Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

उत्पादन और पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर Titering

Published: November 27, 2011 doi: 10.3791/3348
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, 2Translational Neuroscience Facility and Department of Physiology, School of Medical Sciences, University of New South Wales, 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

पुनः संयोजक एडिनो - जुड़े वायरस वैक्टर (rAAVs) तेजी से मूल्यवान होते जा रहे हैं

Abstract

हाल के वर्षों में पुनः संयोजक एडिनो - जुड़े वायरल vectors (AAV) पशुओं में vivo अध्ययन में के लिए तेजी से मूल्यवान बन गए हैं, और वर्तमान में भी मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा है . जंगली - प्रकार AAV parvoviridae परिवार के एक सदस्य गैर रोगजनक और प्रतिकृति की कमी स्वाभाविक है. व्यापक पारगमन प्रोफ़ाइल, कम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मजबूत और लगातार transgene ये वैक्टर के साथ हासिल की अभिव्यक्ति के लिए इन विट्रो में और vivo में जीन वितरण में उन्हें एक लोकप्रिय और बहुमुखी उपकरण बना दिया है. rAAVs आसानी से और सस्ते प्रयोगशाला में उत्पादित और उनके अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल के आधार पर किया जा सकता है, आम तौर पर एक कम सुरक्षा वर्गीकरण दिया जाता है. यहाँ, हम और दोनों AAV1 और AAV2 के capsid प्रोटीन युक्त chimeric rAAVs के उत्पादन titering लिए एक विधि का वर्णन. इन तथाकथित chimeric वैक्टर के उपयोग के उच्च titres (AAV1) शेयरों और शुद्धि के रूप में दोनों माता पिता सीरमप्रकारों के लाभों को जोड़ती हैआत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (AAV2) के द्वारा. ये AAV सीरमप्रकारों सभी AAV सीरमप्रकारों के अध्ययन का सबसे अच्छा कर रहे हैं, और व्यक्तिगत रूप से एक व्यापक संक्रामकता पैटर्न है. यहाँ वर्णित chimeric वैक्टर AAV1 और AAV2 के संक्रामक गुण है और इस प्रकार न्यूरॉन्स, कंकाल की मांसपेशी, अग्न्याशय, दूसरों के बीच में गुर्दे सहित, ऊतकों की एक बड़ी रेंज को संक्रमित उम्मीद की जा सकती चाहिए. विधि यहाँ वर्णित हेपरिन स्तंभ शुद्धि का उपयोग करता है, एक विधि के लिए एक उच्च वायरल और एक सीज़ियम क्लोराइड ढाल के माध्यम से centrifugation के रूप में अन्य शुद्धि विधियों, की तुलना में क्लीनर वायरल तैयारी अनुमापांक दे माना जाता है. इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे इन वैक्टर जल्दी और आसानी से हो सकता है संक्रामक कणों की संख्या का सटीक पढ़ने देना titered कर सकते हैं.

Protocol

एक निम्न प्रोटोकॉल के सारांश दृष्टांत के चित्रा 1 देखें.

सुरक्षा नोट: सभी सामग्री है कि इकट्ठे वायरल कणों के साथ संपर्क में किया गया है Virkon समाधान या अन्य उपयुक्त निस्संक्रामक के साथ कीटाणुरहित की जरूरत है.

