Produksjon og Titering av rekombinant Adeno-assosiert virale vektorer

Summary

Rekombinant adeno-assosiert virus (rAAVs) vektorene blir stadig mer verdifull for

Abstract

I de senere årene rekombinant adeno-assosiert virale vektorer (AAV) har blitt stadig mer verdifull for in vivo studier i dyr, og blir også testet i kliniske studier. Wild-type AAV er en ikke-patogene medlem av parvoviridae familien og iboende replikering-mangelfull. Den brede transduksjon profil, lavt immunforsvar, samt den sterke og vedvarende transgenet uttrykk oppnådd med disse vektorene har gjort dem en populær og allsidig verktøy for in vitro og in vivo genet levering. rAAVs kan enkelt og billig produsert i laboratoriet, og basert på deres gunstig sikkerhetsprofil, er generelt gitt en lav sikkerhet klassifisering. Her beskriver vi en metode for produksjon og titering av kimære rAAVs inneholder kapsid proteiner både AAV1 og AAV2. Bruken av disse såkalte kimære vektorer kombinerer fordelene av begge foreldrenes serotyper som høye titre aksjer (AAV1) og rensingav affinitet kromatografi (AAV2). Disse AAV serotyper er best studert av alle AAV serotype og individuelt har en bred smittsomhet mønster. Den kimære vektorer beskrevet her bør ha smittsomme egenskaper AAV1 og AAV2 og kan dermed forventes å infisere et stort spekter av vev, inkludert nerveceller, skjelettmuskulatur, bukspyttkjertel, nyre blant andre. Metoden som beskrives her bruker heparin kolonne renselse, trodde en metode for å gi en høyere viral titer og renere viral forberedelse enn andre rensemetoder, slik som sentrifugering gjennom et cesium klorid gradient. I tillegg beskriver vi hvordan disse vektorene kan raskt og enkelt titered å gi nøyaktig lesing av antall infeksiøse partikler produsert.

Protocol

Se figur 1 for en illustrasjon oppsummere følgende protokollen.

Sikkerhet Merk: Alt materiale som har vært i kontakt med montert viruspartikler må desinfiseres med Virkon-løsning eller annet egnet desinfeksjonsmiddel.

1. Utarbeidelse av plasmid DNA aksjer (~ 2 dager)

1. Følgende plasmider kreves ^1:
   • pRV1 - som inneholder den AAV2 Rep og Cap sekvenser
   • pH21 - som inneholder den AAV1 Rep og Cap sekvenser
   • pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmid
   • AAV plasmid som inneholder rekombinant uttrykket kassetten flankert av AAV2 emballasje signaler (invertert terminal gjentar, ITRs)
2. Mens pFdelta6 bør dyrkes i Stbl2 kompetente celler for å unngå delvis sletting, kan pRV1 og pH21 dyrkes i DH5alpha kompetente celler. AAV plasmider kan dyrkes i Stbl2 celler hvis delvis slettinger skje i DH5alpha celler.
3. Plasmid DNA bør være av høy kvalitet og fri for RNA forurensninger. Plasmider kan screenes for integritet ved hjelp av følgende digests:
   • pRV1 - fordøye med XbaI å gi band på 7,5 kb og 3,8 kb
   • pH21 - fordøye med EcoRI å gi band på 4,5 kb, 2,8 kb og 0,2 kb
   • pFdelta6 - fordøye med HindIII å gi band på 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb og 1,5 kb

2. Utarbeidelse av humane embryonale Kidney 293 (Hek293) celler for transfeksjon (2 - 3 dager)

1. Plate to 80% confluent 150 cm ² flasker av Hek293 celler i fem 15 cm diameter Nunc vev kultur retter. Cellene skal være 70 - 80% confluent før transfeksjon (ca 48 timer etter plating). Kultur celler i standard Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM) med lav glukose som inneholder 10% kalvefoster serum og 100 U / ml penicillin / 100 mikrogram / ml streptomycin.
2. 3 timer før transfeksjon fjerne DMEM og erstatte med Iscove'S modifisert Dulbecco medium (IMDM) som inneholder 5% kalvefoster serum.

