Summary
重组腺相关病毒（rAAVs）载体正变得越来越有价值的
Abstract
近年来的重组腺相关病毒载体（AAV）已成为越来越有价值的， 在动物体内研究，而目前也正在测试在人体临床试验。野生型腺相关病毒是一个非致病的细小病毒家族成员固有的复制缺陷。广泛传导，低免疫反应，以及与这些载体实现的强大和持久的转基因表达，使他们为流行和通用的工具 ， 在体外和体内基因传递。 rAAVs可以轻松，廉价地在实验室中产生的，基于其良好的安全性，一般都是低安全分类。在这里，我们描述了一个含有AAV1和AAV2衣壳蛋白嵌合rAAVs的生产和滴定的方法。使用这些所谓的嵌合载体，结合双方父母的血清型，如高滴度的股票（AAV1）和净化的好处通过亲和层析（AAV2）。这些腺相关病毒血清型是最好的腺相关病毒血清型研究，及个别有广泛的传染性格局。这里所描述的嵌合载体应该有AAV1和AAV2传染病属性，因此可以预计大范围的组织，包括神经细胞，骨骼肌，胰腺，肾等等的感染。这里介绍的方法使用肝素柱纯化，方法认为给予较高的病毒滴度和病毒编制比其他净化方法，如通过氯化铯梯度离心，清洁。此外，我们描述了如何将这些载体可以快速，轻松地滴度，以提供准确的读数产生的传染性颗粒数量。
Protocol
图1总结了以下协议的插图。
安全注意事项：所有材料，在接触病毒颗粒组装需要用卫康消毒剂溶液或其他合适的消毒剂消毒。
1。制备的质粒DNA股（1〜2天）
- 以下质粒：
- pRV1 - 含AAV2 Rep和Cap序列
- pH21 - 含AAV1 Rep和Cap序列
- pFdelta6 - 腺病毒辅助质粒
- 腺相关病毒质粒含有重组表达盒两侧AAV2包装信号（倒终端重复，ITRS）
- 虽然pFdelta6应在Stbl2主管细胞生长，防止部分缺失，pRV1和pH21可以生长在DH5alpha主管细胞。腺相关病毒质粒可以种植Stbl2细胞，如果DH5alpha细胞出现部分缺失。
- 质粒DNA应该是高品质和RNA的污染物。质粒进行筛选，使用下面的摘要完整性：
- pRV1 - 消化用XbaI 7.5 kb和3.8 kb的带
- pH21 - 用EcoRI消化4.5 kb的条带，2.8 kb和0.2 kb的
- pFdelta6 - 消化与HindIII位给予5.5 kb的条带，3 KB，3 KB，2.3 kb和1.5 kb的
2。制备人胚肾293（HEK293）细胞转染（2 - 3天）
- 板两个80％融合150厘米2到5个直径15厘米的NUNC组织培养皿HEK293细胞培养瓶。细胞应在70 - 80％，转染前（约48小时后电镀）汇合。培养细胞与低血糖在标准贝科的改良Eagle培养基（DMEM），含10％小牛血清和100 U / ml青霉素/ 100微克/ ml链霉素。
- 转染前3小时删除DMEM和更换与Iscove“小号修改贝科的培养基（IMDM）含5％胎牛血清。
3。病毒质粒转染（〜1小时转，3天孵化）
- 准备一个批处理病毒（5 × 15厘米培养板）以下内容：
- 62.5微克腺相关病毒质粒
- 125微克pFdelta6
- 31.25微克pRV1
- 31.25微克pH21
- 1650微升2.5米氯化钙2
- 12毫升DH 2 O
- 在2类组织文化引擎盖无菌过滤到50毫升管转染混合物。
- 虽然震荡的解决方案，迅速加入13毫升2 × HEPES缓冲液（pH值7.05）。更换50毫升管的盖子，并继续为15秒涡。离开站为1分45秒，罚款应形成白色沉淀。
- 轻轻地转解决方案，以每15厘米的组织培养皿中加入5毫升。旋流板组合，并返回到孵化器。
- 转染后16小时删除IMDM培养液，用DMEM更换。
4。裂解细胞和收获的rAAVs（2小时）
- 转染后72小时，取出细胞培养板的媒体和丢弃。所有废弃物应被视为与卫康消毒剂溶液或其他合适的消毒剂。
- 轻轻洗细胞，在温暖的1X磷酸缓冲液（PBS，pH值7.4）。
- 加入25毫升温PBS将每块板，轻轻地清除细胞与细胞刮刀。收集悬浮在50毫升管。
- 颗粒细胞在10分钟的800 XG。
- 倒掉上清，重悬沉淀在150 mM氯化钠，20毫米的Tris pH值8.0，利用组织培养板每10毫升。拆分成两个50毫升管。
- 准备一个10％的脱氧胆酸钠的新鲜解决方案，在DH 2 O终浓度为0.5％，每管加入1.25毫升。添加benzonase核酸到终浓度为每毫升50个单位。彻底混合管。