1. प्लास्मिड डीएनए स्टॉक (~ 2 दिन) की तैयारी

  1. निम्नलिखित plasmids 1 आवश्यक हैं:
    • pRV1 - AAV2 प्रतिनिधि और कैप दृश्यों युक्त
    • pH21 - AAV1 प्रतिनिधि और कैप दृश्यों से युक्त
    • pFdelta6 - Adenovirus सहायक प्लाज्मिड
    • प्लाज्मिड AAV पुनः संयोजक अभिव्यक्ति AAV2 पैकेजिंग संकेतों (औंधा टर्मिनल को दोहराता है, ITRS) द्वारा flanked कैसेट युक्त
  2. जबकि pFdelta6 Stbl2 सक्षम कोशिकाओं में विकसित किया जाना चाहिए आंशिक विलोपन को रोकने के लिए, और pH21 pRV1 DH5alpha सक्षम कोशिकाओं में उगाया जा सकता है है. AAV plasmids Stbl2 कोशिकाओं में उगाया जा सकता है है अगर आंशिक विलोपन DH5alpha कोशिकाओं में पाए जाते हैं.
  3. प्लास्मिड डीएनए उच्च गुणवत्ता और आरएनए contaminants के मुक्त होना चाहिए. प्लास्मिड निम्न का उपयोग हज़म अखंडता के लिए जांच की जा सकती है:
    • pRV1 - XbaI साथ पचाने में 7.5 केबी और 3.8 केबी के बैंड देने के लिए
    • pH21 - EcoRI साथ पचाने में 4.5 केबी के बैंड, केबी 2.8 और 0.2 केबी देने के लिए
    • pFdelta6 - HindIII साथ पचाने में 5.5 केबी के बैंड, 3 केबी, केबी 3, 2.3 केबी और 1.5 केबी देने के लिए

2. (- 3 दिन 2) मानव भ्रूणीय 293 गुर्दा (Hek293) कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए तैयार

  1. प्लेट दो 80% सहधारा 150 सेमी पांच 15 सेमी व्यास Nunc ऊतक संस्कृति बर्तन में Hek293 कोशिकाओं के 2 बोतल. कक्ष 70 - 80% होना चाहिए अभिकर्मक (चढ़ाना के बाद लगभग 48 घंटे) से पहले मिला हुआ. मानक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में कम ग्लूकोज के साथ संस्कृति कोशिकाओं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त.
  2. अभिकर्मक 3 घंटे पहले DMEM हटाने और Iscove के साथ की जगह'एस संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM) 5% युक्त भ्रूण बछड़ा सीरम.

3. वायरल plasmids के अभिकर्मक (~ अभिकर्मक के लिए 1 घंटे, 3 दिनों के लिए ऊष्मायन)

  1. वायरस (5 x 15 सेमी टिशू कल्चर प्लेटें) की एक ही बैच के लिए निम्न तैयार:
    • 62.5 μg प्लाज्मिड AAV
    • 125 pFdelta6 μg
    • 31.25 pRV1 μg
    • 31.25 pH21 μg
    • 1650 μl 2.5 एम CaCl 2
    • 12 मिलीलीटर DH 2 हे
  2. एक वर्ग 2 ऊतक एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में संस्कृति हुड बाँझ फिल्टर अभिकर्मक मिश्रण.
  3. Whilst समाधान vortexing, जल्दी 2 एक्स HEPES के 13 मिलीलीटर जोड़ने खारा buffered (7.05 पीएच). 50 मिलीलीटर ट्यूब के ढक्कन को बदलें और 15 सेकंड के लिए भंवर जारी रखने के लिए. 1 मिनट 45 सेकंड के लिए खड़े करने के लिए छोड़ दो, ठीक सफेद वेग फार्म चाहिए.
  4. धीरे प्रत्येक 15 सेमी टिशू कल्चर पकवान अभिकर्मक समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ने. भंवर प्लेटें और मिश्रण इनक्यूबेटर पर लौटने.
  5. अभिकर्मक के बाद 16 घंटे IMDM मध्यम हटाने और DMEM के साथ की जगह.

