Summary
Rekombinant Adeno-associerade virus (rAAVs) vektorer blir allt mer värdefulla för
Abstract
Under senare år har rekombinant Adeno-associerad virala vektorer (AAV) har blivit allt värdefullt för in vivo-studier på djur, och är också för närvarande testas i kliniska prövningar. Vildtyp AAV är en icke-patogena medlem av parvoviridae familjen och natur replikering-brist. Den breda transduktion profil, lågt immunförsvar, liksom den starka och ihållande transgenen uttryck uppnås med dessa vektorer har gjort dem en populär och mångsidigt verktyg för in vitro och in vivo gen leverans. rAAVs kan enkelt och billigt som produceras i laboratorium och, baserat på deras fördelaktig säkerhetsprofil, är i allmänhet ges en låg säkerhetsklassning. Här beskriver vi en metod för produktion och titering av chimär rAAVs innehåller kapsid proteiner av både AAV1 och AAV2. Användningen av dessa sk chimär vektorer kombinerar fördelarna av båda föräldrarna serotyper som höga titrar lager (AAV1) och reningmed affinitetskromatografi (AAV2). Dessa AAV serotyper är bäst studerade av alla AAV serotyper, och individuellt har en bred smittsamhet mönster. Den chimär vektorer som beskrivs här bör ha infektiösa egenskaper AAV1 och AAV2 och därmed kan förväntas att infektera ett stort utbud av vävnader, inklusive nervceller, skelettmuskel, bukspottkörtel, njure bland annat. Den metod som beskrivs här använder heparin kolumnen rening, trodde en metod för att ge en högre virus titer och renare virus förberedelser än andra reningsmetoder, exempelvis centrifugering genom en cesiumklorid lutning. Dessutom beskriver vi hur dessa vektorer kan snabbt och enkelt titered att ge korrekt avläsning av antalet smittsamma producerade partiklar.
Protocol
Se figur 1 för en illustration sammanfattar följande protokoll.
Säkerhet OBS: Allt material som har varit i kontakt med monterat viruspartiklar måste desinficeras med Virkon-lösning eller annat lämpligt desinfektionsmedel.
1. Beredning av plasmid-DNA lager (~ 2 dagar)
- Följande plasmider krävs 1:
- pRV1 - Innehållande de AAV2 Rep och sekvenser Cap
- pH21 - Innehållande de AAV1 Rep och sekvenser Cap
- pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmid
- AAV plasmid som innehåller rekombinanta uttrycket kassetten flankeras av AAV2 förpackningar signaler (inverterad terminal upprepar, ITRS)
- Medan pFdelta6 bör odlas i Stbl2 behöriga celler för att förhindra delvis strykning kan pRV1 och pH21 odlas i DH5alpha behöriga celler. AAV plasmider kan odlas i Stbl2 celler om partiell strykningar förekommer i DH5alpha celler.
- Plasmid DNA ska vara av hög kvalitet och fri från RNA föroreningar. Plasmider kan screenas för integritet med hjälp av följande smälter:
- pRV1 - sammandrag med XbaI att ge band på 7,5 kb och 3,8 kb
- pH21 - sammandrag med EcoRI att ge band 4,5 kb, 2,8 kb och 0,2 kb
- pFdelta6 - sammandrag med HindIII att ge band på 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb och 1,5 kb
2. Beredning av humana embryonala njur 293 (HEK293) celler för transfektion (2 - 3 dagar)
- Tavla två 80% konfluenta 150 cm 2 flaskor med HEK293-celler i fem 15 Nunc cm i diameter vävnadskultur rätter. Celler bör vara 70 - 80% konfluenta innan transfektion (cirka 48 timmar efter plätering). Kultur celler i standarden Dulbecco ändrade Eagle medium (DMEM) med lågt glukos som innehåller 10% fetalt kalvserum och 100 U / ml penicillin / 100 mikrogram / ml streptomycin.
- 3 timmar innan transfektion bort DMEM och ersätt med IscoveÄr modifierad Dulbecco på medellång (IMDM) som innehåller 5% fetalt kalvserum.
3. Transfektion av viral plasmider (~ 1 timme för transfektion, 3 dagar för inkubation)
- Förbered följande för ett enda parti (5 x 15 cm vävnadsodling plattor) av virus:
- 62,5 mikrogram AAV plasmid
- 125 mikrogram pFdelta6
- 31,25 mikrogram pRV1
- 31,25 mikrogram pH21
- 1650 l 2,5 M CaCl 2
- 12 ml dH 2 O
- I en klass 2 vävnadsodling huva sterila filtrera transfektion blandningen i en 50 ml tub.