- 3000 XG离心15分钟，取出细胞碎片。转移到新鲜管50毫升，确保所有细胞碎片已被删除，以防止肝素列阻塞（见第5步）。在这个阶段，样品可存放于-20 ° C，然后再继续。我们已储存在-20 ° C的几个星期没有在减少传染性样本。
5。 rAAVs肝素柱纯化（2 - 3小时）
- 安装HiTrap肝素列列在1毫升每分钟5.2至5.4的步骤，使解决方案流通过使用蠕动泵。重要的是要确保无气泡进入肝素列介绍。
- 平衡10毫升150毫米，20毫米的Tris，pH值8.0氯化钠列。
- 50毫升的病毒解决方案，应用列，并允许流过。
- 20毫升100毫米，20毫米的Tris，pH值8.0氯化钠洗净列。
- 使用5毫升注射器，继续洗柱瓦特第i个1毫升200毫米氯化钠，20毫米的Tris，pH值8.0，1毫升300毫米，20毫米的Tris，pH值8.0氯化钠。丢弃的流量通过。
- 从列由申请使用5毫升的注射器和柔和的压力洗脱病毒：
- 1.5毫升400毫米，20毫米的Tris，pH值8.0氯化钠
- 3.0毫升450 mM氯化钠，20毫米的Tris，pH值8.0
- 1.5毫升500毫米，20毫米的Tris，pH值8.0氯化钠
- 在15 mL离心管中收集这些。
6。浓度和rAAVs无菌过滤（1小时）
- 使用了10万分子量截止Amicon超4离心式过滤器，浓缩载体。在2000年为2分钟（室温）XG装入浓缩和离心列洗脱液4毫升。流穿，用剩余的病毒解决方案，并重复离心和重载选矿厂丢弃。集中量应约250μL。如果集中体积比这更显著，丢弃流量吨hrough和继续离心机在一分钟内的步骤，直到体积约250μL。
- 最终体积为500μL加入250μL的PBS病毒删除选矿厂。
- 通过13毫米直径为0.2微米的注射器过滤器的过滤器载体。媒介应分装和保存于-80℃直至所需。
7。病毒性股票的滴定（3天）
这需要一个推动者，是活跃在HEK293细胞驾驶报告基因或免疫细胞化学检测基因产物。当产生一个向量是不兼容的HEK293细胞的其他细胞系或初级细胞培养可用于的。
- 18聚- L -赖氨酸涂层玻片NUNC玻片或18井准备播种HEK293细胞，使他们有40 - 50％融合。对于创建依赖rAAVs滴定使用HEK293细胞中稳定表达Cre重组酶2。
- 感染每口井与串行Dilutions的AAV载体（图2A）。使用3口井，每稀释。我们经常直接添加病毒每口井。
- 72小时后加入等体积的4％多聚甲醛（PFA）（给予终浓度为2％煤灰）在室温下10分钟至中等HEK293细胞修复。
- 的PBS洗涤细胞3次，冲洗卫生署2 O和盖玻片。
- 计数三口井的最高稀释倍数，细胞的数量，但仍然含有受感染的细胞，发现这些平均乘以稀释倍数，给每微升传染性单位（图2B）。
8。预期结果
HEK293细胞转导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）如图2b所示的病毒编码。我们一般实现一致的滴度约为6 × 10 6％微升传染性颗粒。我们经常使用立体仁济这些载体ction到成年的啮齿动物的大脑。这提供了一个强大的技术，为特定区域的基因表达 2 。选择性基因表达的细胞类型，我们注入的Cre转基因小鼠的目标2地区的依赖Cre重组rAAVs要结合本地区的特殊性。图2C - E显示立体定向注射编码成不同的大脑区域的成人白蛋白- Cre转基因小鼠3 EGFP的依赖CRE - rAAVs的例子。
图1。示意图的rAAV生产协议。 1）HEK293细胞镀成长为70 - 80％汇合。 2）腺相关病毒和辅助质粒转染HEK293细胞。 3）中变回DMEM培养16小时后转染HEK293细胞培养56小时，。 4。）HEK293细胞收获和裂解。从细胞碎片中分离出来，由C的rAAV载体entrifugation。 5）。纯化病毒颗粒通过肝素浓度和消毒前列。 6）。HEK293细胞是生长在24孔板和感染AAV载体的系列稀释，以确定传染病的单位数量。
图2。滴定和在体内rAAV1 / 2的应用。 （一）设置的HEK293细胞病毒滴度测量。 HEK293细胞转rAAVs系列稀释。 C，未受感染的控制，N，1μL未稀释的病毒股票。 （二）感染HEK293细胞表达EGFP rAAVs。 （CE）病毒EGFP的表达仅限于表达CRE -白蛋白- Cre转基因小鼠Cre重组酶的激活rAAVs立体定向注射后不同的目标区域中的神经元。示例图像显示GFP免疫反应，（三）网状丘脑和苍白球（四）齿状回和（E）海马CA1区。狄刚，报ntate回; RT，网状丘脑核，GP，苍白球。比例尺：B，500微米，C，100微米，D，100微米，E，500微米。