3. Transfeksjon av viral plasmider (~ 1 time for transfeksjon, 3 dager for inkubering)

1. Forbered følgende for en enkelt batch (5 x 15 cm vev kultur plater) av virus:
   • 62,5 mikrogram AAV plasmid
   • 125 mikrogram pFdelta6
   • 31,25 mikrogram pRV1
   • 31,25 mikrogram pH21
   • 1650 mL 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. I en klasse 2 vevskultur hette sterile filtrere transfeksjon blandingen i en 50 ml tube.
3. Mens virvling løsningen, raskt legge til 13 ml av 2 x HEPES buffered saltvann (pH 7,05). Erstatt lokket på 50 ml tube og fortsette å vortex i 15 sekunder. La stå i 1 minutt 45 sekunder, bør et fint hvitt bunnfall form.
4. Tilsett 5 ml av transfeksjon løsning til hver 15 cm vev kultur parabolen. Swirl platene til mix og gå tilbake til inkubatoren.
5. 16 timer etter transfeksjon fjerne IMDM medium og erstatte med DMEM.

Fire. Lysing av celler og høsting av rAAVs (2 timer)

1. 72 timer etter transfeksjon, fjerne media fra cellekultur plater og kast. Alt avfall skal behandles med Virkon-løsning eller annet egnet desinfeksjonsmiddel.
2. Forsiktig vaske cellene i varmt 1x fosfatbufret saltløsning (PBS, pH 7,4).
3. Tilsett 25 ml varm PBS til hver tallerken og forsiktig fjerne celler med en celle skrape. Samle suspensjon i 50 ml rør.
4. Pellet cellene ved 800 xg i 10 minutter.
5. Kast supernatant og resuspender pellet i 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, bruk 10 ml per vev kultur plate. Delt inn i to 50 ml rør.
6. Forbered en frisk løsning av 10% natrium deoxycholate i dH ₂ O. Legg til 1,25 ml av dette til hvert rør for en endelig konsentrasjon på 0,5%. Legg benzonase nukleasefritt til en endelig konsentrasjon på 50 enheter per ml. Bland tube grundig.
7. Fjern mobilnettet avfall ved sentrifugering ved 3000 xg i 15 minutter. Transfer til frisk 50 ml tube, sikre at alle celleavfall har blitt fjernet for å hindre blokkering av heparin kolonner (se trinn 5). På dette stadiet, kan prøvene oppbevares ved -20 ° C før du fortsetter. Vi har lagret prøver i flere uker ved -20 ° C uten en reduksjon i smittsomhet.

5. Heparin kolonne rensing av rAAVs (2 - 3 timer)

1. Oppsett HiTrap heparin kolonner ved hjelp av en peristaltiske pumpe slik at løsningene strømmer gjennom kolonnen ved 1 ml per minutt for skritt 05.02 til 05.04. Det er viktig å sikre at ingen luftbobler er innført i heparin kolonnen.
2. Likevekt kolonnen med 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH.
3. Bruk 50 ml virus løsning til kolonne og la det strømme gjennom.
4. Vask kolonnen med 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH.
5. Bruk en 5 ml sprøyte fortsette å vaske kolonnen wed 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH, etterfulgt av 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH. Forkaste gjennomstrømning.
6. Bruk 5 ml sprøyter og milde press Eluer viruset fra kolonnen ved å:
   • 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH
   • 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH
   • 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 8,0 pH
   • Samle disse i en 15 ml sentrifugerør.