- Även vortexa lösningen, snabbt lägga 13 ml 2 x HEPES saltlösning (pH 7,05). Sätt lock på 50 ml tub och fortsätter att skaka i 15 sekunder. Låt stå i 1 minut 45 sekunder bör en fin vit fällning form.
- Tillsätt försiktigt 5 ml av transfektion lösning till varje 15 cm vävnadskultur maträtt. Snurra tallrikar att blanda och återgå till inkubatorn.
- 16 timmar efter transfektion bort IMDM medellång och ersätta med DMEM.
4. Lysing celler och skörd av rAAVs (2 timmar)
- 72 timmar efter transfektion, ta bort materialet från plattorna cellodling och kasta. Allt avfall ska behandlas med Virkon-lösning eller annat lämpligt desinfektionsmedel.
- Försiktigt tvätta cellerna i varma 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).
- Tillsätt 25 ml varm PBS till varje tallrik och ta försiktigt bort celler med en cell skrapa. Samla suspension i 50 ml rör.
- Pellets cellerna vid 800 xgi 10 minuter.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, använda 10 ml per vävnadskultur platta. Delas i två 50 ml rör.
- Bered en färsk lösning av 10% natriumdeoxikolat i dH 2 O. Tillsätt 1,25 ml av detta till varje rör i en slutlig koncentration av 0,5%. Lägg bensonas nukleas till en slutlig koncentration av 50 enheter per ml. Blanda röret ordentligt.
- Ta bort cellulära skräp genom att centrifugera vid 3000 xg under 15 min. Transfer till färska 50 ml tub, se till att alla cellfragment har tagits bort för att förhindra blockering av heparin kolumner (se steg 5). I detta skede kan proverna förvaras vid -20 ° C innan du fortsätter. Vi har sparade prov i flera veckor vid -20 ° C utan en minskning av smittsamhet.
5. Heparin kolumnen rening av rAAVs (2 - 3 timmar)
- Setup HiTrap heparin kolumner med hjälp av en peristaltiska pumpen så att lösningarna flödet genom kolonnen med 1 ml per minut för steg från 5,2 till 5,4. Det är viktigt att se till att inga luftbubblor införs i heparin kolumnen.
- Jämvikt kolonnen med 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
- Applicera 50 ml av viruset till kolonnen och låt rinna igenom.
- Tvätta kolonnen med 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
- Använd en 5 ml spruta fortsätta att tvätta kolumnen wed 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, följt av 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Kassera genomströmning.
- Med 5 ml sprutor och lätt tryck eluera viruset från kolonnen genom att:
- 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- Samla dessa i ett 15 ml centrifugrör.
6. Koncentration och steril filtrering av rAAVs (1 timme)
- Koncentrera vektor med Amicon ultra-4 centrifugal filter enheter med en 100 tusen molekylvikt cutoff. Ladda 4 ml kolonn eluat i anrikningsverk och centrifugera vid 2000 xgi 2 minuter (vid rumstemperatur). Kasta flowthrough och ladda anrikningsverk med återstående virus lösning och upprepa centrifugering. Den koncentrerade Volymen bör vara ungefär 250 l. Om koncentrerad volym är betydligt mer än så, kasta flödet through och fortsätter att centrifugera i en minut steg tills volymen är ca 250 l.
- Tillsätt 250 l PBS till virus för en slutlig volym på 500 l och ta bort från anrikningsverk.
- Filtrera vektor genom ett 13 mm i diameter 0,2 ìm spruta filter. Vector bör alikvoteras och förvaras vid -80 ° C tills de behövs.
7. Titering av viral lager (3 dagar)
Detta kräver en promotor som är aktiv i HEK293 celler köra en reporter gen eller en immunocytochemically upptäckas gen produkt. Vid produktion av en vektor som inte är kompatibel med HEK293 celler andra cellinjer eller primära cellkulturer kan användas.
- Förbered 18 poly-L-lysin belagt glas täckglas eller 18 brunnar Nunc kammare diabilder genom att seeda HEK293-celler så att de är 40 - 50% konfluenta. För titrering av Cre-beroende rAAVs använda HEK293 celler som stabilt uttrycka Cre recombinase 2.
- Infektera varje brunn med seriell dilutions av AAV vektorer (Fig. 2A). Använd 3 brunnar per utspädning. Vi lägger rutinmässigt virus direkt i varje brunn.