4. कोशिकाओं के lysing और rAAVs की कटाई (2 घंटे)

  1. अभिकर्मक के बाद 72 घंटे, सेल संस्कृति प्लेटों से मीडिया को हटाने और त्यागें. सभी बेकार Virkon समाधान या अन्य उपयुक्त निस्संक्रामक के साथ इलाज किया जाना चाहिए.
  2. धीरे गर्म 1x फॉस्फेट में कोशिकाओं धोने खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) buffered.
  3. प्रत्येक थाली करने के लिए 25 मिलीलीटर गर्म पीबीएस जोड़ें और धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को हटाने. 50 मिलीलीटर की नलियों में निलंबन लीजिए.
  4. 10 मिनट के लिए 800 XG पर गोली कोशिकाओं.
  5. 150 NaCl मिमी, 20 मिमी Tris 8.0 पीएच में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें, टिशू कल्चर प्लेट प्रति 10 मिलीलीटर का उपयोग करें. दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों में भाजित.
  6. DH 2 ओ में 10% सोडियम deoxycholate की एक ताजा समाधान तैयार प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए इस का 1.25 मिलीलीटर जोड़ें. मिलीलीटर प्रति 50 इकाइयों के अंतिम एकाग्रता benzonase nuclease जोड़ें. ट्यूब अच्छी तरह मिक्स.
  7. 15 मिनट के लिए 3000 XG centrifuging सेलुलर मलबे निकालें. ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए, सभी सेल मलबे हेपरिन स्तंभों के अवरुद्ध को रोकने के (देखें चरण 5) हटा दिया गया है. इस स्तर पर जारी रखने से पहले नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. हम संक्रामकता में कमी के बिना -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए नमूने संग्रहीत है.

5. हेपरिन स्तंभ rAAVs की शुद्धि (2 - 3 घंटे)

  1. सेटअप HiTrap हेपरिन 5,4 5,2 कदम के लिए प्रति मिनट 1 मिलीलीटर पर स्तंभ के माध्यम से इतना है कि समाधान प्रवाह एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर स्तंभों. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कोई हवाई बुलबुले हेपरिन स्तंभ में पेश कर रहे हैं.
  2. 10 मिलीलीटर, 150 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0 के साथ स्तंभ समभार बनाना.
  3. कॉलम को 50 मिलीलीटर वायरस समाधान लागू करें और के माध्यम से प्रवाह की अनुमति है.
  4. 20 मिलीलीटर, 100 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0 के साथ स्तंभ धो लें.
  5. 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए स्तंभ w धोने जारीith 1 मिलीलीटर 200 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0, 1 मिलीलीटर, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0 द्वारा पीछा किया. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  6. स्तंभ से लागू करने के द्वारा 5 मिलीलीटर सीरिंज और कोमल दबाव elute वायरस का प्रयोग:
    • 1.5 मिलीलीटर, 400 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0
    • 3.0 मिलीलीटर 450 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0
    • 1.5 मिलीलीटर, 500 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, पीएच 8.0
    • एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इन लीजिए.

6. एकाग्रता और rAAVs की बाँझ छानने का काम (1 घंटा)

  1. एक 100.000 आणविक वजन cutoff के साथ Amicon अल्ट्रा-4 केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग वेक्टर ध्यान लगाओ. 2 मिनट (कमरे के तापमान पर) के लिए 2000 XG पर concentrator और अपकेंद्रित्र में स्तंभ eluate के 4 मिलीलीटर लोड. Flowthrough और शेष वायरस समाधान और दोहराने centrifugation के साथ पुनः लोड concentrator त्यागें. केंद्रित मात्रा लगभग 250 μl होना चाहिए. यदि केंद्रित मात्रा काफी इस से अधिक है, प्रवाह टी त्यागेंhrough और एक मिनट के चरणों में अपकेंद्रित्र जब तक मात्रा लगभग 250 μl जारी है.
  2. वायरस के लिए 500 μl के अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस की 250 μl जोड़ें concentrator से हटाने.
  3. एक 13 मिमी व्यास 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर सदिश. वेक्टर और aliquoted होना चाहिए संग्रहीत -80 पर डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक है.