Seks. Konsentrasjon og sterile filtrering av rAAVs (1 time)

1. Konsentrer vektor bruker Amicon ultra-4 sentrifugalfilter enheter med 100 000 molekylvekt cutoff. Load 4 ml av kolonne eluatet inn i konsentratoren og sentrifuger ved 2000 xg i 2 minutter (ved romtemperatur). Kast flowthrough og reload konsentratoren med gjenværende virus løsning og gjenta sentrifugering. Den konsentrerte volum bør være ca 250 mL. Hvis konsentrert volumet er betydelig mer enn dette, forkaste flow through og fortsette å sentrifuge i ett minutt trinn inntil volumet er ca 250 mL.
2. Tilsett 250 mL PBS til virus for en endelig volum på 500 mL og fjerne fra konsentratoren.
3. Filter vektor gjennom en 13 mm diameter på 0,2 mikrometer sprøyte filter. Vector bør alikvoteres og oppbevares ved -80 ° C inntil nødvendig.

7. Titering of viral aksjer (3 dager)

Dette krever en promoter som er aktiv i Hek293 celler kjører en reporter gen eller en immunocytochemically detectable genet produktet. Ved produksjon av en vektor som ikke er kompatibel med Hek293 celler andre cellelinjer eller primære cellekulturer kan brukes.

1. Forbered 18 poly-L-lysin belagt glass Dekkglass eller 18 brønner på Nunc kammer lysbilder ved seeding Hek293 celler slik at de er 40 - 50% confluent. For titrering av Cre-avhengige rAAVs bruke Hek293 celler som stabilt uttrykker Cre recombinase ^2.
2. Infisere hver brønn med serienummer dilutions av AAV vektor (fig 2A). Bruk 3 brønner per fortynning. Vi rutinemessig legger viruset direkte til hver brønn.
3. Etter 72 timer fikse Hek293 celler ved å legge til et likt volum på 4% Paraformaldehyde (PFA) til medium (gi en endelig konsentrasjon på 2% PFA) i ti minutter ved romtemperatur.
4. Vask celle tre ganger i PBS, skyll i dH ₂ O og dekkglass.
5. Tell antall transduced celler fra de tre brønnene som har høyest fortynningsfaktoren, men likevel inneholder infiserte celler, finne gjennomsnittet av disse og multipliserer med fortynningsfaktoren for å gi antall smittsomme enheter per mikroliter (Fig. 2B).

8. Forventede resultater

Hek293 celler transduced med et virus koding forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) er vist i figur 2B. Vi generelt oppnå konsistente titere på rundt 6 x 10 ⁶ infeksiøse partikler per mikro liter. Vi rutinemessig bruker disse vektorer for stereotaxic injection inn i den voksne gnager hjernen. Dette gir en kraftig teknikk for region-spesifikke genuttrykk ^2. Å kombinere denne regionen spesifisitet med celle-type selektiv genuttrykk vi injisere Cre recombinase-avhengige rAAVs inn mål regioner av Cre-transgene mus ^2. Figur 2C-E viser eksempler på stereotaxic injeksjoner av Cre-avhengige rAAVs koding eGFP inn i ulike områder av hjernen hos voksne parvalbumin-Cre transgene mus ^3.

Figur 1. Skjematisk illustrasjon av protokollen for rAAV produksjon. . 1) Hek293 celler er belagt og vokst til 70 - 80% Confluence. 2.) AAV og helper plasmider er forberedt og transfektert inn Hek293 celler. 3). Medium er endret tilbake til DMEM 16 timer etter transfeksjon og Hek293 celler dyrkes i ytterligere 56 timer. 4). Hek293 cellene er høstet og lyseres. rAAV vektorer er skilt fra celleavfall av centrifugation. 5). Viral partikler er renset gjennom heparin kolonner før konsentrasjon og sterilisering. 6). Hek293 cellene er dyrket på 24 godt plater og infisere med serielle fortynninger av AAV vektor for å bestemme antall smittsomme enheter.