- Efter 72 timmar fixa HEK293-celler genom att lägga till en lika stor volym på 4% paraformaldehyd (PFA) till medium (vilket ger en slutlig koncentration av 2% PFA) i tio minuter i rumstemperatur.
- Tvätta cell tre gånger i PBS, skölj i dH 2 O och täckglas.
- Räkna antalet transduced celler från de tre brunnar som har den högsta spädningsfaktor, men ändå innehåller infekterade celler, hitta ett genomsnitt av dessa och multiplicera med spädningsfaktorn för att ge antalet infektiösa enheter per mikroliter (Fig. 2B).
8. Förväntade resultat
HEK293 celler transduced med ett virus kodning förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) visas i Figur 2B. Vi uppnår i stort sett överens titrar på ca 6 x 10 6 infektiösa partiklar per mikro liter. Vi använder rutinmässigt dessa vektorer för stereotaxic injeInsatser till vuxna gnagare hjärnan. Detta ger en kraftfull teknik för region-specifika genuttryck 2. Att kombinera denna region specificitet med celltyp selektivt genuttryck vi injicerar Cre recombinase beroende rAAVs i målregioner av Cre-transgena möss 2. Figur 2C-E visar exempel på stereotaxic injektioner av Cre-beroende rAAVs kodning EGFP i olika områden i hjärnan hos vuxna parvalbumin-Cre transgena möss 3.
Figur 1. Schematisk illustration av protokollet för rAAV produktion. . 1) HEK293 celler pläterade och vuxit till 70 - 80% sammanflöde. 2.) AAV och hjälpare plasmider är förberedda och transfekterade i HEK293 cellerna. 3.) Medium ändras tillbaka till DMEM 16 timmar efter transfektion och HEK293-celler odlas i ytterligare 56 timmar. 4.) HEK293 celler skördas och lyseras. rAAV vektorer är separerade från cellrester av centrifugation. 5.) Viruspartiklar renas genom heparin kolumner innan koncentration och sterilisering. 6.) HEK293-celler odlas på 24 brunnar och infektera med seriella spädningar av AAV vektorer för att bestämma antalet infektiösa enheter.
Figur 2. Titering och in vivo tillämpning av rAAV1 / 2. (A) Inställning av HEK293-celler för att mäta virus titer. HEK293 celler transduced med spädningar av rAAVs. C, oinfekterade kontroll, N, 1 l av outspädd virus lager. (B) HEK293-celler infekterade med rAAVs uttrycka EGFP. (CE) Viral EGFP uttryck är begränsad till Cre-uttryckande neuron i olika målregioner av parvalbumin-Cre transgena möss efter stereotaxic injektion av Cre-aktiverade rAAVs. Exempel på bilder visar GFP immunreaktivitet i (C) retikulära thalamus och globus pallidus, (D) dentate gyrus och (E) CA1 regionen i hippocampus. DG, dentate gyrus, RT, retikulära thalamic kärnan, GP, globus pallidus. Skala barer: B, 500 ìm, C, 100 ìm, D, 100 ìm, E 500 ìm.
Discussion
rAAV vektorer blir alltmer värdefulla för in vivo-studier på djur. Här har vi beskrivit en enkel och billig protokoll för att producera rAAVs, som kan underlätta den utbredda tillämpningen av denna nyttiga vektor genom att undvika kostsamma outsourcing av viruset produktion till företag. Det protokoll (baserat på referens 1) beskriver produktionen av chimära rAAV1 / 2 vektorer som innehåller kapsid proteiner från båda föräldrarna serotyper på lika nyckeltal 4. Rening av rAAV vektorer genom att binda till heparin kolumner bygger på uttrycket av AAV2 kapsid proteiner, men kan kombineras med serotyper andra än AAV1 beskrivs här. Dessutom har AAV6 rapporterats att binda till heparin, men med en lägre affinitet, och skulle kunna renas med heparin kolumner med hjälp av denna procedur 5,6. Noteras bör dock att andra serotyper kommer att kräva olika koncentrationer av NaCl för heparin kolumnen eluering 5,7.
Förpackningar rAAV genomen har visat sig vara optimal mellan 4,1 och 4,9 kb med en kraftig minskning av förpackningar verkningsgrad på upp till 5,2 kb 8. Denna förpackning gräns kan anses vara den största nackdelen med den rAAV system, eftersom celltyp reglering av transgenens uttrycket uppnås vanligen med stora cis agerar element som inte kan rymmas inom de små AAV partiklar. För att övervinna låg titer partier, såsom sådana som härrör från att försöka paket gener som ligger nära AAV packning begränsar vi kombinerar olika virus partier koncentrerad till 250 l till ett 500 l parti, snarare än att lägga till PBS som beskrivs i steg 6,3. Pålitlig celltyp specifika transduktion kan uppnås genom att kombinera Cre-driver möss och villkorliga kassetter rAAV (se nedan) för att undvika stretching förpackningen gränsen.