7. वायरल शेयरों की Titering (3 दिन)

यह एक प्रमोटर है कि एक पत्रकार जीन या एक immunocytochemically detectable जीन उत्पाद ड्राइविंग Hek293 कोशिकाओं में सक्रिय है आवश्यकता है. जब एक सदिश है कि संगत के साथ Hek293 कोशिकाओं अन्य सेल लाइनों या प्राथमिक सेल संस्कृतियों का इस्तेमाल किया जा सकता है नहीं है का निर्माण किया.

  1. 50% सहधारा - बोने Hek293 कोशिकाओं ताकि वे 40 से 18 पाली एल lysine लेपित गिलास coverslips या Nunc चैम्बर स्लाइड्स के 18 कुओं तैयार करें. Cre पर निर्भर rAAVs के अनुमापन के लिए कि stably व्यक्त Cre 2 recombinase Hek293 कोशिकाओं का उपयोग करें.
  2. प्रत्येक धारावाहिक घ के साथ अच्छी तरह से संक्रमितAAV वेक्टर (2A चित्र) के ilutions. कमजोर पड़ने प्रति 3 कुओं का उपयोग करें. हम नियमित वायरस सीधे जोड़ने के प्रत्येक अच्छी तरह से.
  3. 72 घंटे के बाद मध्यम करने के लिए कमरे के तापमान पर दस मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के एक बराबर मात्रा (पीएफए) (2% पीएफए ​​के अंतिम एकाग्रता देने) जोड़ने के द्वारा Hek293 कोशिकाओं को ठीक.
  4. सेल में तीन बार धो PBS, DH 2 हे और coverslip में कुल्ला.
  5. तीन कुओं कि उच्चतम कमजोर पड़ने कारक है, से transduced कोशिकाओं की संख्या की गणना, लेकिन अभी भी संक्रमित कोशिकाओं को होते हैं, इनमें से औसत को खोजने के लिए और कमजोर पड़ने कारक द्वारा गुणा microliter प्रति संक्रामक इकाइयों (चित्र 2B) का नंबर दे.

8. प्रत्याशित परिणाम

Hek293 कोशिकाओं बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) चित्रा 2B में दिखाया गया है एक वायरस एन्कोडिंग के साथ transduced. हम आम तौर पर लगभग 6 x 10 माइक्रो प्रति लीटर 6 संक्रामक कणों के अनुरूप titers हासिल. हम नियमित stereotaxic inje के लिए इन वैक्टर का उपयोगवयस्क कृंतक मस्तिष्क में ction. यह क्षेत्र विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति 2 के लिए एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है . सेल प्रकार चुनिंदा जीन अभिव्यक्ति हम Cre ट्रांसजेनिक 2 चूहों के लक्ष्य क्षेत्रों में Cre recombinase निर्भर rAAVs इंजेक्षन के साथ इस क्षेत्र विशिष्टता गठबंधन . चित्रा 2C-ई वयस्क parvalbumin Cre ट्रांसजेनिक चूहों 3 अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में Cre पर निर्भर EGFP एन्कोडिंग rAAVs stereotaxic इंजेक्शन के उदाहरण से पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 rAAV उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध चित्रण. 1) Hek293 कोशिकाओं चढ़ाया और 70 हो गई है - 80% का संगम. 2) AAV और सहायक plasmids तैयार हैं और Hek293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट. 3) मध्यम वापस DMEM अभिकर्मक के बाद 16 घंटे के लिए बदल जाता है और Hek293 कोशिकाओं एक और 56 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं. 4.) Hek293 कोशिकाओं काटा और lysed. rAAV वैक्टर सेल मलबे से ग द्वारा अलग कर रहे हैंentrifugation. 5) वायरल कणों एकाग्रता और नसबंदी के पहले हेपरिन कॉलम के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं. 6) 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर Hek293 कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं और संक्रमित AAV वेक्टर के धारावाहिक dilutions के साथ संक्रामक इकाइयों की संख्या निर्धारित करने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2 और 2 / rAAV1 के vivo आवेदन में Titering. (ए) Hek293 कोशिकाओं के वायरल अनुमापांक को मापने के लिए सेटअप. Hek293 कोशिकाओं rAAVs के धारावाहिक dilutions के साथ transduced हैं. सी, असंक्रमित नियंत्रण, एन, undiluted वायरल शेयर की एक μl. (बी) EGFP व्यक्त rAAVs साथ Hek293 कोशिकाओं संक्रमित. (CE) वायरल EGFP अभिव्यक्ति के लिए प्रतिबंधित है Cre parvalbumin-Cre Cre सक्रिय rAAVs के stereotaxic इंजेक्शन के बाद ट्रांसजेनिक चूहों के अलग लक्ष्य क्षेत्रों में न्यूरॉन्स व्यक्त. उदाहरण छवियों (सी) जालीदार thalamus और globus pallidus में GFP immunoreactivity दिखाने के लिए, (डी) दांतेदार गाइरस और (ई) हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र. महानिदेशक डेntate गाइरस आरटी, जालीदार thalamic नाभिक; जीपी, globus pallidus. सलाखों के स्केल: बी, 500 सुक्ष्ममापी, सी, 100 सुक्ष्ममापी, डी, 100 सुक्ष्ममापी, ई, 500 सुक्ष्ममापी.