Figur 2. Titering og in vivo anvendelse av rAAV1 / 2. (A) Oppsett av Hek293 celler for måling av viral titer. Hek293 celler er transduced med serielle fortynninger av rAAVs. C, friske kontroll; N, 1 mL av ufortynnet viral lager. (B) Hek293 celler infisert med rAAVs uttrykke eGFP. (CE) Viral eGFP uttrykk er begrenset til Cre-uttrykke nevroner i ulike målgrupper regioner av parvalbumin-Cre transgene mus etter stereotaxic injeksjon av Cre-aktivert rAAVs. Eksempler Bildene viser GFP immunoreaktivitets i (C) retikulære thalamus og globus pallidus, (D) dentate gyrus og (E) i CA1 regionen i hippocampus. DG, dentate gyrus, RT, retikulære thalamic kjernen; GP, globus pallidus. Scale barer: B, 500 mikrometer, C, 100 mikrometer, D, 100 mikrometer, E, 500 mikrometer.

Discussion

rAAV vektorer blir stadig mer verdifull for in vivo studier på dyr. Her har vi beskrevet en enkel og rimelig protokoll for å produsere rAAVs, noe som kan lette den utbredte anvendelsen av denne nyttige vektor ved å unngå kostbar outsourcing av virus produksjonen til bedrifter. Protokollen (basert på referanse 1) beskriver produksjonen av kimære rAAV1 / 2 vektorer som inneholder kapsid proteiner fra begge foreldrenes serotyper på lik forholdstall ^fire. Rensing av rAAV vektorer ved binding til heparin kolonner avhengig uttrykk for AAV2 kapsid proteiner, men kan kombineres med serotyper enn AAV1 skissert her. I tillegg har AAV6 blitt rapportert å binde seg til heparin, men med redusert affinitet, og kan potensielt bli renset med heparin kolonner ved hjelp av denne prosedyren ^5,6. Det bør bemerkes imidlertid at andre serotyper vil kreve ulike konsentrasjoner av NaCl for heparin kolonnen eluering ^5,7.

Emballasje rAAV genomer ble vist å være optimal mellom 4,1 og 4,9 kb med en kraftig reduksjon i emballasje effektivitet opp til 5,2 kb ^8. Denne emballasjen grensen kan betraktes som den største ulempen av rAAV system, siden celletype-spesifikk regulering av transgene uttrykket oppnås vanligvis ved store cis handle elementer som ikke kan innpasses innenfor den lille AAV partikler. For å overvinne lavt titer partier, slik som de som følge av forsøk på å pakke gener som er nær AAV pakking grense vi kombinere separate viral partier konsentrert til 250 mL i en 500 mL batch, snarere enn å legge PBS som beskrevet i punkt 6.3. Pålitelig celle-type spesifikke transduksjon kan oppnås ved å kombinere Cre-driver mus og betinget rAAV kassetter (se nedenfor) for å unngå strekk emballasjen grensen.

Av notatet, mens denne protokollen forsøker å gi enkle å følge instruksjonene på produksjon av høy tITER rAAV, det krever tilstedeværelse av AAV2 kapsid protein moieties for rensing av heparin affinitet kromatografi. Serotyper enn AAV2 må bli renset ved hjelp av alternative prosedyrer ^9. En fordel med heparin kolonne rensing er det antas å produsere AAV vektorer som har større smittsomhet enn dem som produseres ved hjelp av en cesium klorid gradient ^10. Men det er også noen ulemper med denne metoden. For eksempel kan andre proteiner som binder heparin også være til stede i renset viral lager. Mens tropisme av heparin-renset vektorer kan bli påvirket av vektor ¹⁰ titer, vår tilnærming spesifikt mot enten eksitatoriske ²⁰ eller inhibitoriske nevroner (fig 2) sysselsetter Cre-indusert aktivering av AAV-mediert transgenet uttrykk og er titre-uavhengig. Et alternativ til heparin kolonne rensing er bruken av en iodixanol tetthet gradient, noe som gir en høyere viral titer og renere forberedelse enn bruk aven cesium klorid gradient ^10. Denne metoden kan også kombineres med heparin kolonne renselse å produsere en vektor som er større enn 99% ren ^11. Derfor må nøye overveielse til å bli tatt av enkelte grupper om hvilke viral rensing metoden er best for deres spesielle nedstrøms søknaden.

