와 관련되지 않습니다 루시페라제 신호에 변화가 번역의 효율성에 영향을 가리킨 것입니다. 마지막으로, 연구진은 miRNA 농도 14 변화에 다른 UTRs의 상대 감도를 비교하는 기자 벡터가 선량 반응 곡선을 만들 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는이 문서에 나타나는 도구 및 시약을 개폐 장치의 지노 믹스의 직원입니다. 이 문서의 생산은 스위치의 지노 믹스에 의해 후원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) | VWR international | 82050-736 | |
| Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid | VWR international | 353072 | |
| LightSwitch Luciferase Assay Reagent |  SwitchGear |
LS010 | |
| DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) | Dharmacon | T-2010-02 | |
| Foil Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T592100 | |
| Breathable Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T896100-S | |
| Plate Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L |
References
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