Discussion

rAAV वैक्टर पशुओं में vivo अध्ययन में तेजी के लिए मूल्यवान होते जा रहे हैं. यहाँ, हम उत्पादन rAAVs के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, जो कंपनियों को वायरस उत्पादन का महंगा आउटसोर्सिंग से बचने के द्वारा इस उपयोगी वेक्टर के व्यापक आवेदन की सुविधा हो सकती है. प्रोटोकॉल (1 संदर्भ पर आधारित) chimeric rAAV1 / 2 बराबर चार के अनुपात में दोनों माता पिता सीरमप्रकारों से capsid प्रोटीन युक्त वैक्टर के उत्पादन का वर्णन करता है. हेपरिन स्तंभों के लिए बाध्य द्वारा rAAV वैक्टर की शुद्धि AAV2 capsid प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, लेकिन AAV1 की तुलना में अन्य सीरमप्रकारों यहाँ उल्लिखित के साथ संयुक्त किया जा सकता है है. इसके अतिरिक्त, AAV6 हेपरिन करने के लिए बाध्य सूचित किया गया है, हालांकि एक कम आत्मीयता के साथ, और संभावित हेपरिन इस 5,6 प्रक्रिया का उपयोग कर स्तंभों के साथ शुद्ध किया जा सकता है है. लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य सीरमप्रकारों हेपरिन स्तंभ क्षालन 5,7 के लिए NaCl के विभिन्न सांद्रता की आवश्यकता होगी .

पैकेजिंग rAAV जीनोम 4.1 और 4.9 केबी के बीच पैकेजिंग दक्षता में एक तेज 5.2 8 केबी कमी के साथ इष्टतम हो दिखाया गया था. यह पैकेजिंग सीमा rAAV प्रणाली का सबसे बड़ा नुकसान माना जा सकता है, क्योंकि transgene अभिव्यक्ति की सेल प्रकार विशिष्ट विनियमन आम तौर पर बड़े सीआईएस अभिनय तत्व है जो छोटे AAV कणों के भीतर नहीं ठहराया जा सकता द्वारा हासिल की है. पैकेज जीन है कि AAV पैकिंग सीमा हम अलग वायरल एक 500 μl बैच में 250 μl केंद्रित बैचों के संयोजन कर रहे हैं पीबीएस जोड़ने के रूप में 6.3 चरण में उल्लिखित के बजाय, बंद कर रहे हैं करने का प्रयास करने से उत्पन्न उन के रूप में कम अनुमापांक बैचों, पर काबू पाने के लिए. विश्वसनीय सेल प्रकार विशिष्ट पारगमन संयोजन Cre ड्राइवर चूहों और सशर्त rAAV (नीचे देखें) कैसेट पैकेजिंग सीमा खींच से बचने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