Discussion
重组AAV载体在动物体内研究越来越有价值。在这里，我们生产rAAVs一个简单而廉价的的协议，可能有助于避免病毒的生产成本高昂的外包公司的广泛应用这项有益的载体。协议（基于参考文献1）描述生产嵌合rAAV1 / 2，其中包含从4等于比率在双方父母的血清型衣壳蛋白的载体。通过肝素列结合的rAAV载体净化依靠AAV2衣壳蛋白的表达，但可以用比AAV1这里列出的血清型相结合。此外，AAV6还报道肝素结合，虽然减少的亲和力，并可能与使用肝素这个过程 5,6列纯化。但是应该指出，其他血清型会要求不同浓度的NaCl，肝素柱洗脱5,7 。
包装的rAAV基因组显示在包装效率大幅减少到8 KB 5.2 4.1和4.9 kb的之间最佳。这种包装限制，可以考虑的rAAV系统的最大缺点，因为细胞类型特异性的转基因表达的调节通常是由大顺行事，不能住小腺相关病毒颗粒内的元素实现。为了克服低滴度批次，如那些试图包密切AAV的包装限制，我们结合加入PBS 6.3步，而不是单独的病毒批次，集中到一个首批500μL到250μL的基因是导致。相结合，创建驱动小鼠和有条件的rAAV盒（见下文），以避免拉伸包装限制，可以实现可靠的细胞类型的具体传导。
值得注意的是，虽然此协议试图提供易于遵循的指示，生产高T国际热核实验堆的rAAV，它要求肝素亲和层析的纯化AAV2为核衣壳蛋白基团的存在。使用替代程序9血清型比AAV2必须净化。肝素柱纯化的一个好处是，它被认为是产生有传染性率大于生产的使用氯化铯梯度10的AAV载体。然而，这种方法也存在着一些弊端。例如，结合肝素的其他蛋白质也可能是目前在纯化病毒的股票。虽然可以通过载体滴度10，我们的方法，具体目标无论是20兴奋性或抑制性神经元（图2）的影响肝素纯化载体嗜采用诱导Cre重组AAV介导的转基因表达的激活和滴度独立。肝素柱纯化的另一种方法是使用碘克沙醇密度梯度，从而产生较高的病毒滴度比使用素净准备氯化铯梯度10。这种方法也可以结合肝素柱纯化，以产生一种载体，是大于99％的纯 11 。因此，需要认真考虑采取个别团体病毒提纯方法最适合其特定的下游应用。
与此协议相关的最常见的问题是低的病毒滴度。这在我们的经验，通常可以追溯到转染效率低，或病毒从肝素列洗脱。转染前，所有转材料，应在室温下进行测试转染应在每个实验室中找到最佳的条件。其他转染方法，脂质体等，是一种高效的，但可以非常昂贵。此外，肝素柱洗脱解决方案的浓度和pH值是完整的病毒粒子洗脱witho肝素列的关键UT损害。另外很重要的一点是，包装细胞，必须坚持以组织培养皿的表面。如果在某个阶段的细胞分离，在手术过程中，建议终止实验和除霜一个新的细胞小瓶。
在啮齿类动物中的转基因表达的时空控制很容易实现准确的解剖定位和发育阶段的动物。高效的腺相关病毒介导的基因转移已被证明在子宫内12,13。在成人大脑，立体定向注射后的rAAV颗粒感染的地区，可以从非常小的有针对性的地区，不仅在病毒滴度的变化，但也到更大的领域，通过改变注入参数进行调整。这些措施包括注射量和速度，列入多元醇与病毒悬液14甘露醇。甘露醇也可用于增强全身的rAAV注射15后的各种组织感染 </ SUP>。
rAAV的包装容量（约4.7 KB）可能是在可以从这些病毒载体基因表达方面，最重要的限制因素。然而，最近的研究表明，这可以部分克服分裂更大的基因或表达盒的rAAV载体为单独的和引进架桥序列，启动基因表达的病毒粒子感染同一个细胞 16时。的rAAV载体携带的基因表达水平，也可以大大提高使用自免费的rAAV 载体 17 。立体定向注射rAAV的载体诱导在一个特定区域的的方式的基因表达提供了一种快速，廉价和功能强大的方法。 18 rAAVs结合第二代RNA干扰策略也可以用于特定区域的基因击倒。 rAAVs可以结合的Cre转基因小鼠或细胞类型特异性启动子，以实现电路和单元式特定基因的表达，允许高空间分辨率2,19-21的遗传操作，而装修rAAVs如TET系统增加了对病毒介导的基因表达22,23的时间控制。这些例子说明这些向量组合巨大潜力，预测在今后几年中的rAAV为基础的研究的快速增长。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
References
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