Att notera, medan detta protokoll försöker ge enkla att följa instruktionerna på produktion av hög titer rAAV krävs det närvaro av AAV2 kapsid protein beståndsdelarna för rening av heparin affinitetskromatografi. Serotyper än AAV2 skall renas med hjälp av alternativa förfaranden 9. En fördel med heparin kolumn rening är det tros att producera AAV vektorer som har större smittsamhet takt än som producerats med hjälp av en cesiumklorid lutning 10. Men det finns också vissa nackdelar med denna metod. Till exempel kan andra proteiner som binder heparin också vara närvarande i det renade virala lager. Medan tropism av heparin-renat vektorer kan påverkas av vektorn titer 10, vårt sätt att särskilt inrikta antingen excitatoriska 20 eller hämmande nervceller (Fig. 2) sysselsätter Cre-inducerad aktivering av AAV-medierad transgenens uttryck och är titer-oberoende. Ett alternativ till heparin kolumnen rening är att använda en iodixanol densitetsgradient, vilket ger en högre virus titer och renare förberedelser än användning aven cesiumklorid lutning 10. Denna metod kan också kombineras med heparin kolumnen rening för att producera en vektor som är större än 99% ren 11. Därför måste övervägas noga som ska vidtas av enskilda grupper om vilka virus rening metod är bäst för just deras nedströms ansökan.
Det vanligaste problemet i samband med detta protokoll är låg virus-titer. Enligt vår erfarenhet här kan vanligtvis spåras till låga transfektion effektivitet, eller eluering av virus från heparin kolumner. Alla transfektion material ska i rumstemperatur innan transfektion, och testa transfections bör utföras för att hitta de optimala förhållandena i varje laboratorium. Andra metoder för transfektion, såsom lipofectamine, är mycket effektiva, men kan vara oöverkomligt dyr. Dessutom är koncentrationen och pH-värdet i heparinlösningar kolumnen eluering kritiskt för komplett eluering av virioner från heparin kolumner withoUT skador. En annan viktig punkt är att förpackningen cellerna måste följa väl till ytan på disken vävnadsodling. Om cellerna loss vid något tillfälle under förfarandet är det tillrådligt att avsluta försöket och tina en ny flaska av celler.
Tid och rum styrning av transgenen uttryck hos gnagare är lätt uppnås genom korrekt anatomisk inriktning och utvecklingsstadiet av djuret. Effektiv AAV-medierad genöverföring har visats i livmodern 12,13. I den vuxna hjärnan, kan det område som är smittat med rAAV partiklar efter stereotaxic injektion justeras från mycket små utvalda regioner, till mycket större områden inte bara av förändringar i det virala titer, men också genom att ändra injektion parametrar. Dessa inkluderar volym och hastighet injektioner och införlivandet av polyol mannitol med virussuspension 14. Mannitol kan också användas för att förbättra infektion i olika vävnader efter systemisk rAAV injektion 15 </ Sup>.
Förpackningen kapacitet rAAV (ca 4,7 kb) är förmodligen den mest begränsande faktorn i termer av gener som kan uttryckas från dessa virala vektorer. Dock har nya studier visat att detta delvis kan övervinnas genom att dela upp större gener eller kassetter uttryck i separata rAAV vektorer och införa ett överbryggande sekvens, initiera genexpression när virioner infekterar samma cell 16. Uttryck nivåer av gener som bärs av rAAV vektorer kan också förbättras avsevärt genom att använda egen gratis rAAV vektorer 17. Stereotaxic injektion av rAAV vektorer ger en snabb, billig och kraftfull metod för att inducera genuttryck i en region-specifika sätt. I kombination med två RNA andra generationens interferens strategier 18 rAAVs kan också användas för region-specifika gener slå ner. rAAVs kan kombineras med Cre-transgena möss eller celltyp specifika projektansvariga att åstadkomma krets-och cell-typ-Specifik genuttryck, som möjliggör genetiska manipulationer med hög rumslig upplösning 2,19-21, medan montering rAAVs med t.ex. Tet Systemet lägger tidsmässiga kontroll över virus-medierad genuttryck 22,23. Dessa exempel visar den enorma combinatorial potentialen hos dessa vektorer och förutspår en snabb ökning av rAAV-baserade studier under de kommande åren.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
References
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