ध्यान से, जबकि इस प्रोटोकॉल उच्च टी के उत्पादन पर आसान करने के लिए निर्देशों का पालन करें प्रदान करने का प्रयासआईटीईआर rAAV, यह हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि के लिए AAV2 capsid प्रोटीन moieties की उपस्थिति की आवश्यकता है. की तुलना में अन्य सीरमप्रकारों AAV2 वैकल्पिक प्रक्रियाओं 9 का उपयोग कर शुद्ध किया जाना चाहिए. हेपरिन स्तंभ शुद्धि का एक लाभ यह है यह AAV वैक्टर है कि अधिक से अधिक उत्पादित उन सीज़ियम क्लोराइड 10 ढाल का उपयोग की तुलना में संक्रामकता दर का उत्पादन माना जाता है. हालांकि, वहाँ भी इस विधि को कुछ कमियां हैं. उदाहरण के लिए, अन्य प्रोटीन है कि हेपरिन बाँध भी शुद्ध वायरल स्टॉक में मौजूद हो सकता है. जबकि हेपरिन शुद्ध वैक्टर tropism वेक्टर 10 अनुमापांक, विशेष रूप से उत्तेजक या तो 20 या निरोधात्मक न्यूरॉन्स (छवि 2) लक्ष्य हमारे दृष्टिकोण से प्रभावित किया जा सकता है है Cre प्रेरित AAV मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति के सक्रियण रोजगार और अनुमापांक स्वतंत्र है . हेपरिन स्तंभ शुद्धि के लिए एक वैकल्पिक एक iodixanol घनत्व ढाल है, जो एक उच्च वायरल अनुमापांक और के उपयोग की तुलना में purer तैयारी उत्पादन का उपयोगएक सीज़ियम क्लोराइड 10 ढाल. इस विधि भी हेपरिन स्तंभ शुद्धि के साथ जोड़ा जा सकता है के लिए एक वेक्टर है कि 99% शुद्ध 11 से अधिक है का उत्पादन. इसलिए सावधानी से विचार करने के लिए अलग - अलग समूहों द्वारा जो वायरल शुद्धि विधि उनके विशेष बहाव के आवेदन के लिए सबसे अच्छा है के रूप में लिया जाना चाहिए.

सबसे आम समस्या इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े कम वायरल अनुमापांक है. हमारे अनुभव में यह आम तौर पर कम अभिकर्मक दक्षता, या हेपरिन स्तंभों से वायरस के क्षालन पता लगाया जा सकता है. सभी अभिकर्मक सामग्री अभिकर्मक से पहले कमरे के तापमान पर हो सकता है, करना चाहिए और परीक्षण transfections प्रत्येक प्रयोगशाला में इष्टतम स्थितियों खोजने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. अभिकर्मक के अन्य तरीकों, lipofectamine जैसे, अत्यधिक कुशल हैं, लेकिन बेहद महंगा हो सकता है. इसके अतिरिक्त, एकाग्रता और हेपरिन स्तंभ क्षालन समाधान के पीएच हेपरिन स्तंभों witho से virions की पूरी क्षालन के लिए महत्वपूर्ण हैut नुकसान. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि पैकेजिंग की कोशिकाओं को अच्छी तरह से टिशू कल्चर व्यंजन की सतह का पालन करना होगा. यदि कोशिकाओं की प्रक्रिया के दौरान कुछ स्तर पर अलग प्रयोग और कोशिकाओं की नई शीशी defrost समाप्त करने की सलाह दी है.