Det vanligste problemet forbundet med denne protokollen er lav viral titer. Vår erfaring er dette kan vanligvis spores til lav transfeksjon effektivitet, eller eluering av virus fra heparin kolonnene. Alle transfeksjon materialer bør ha romtemperatur før transfeksjon, og test transfections bør utføres for å finne optimale forhold i hvert enkelt laboratorium. Andre metoder for transfeksjon, som lipofectamine, er svært effektiv, men kan være uoverkommelig dyrt. I tillegg blir konsentrasjonen og pH i heparin kolonnen elueringsmiddel løsninger kritisk for komplett eluering av virioner fra heparin kolonner withoUT skade. Et annet viktig poeng er at emballasjen cellene må følge godt til overflaten av vev kultur retter. Hvis cellene løsner på et tidspunkt under prosedyren er det anbefalt å avslutte forsøket og avriming en ny hetteglass av celler.

Spatio-temporal kontroll av transgene uttrykk hos gnagere er lett oppnås ved nøyaktige anatomiske målretting og det utviklingsstadiet av dyret. Effektiv AAV-mediert genoverføring har vært vist i utero ^12,13. I den voksne hjernen, kan området infisert med rAAV partikler etter stereotaxic injeksjon justeres fra svært små målrettede regioner, til mye større områder, ikke bare av endringer i viral titer, men også ved å endre injeksjon parametere. Disse inkluderer volum og hastighet av injeksjoner og inkludering av polyol mannitol med viruset suspensjon ^14. Mannitol kan også brukes til å forbedre infeksjon av en rekke vev etter systemisk rAAV injeksjon ^{15 <}/ Sup>.

Emballasjen kapasitet rAAV (ca 4,7 kb) er trolig den mest begrensende faktoren i forhold til gener som kan uttrykkes fra disse virale vektorer. Imidlertid har nyere studier vist at dette kan være delvis overvinnes ved å splitte større gener eller uttrykk kassetter i separate rAAV vektorer og innføre en bridging sekvens, initiere genekspresjon når virioner infiserer samme celle ^16. Expression nivåer av gener båret av rAAV vektorer kan også bli sterkt forbedret ved hjelp av self-gratis rAAV vektorer ^17. Stereotaxic injeksjon av rAAV vektorer gir en rask, billig og kraftig metode for å indusere genuttrykk i en region-spesifikk måte. I kombinasjon med ^2. generasjons RNA-interferens strategier ¹⁸ rAAVs kan også brukes for region-spesifikke gen-knock ned. rAAVs kan kombineres med Cre-transgene mus eller celle-typespesifikke arrangører å oppnå krets-og celle-type-Spesifikke genuttrykk, tillater det genetiske manipulasjoner med høy romlig oppløsning ^2,19-21, mens montering rAAVs med f.eks Tet-systemet legger temporal kontroll over virus-mediert genuttrykk ^22,23. Disse eksemplene illustrerer det enorme kombinatorisk potensialet i disse vektorer og spår en rask økning i rAAV-baserte studier i årene som kommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra centrifugal filters	EMD Millipore	UFC810024	100,000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM)	Invitrogen	10567014	Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin
Hek293 cells	American Type Culture Collection	CRL-1573	Use at passage less than 30
HEPES buffered saline	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Heparin cartridge	Sigma-Aldrich	54836
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Invitrogen	12440-053	Supplement with 5% FCS
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D5670	Make fresh solution for each batch
15 cm Tissue culture dishes	Fisher Scientific	157150
Stbl2 competent cells	Invitrogen	10268-019
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Leave to disinfect overnight before discarding to drain
Table 1. Specific reagents required for protocol