कृन्तकों में transgene अभिव्यक्ति की spatio-अस्थायी नियंत्रण आसानी से सटीक संरचनात्मक लक्ष्यीकरण और जानवर के विकास मंच द्वारा हासिल की है. कुशल AAV की मध्यस्थता जीन हस्तांतरण 12,13 utero में दिखाया गया है. वयस्क दिमाग में, stereotaxic इंजेक्शन के बाद rAAV कणों के साथ संक्रमित क्षेत्र बहुत छोटे से बहुत बड़े क्षेत्रों को लक्षित न केवल वायरल अनुमापांक में परिवर्तन द्वारा भी लेकिन इंजेक्शन पैरामीटर बदलकर क्षेत्रों से समायोजित किया जा सकता है. ये मात्रा और इंजेक्शन की गति और वायरस के निलंबन के साथ 14 polyol mannitol का समावेश शामिल हैं . Mannitol भी प्रणालीगत rAAV 15 इंजेक्शन के बाद ऊतकों की एक किस्म के संक्रमण को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है </> समर्थन.

rAAV (4.7 लगभग केबी) की पैकेजिंग क्षमता शायद जीन है कि इन वायरल vectors से व्यक्त किया जा सकता है के मामले में सबसे सीमित कारक है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि यह आंशिक रूप से अलग rAAV वैक्टर में किया जा सकता है बड़ा बंटवारे जीन या अभिव्यक्ति कैसेट से दूर और एक ब्रिजिंग अनुक्रम शुरू करने, जीन अभिव्यक्ति की शुरुआत जब virions वही 16 कोशिका को संक्रमित. RAAV वैक्टर द्वारा किए गए जीन की अभिव्यक्ति के स्तर भी बहुत आत्म - मानार्थ rAAV वैक्टर 17 का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है है. RAAV वैक्टर Stereotaxic इंजेक्शन एक तेजी से, एक क्षेत्र विशेष तरीके में जीन की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के लिए सस्ती और शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. 2 एन डी पीढ़ी शाही सेना हस्तक्षेप रणनीतियों के साथ संयोजन में 18 rAAVs भी क्षेत्र - विशिष्ट जीन दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सर्किट और सेल प्रकार प्राप्त करने के rAAVs Cre ट्रांसजेनिक चूहों या सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के साथ संयुक्त किया जा सकता है हैविशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति, उच्च स्थानिक संकल्प 2,19-21 के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ की अनुमति, जबकि जैसे tet प्रणाली के साथ फिटिंग rAAVs वायरस की मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति 22,23 से अधिक अस्थायी नियंत्रण कहते हैं. इन उदाहरणों इन वैक्टर भारी मिश्रित संभावित वर्णन और rAAV आधारित अध्ययन में आने वाले वर्षों में एक तेजी से वृद्धि की भविष्यवाणी.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra centrifugal filters EMD Millipore UFC810024 100,000 MWCO
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) Invitrogen 10567014 Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin
Hek293 cells American Type Culture Collection CRL-1573 Use at passage less than 30
HEPES buffered saline Sigma-Aldrich 51558
HiTrap Heparin cartridge Sigma-Aldrich 54836
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Invitrogen 12440-053 Supplement with 5% FCS
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D5670 Make fresh solution for each batch
15 cm Tissue culture dishes Fisher Scientific 157150
Stbl2 competent cells Invitrogen 10268-019
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Leave to disinfect overnight before discarding to drain
Table 1. Specific reagents required for protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
  2. Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
  3. Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
  4. Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
  5. Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
  6. Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
  7. Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
  8. Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
  9. Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
  10. Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
  11. Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
  12. Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
  13. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
  14. Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
  15. Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
  16. Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
  17. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
  18. Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
  19. Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  20. Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
  21. Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
  22. Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
  23. Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी 57 अंक एडिनो - जुड़े वायरस AAV वायरस टिटर stereotaxic इंजेक्शन वायरल जीन स्थानांतरण
उत्पादन और पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर Titering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McClure, C., Cole, K. L. H., Wulff,… More

McClure, C., Cole, K. L. H., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (57), e3348, doi:10.3791/3348 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter