Summary
Rekombinant adeno-associeret virus (rAAVs) vektorer bliver stadig mere værdifuld for
Abstract
I de senere år rekombinant adeno-associeret virale vektorer (AAV) er blevet stadig mere værdifuld for in vivo undersøgelser på dyr, og er også i øjeblikket testet i humane kliniske undersøgelser. Vildtype-AAV er en ikke-patogene medlem af parvoviridae familien og i sagens natur replikationskompetente mangelfuld. Den brede transduktion profil, lavt immunforsvar samt den stærke og vedvarende transgenet udtryk opnås med disse vektorer har gjort dem til et populært og alsidigt værktøj for in vitro og in vivo gen levering. rAAVs kan nemt og billigt produceret i laboratoriet, og baseret på deres gunstige sikkerhedsprofil, er generelt får en lav sikkerhed klassifikation. Her beskriver vi en metode til produktion og titering af kimære rAAVs indeholder kapsid proteiner af både AAV1 og AAV2. Brugen af disse såkaldte kimære vektorer kombinerer fordelene af begge forældres serotyper såsom høje titre bestande (AAV1) og rensningved affinitets kromatografi (AAV2). Disse AAV serotyper er de bedst undersøgte af alle AAV serotyper, og individuelt har en bred infektivitet mønster. De kimære vektorer, der er beskrevet her, bør have smitsomme egenskaber AAV1 og AAV2 og kan således forventes at inficere en lang række væv, herunder neuroner, skeletmuskulatur, bugspytkirtel, nyre blandt andre. Den metode, der beskrives her bruger heparin kolonne oprensning, en metode som menes at give en højere viral titer og renere virale forberedelser end andre rensning metoder, såsom centrifugering gennem en caesiumchlorid gradient. Derudover beskriver vi, hvordan disse vektorer kan hurtigt og nemt titered at give nøjagtig måling af antallet af smitsomme producerede partikler.
Protocol
Se figur 1 for en illustration opsummerer de følgende protokol.
Sikkerhed Bemærk: Alt materiale, der har været i kontakt med samlet viruspartikler skal desinficeres med Virkon løsning eller andet egnet desinfektionsmiddel.
1. Udarbejdelse af plasmid DNA bestande (~ 2 dage)
- Følgende plasmider kræves 1:
- pRV1 - Med indhold af AAV2 Rep og Cap sekvenser
- pH21 - Med indhold af AAV1 Rep og Cap sekvenser
- pFdelta6 - Adenovirus-hjælper plasmid
- AAV plasmid, som indeholder den rekombinante udtryk kassetten flankeret af AAV2 emballage signaler (omvendt terminal gentager, ITRS)
- Mens pFdelta6 skal dyrkes i Stbl2 kompetente celler for at undgå delvis sletning, kan pRV1 og pH21 dyrkes i DH5alpha kompetente celler. AAV plasmider kan dyrkes i Stbl2 celler, hvis delvise sletninger forekomme i DH5alpha celler.
- Plasmid DNA skal være af høj kvalitet og fri for RNA forurenende stoffer. Plasmider kan screenes for integritet ved hjælp af følgende fordøjer:
- pRV1 - Digest med XbaI at give bands på 7,5 kb og 3,8 kb
- pH21 - Digest med EcoRI at give bands på 4,5 kb, 2,8 kb og 0,2 kb
- pFdelta6 - Digest med HindIII at give bands på 5,5 kb, 3 KB, 3 kb, 2,3 kb og 1,5 kb
2. Udarbejdelse af humane embryonale Nyre 293 (Hek293) celler til transfektion (2 - 3 dage)
- Plate to 80% sammenflydende 150 cm 2 flasker af Hek293 celler i fem 15 cm diameter Nunc vævskultur retter. Cellerne skal være 70 - 80% sammenflydende før transfektion (ca. 48 timer efter plating). Kultur celler i standard Dulbecco ændrede Eagle medium (DMEM) med lav glukose indeholder 10% føtalt kalveserum og 100 E / ml penicillin / 100 mg / ml streptomycin.
- 3 timer før transfektion fjerner DMEM og erstatte med Iscove'S modificeret Dulbecco er medium (IMDM) indeholdende 5% føtalt kalveserum.
3. Transfektion af virale plasmider (~ 1 time til transfektion, 3 dage for inkubation)
- Forbered følgende for et enkelt parti (5 x 15 cm vævskultur plader) af virus:
- 62,5 mikrogram AAV plasmid
- 125 mikrogram pFdelta6
- 31,25 mikrogram pRV1
- 31,25 mikrogram pH21
- 1650 μl 2,5 M CaCl 2
- 12 ml dH 2 O
- I en klasse 2 vævskultur hætte sterile filtrere transfektion blandingen i et 50 ml rør.
- Mens hvirvelblanding løsningen, hurtigt at tilføje 13 ml 2 x HEPES bufferet saltvand (pH 7,05). Sæt låg på 50 ml rør og fortsætter med at vortex i 15 sekunder. Lad dem stå i 1 minut 45 sekunder, skal et fint hvidt bundfald form.
- Forsigtigt tilsættes 5 ml af transfektion løsningen på hver 15 cm vævskultur fad. Swirl plader at blande og vende tilbage til kuvøsen.
- 16 timer efter transfektion fjerne IMDM medium og erstatte med DMEM.
4. Lysing af celler og høst af rAAVs (2 timer)
- 72 timer efter transfektion, fjerne medier fra cellekultur plader og kassér. Alt affald skal behandles med Virkon løsning eller andet egnet desinfektionsmiddel.
- Vask forsigtigt cellerne i varme 1x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4).
- Tilsæt 25 ml varm PBS til hver plade, og forsigtigt fjerne celler med en celle skraber. Saml suspension i 50 ml rør.
- Pellet cellerne ved 800 xgi 10 minutter.
- Kassér supernatanten og resuspender pellet i 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, bruge 10 ml pr vævskultur plade. Opdelt i to 50 ml rør.
- Forbered en frisk opløsning af 10% natriumdeoxycholat i DH 2 O. Tilsæt 1,25 ml af denne til hvert rør i en endelig koncentration på 0,5%. Tilføj benzonase nuklease til en endelig koncentration på 50 enheder per ml. Bland rør grundigt.
- Fjern celleaffald ved centrifugering ved 3000 xgi 15 min. Overførsel til frisk 50 ml tube, sikre, at alle cellefragment er blevet fjernet for at forhindre blokering af heparin kolonner (se trin 5). På dette stadium, kan prøverne opbevares ved -20 ° C, før du fortsætter. Vi har gemt prøver i flere uger ved -20 ° C uden en reduktion i smitteevne.
5. Heparin kolonne oprensning af rAAVs (2 - 3 timer)
- Opsætning HiTrap heparin kolonner ved hjælp af en peristaltisk pumpe, så løsninger flow gennem kolonnen med 1 ml per minut for trin fra 5,2 til 5,4. Det er vigtigt at sikre, at ingen luftbobler er indført i heparin kolonnen.
- Ligevægt kolonnen med 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
- Anvend 50 ml virus løsning på kolonnen og lad dem flyde igennem.
- Vask kolonnen med 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
- Ved hjælp af en 5 ml sprøjte fortsætte med at vaske kolonnen wed 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, efterfulgt af 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Kassér gennemstrømning.
- Brug 5 ml sprøjter og blide tryk elueres virus fra kolonnen ved at anvende:
- 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
- Saml disse i et 15 ml centrifugerør.
6. Koncentration og steril filtrering af rAAVs (1 time)
- Koncentrat vektor hjælp Amicon ultra-4 centrifugal filteranlæg med en 100.000 molekylvægt cutoff. Load 4 ml af kolonne eluat i koncentrator og centrifuger ved 2000 xgi 2 minutter (ved stuetemperatur). Kassér gennemstrømning og genindlæs koncentrator med resterende virus løsning, og gentag centrifugering. Den koncentrerede mængde bør være cirka 250 μl. Hvis koncentrerede volumen er betydeligt mere end dette, kasseres flow through og fortsætte med at centrifugere i et minut trin, indtil lydstyrken er cirka 250 μl.
- Tilsæt 250 μl af PBS til at virus til et endeligt volumen på 500 μl og fjerne fra koncentrator.
- Filtrer vektor gennem et 13 mm diameter 0,2 μm sprøjte filter. Vector skal alikvoteres og opbevares ved -80 ° C, indtil påkrævet.
7. Titering af virale lagre (3 dage)
Det kræver en promotor, der er aktiv i Hek293 celler køre en reporter gen eller en immunocytochemically påviselig gen produkt. Ved fremstilling af en vektor, der ikke er kompatibel med Hek293 celler andre cellelinjer og primære cellekulturer kan anvendes.
- Forbered 18 poly-L-lysin-belagte glas dækglas eller 18 brønde i Nunc kammer dias ved såning Hek293 celler, så de er 40 - 50% sammenflydende. Ved titrering af Cre-afhængige rAAVs brug Hek293 celler, der stabilt udtrykker Cre recombinase 2.
- Inficere hver brønd med seriel dilutions af AAV vektor (Fig. 2A). Brug 3 brønde pr fortynding. Vi rutinemæssigt tilføjer virus direkte til hver brønd.
- Efter 72 timer fix Hek293 celler ved at tilføje en tilsvarende mængde på 4% paraformaldehyd (PFA) til medium (hvilket giver en endelig koncentration på 2% PFA) i ti minutter ved stuetemperatur.
- Vask celle tre gange i PBS, skylles i dH 2 O og dækglas.
- Tæl antallet af transduced celler fra de tre brønde, der har den højeste fortyndingsfaktoren, men stadig indeholder inficerede celler, finde gennemsnittet af disse og ganges med fortyndingsfaktoren for at oplyse om antallet af infektiøse enheder pr mikroliter (Fig. 2B).
8. Forventede resultater
Hek293 celler transduced med en virus kodning forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) er vist i figur 2B. Vi generelt opnå konsistente titre af omkring 6 x 10 6 infektiøse partikler per mikroliter. Vi rutinemæssigt bruger disse vektorer for stereotaxic injeIndsatsen i den voksne gnavere hjernen. Dette giver en kraftfuld teknik til region-specifikke genekspression 2. At kombinere denne region specificitet med celle-typen selektive genekspression vi injicere Cre recombinase-afhængige rAAVs i mål-regioner Cre-transgene mus 2. Figur 2C-E viser eksempler på stereotaxic injektioner af Cre-afhængige rAAVs kodning eGFP i forskellige områder i hjernen af voksne parvalbumin-Cre transgene mus 3.
Figur 1. Skematisk illustration af protokollen for rAAV produktion. . 1) Hek293 celler er belagt og er vokset til 70 - 80% sammenløb. 2). AAV og hjælper plasmider er forberedt og transficeret ind Hek293 celler. 3.) Medium er ændret tilbage til DMEM 16 timer efter transfektering og Hek293 celler dyrkes i endnu 56 timer. 4). Hek293 celler er høstet og lyseret. rAAV vektorer er adskilt fra cellefragment af centrifugation. 5). Viral partikler er renset gennem heparin kolonner, før koncentrationen og sterilisering. 6.) Hek293 celler dyrkes den 24 samt plader og der inficeres med serielle fortyndinger af AAV vektor til at bestemme antallet af infektiøse enheder.
Figur 2. Titering og in vivo anvendelse af rAAV1 / 2. (A) Opsætning af Hek293 celler til måling af viral titer. Hek293 celler er transduced med serielle fortyndinger af rAAVs. C, uinficerede kontrol, N, 1 ml af ufortyndet viral lager. (B) Hek293 celler inficeret med rAAVs udtrykke eGFP. (CE) Viral eGFP udtryk er begrænset til Cre-udtrykkende neuroner i forskellige mål regioner parvalbumin-Cre transgene mus efter stereotaxic injektion af Cre-aktiverede rAAVs. Eksempler billeder viser GFP immunoreaktivitet i (C) reticular thalamus og globus pallidus, (D) dentate gyrus og (E) CA1 region i hippocampus. GD, dentate gyrus, RT, retikulære thalamic kerne; GP, globus pallidus. Skala barer: B, 500 μm, C, 100 mM, D, 100 mM, E, 500 μm.
Discussion
rAAV vektorer bliver mere og mere værdifulde for in vivo undersøgelser på dyr. Her har vi beskrevet en simpel og billig protokol til fremstilling rAAVs, der kan lette den udbredte anvendelse af denne nyttige vektor ved at undgå de dyre outsourcing af virus produktion til virksomheder. Protokollen (baseret på reference 1) beskriver produktion af kimære rAAV1 / 2 vektorer indeholdende kapsid proteiner fra begge forældrenes serotyper med lige nøgletal 4. Rensning af rAAV vektorer ved binding til heparin kolonner afhængig af ekspressionen af AAV2 kapsid proteiner, men kan kombineres med serotyper end AAV1 skitseret her. Derudover har AAV6 blevet rapporteret at binde sig til heparin, dog med en reduceret affinitet, og potentielt kunne renses med heparin kolonner ved hjælp af denne procedure 5,6. Det skal dog bemærkes, at andre serotyper vil kræve forskellige koncentrationer af NaCl for heparin kolonne eluering 5,7.
Emballage rAAV genomer viste sig at være optimalt mellem 4,1 og 4,9 kb med en kraftig reduktion i emballage effektivitet på op til 5,2 KB 8. Denne emballage grænse kan betragtes som den største ulempe ved rAAV systemet, da celletype-specifikke regulering af transgene udtryk normalt opnås ved store cis handler elementer, som ikke kan rummes inden for de små AAV partikler. For at overvinde lav titer partier, såsom dem, der skyldes at forsøge at pakke gener, der er tæt på AAV pakning grænsen vi kombinerer separate viral partier koncentreret til 250 μl i en 500 μl parti, snarere end at tilføje PBS som beskrevet i trin 6.3. Pålidelig celle-typespecifikke transduktion kan opnås ved at kombinere Cre-driver mus og betingede rAAV kassetter (se nedenfor) for at undgå at strække emballagen grænse.
Det skal bemærkes, mens denne protokol forsøger at give let at følge instruktionerne på produktion af høj titer rAAV, det kræver tilstedeværelse af AAV2 kapsid protein fragmenter for rensning ved heparin affinitetskromatografi. Serotyper end AAV2 skal renses ved hjælp af alternative procedurer 9. En fordel ved heparin kolonne rensning er det menes at producere AAV vektorer, som har større infektivitet end produceret dem der bruger en caesiumchlorid gradient 10. Der er dog også nogle ulemper ved denne metode. For eksempel kan andre proteiner, der binder heparin også være til stede i den rensede virus-bestanden. Mens tropisme af heparin-renset vektorer kan være påvirket af vektoren titer 10, vores tilgang til specifikt at målrette enten excitatoriske 20 eller hæmmende neuroner (fig. 2) beskæftiger Cre-induceret aktivering af AAV-medieret transgene udtryk og er titer-uafhængig. Et alternativ til heparin kolonne rensning er brugen af en iodixanol densitetsgradient, som producerer en højere viral titer og renere forberedelse end brugen afen caesiumchlorid gradient 10. Denne metode kan også kombineres med heparin kolonne rensning for at producere en vektor, der er større end 99% ren 11. Derfor omhyggelige overvejelser skal tages af de enkelte grupper, som viral rensning metode er bedst for deres særlige downstream anvendelse.
Det mest almindelige problem forbundet med denne protokol er lavt viral titer. Det er vores erfaring dette kan som regel spores tilbage til lav transfektion effektivitet, eller eluering af virus fra heparin kolonner. Alle transfektion materialer bør have stuetemperatur før transfektion, og test transfections skal udføres for at finde de optimale betingelser i hvert enkelt laboratorium. Andre metoder til transfektion, såsom lipofectamine, er meget effektive, men det kan være uoverkommeligt dyre. Derudover koncentrationen og pH af heparin kolonnen elueringen løsninger er afgørende for komplet eluering af virioner fra heparin kolonner without skader. Et andet vigtigt punkt er, at emballagen celler skal holde godt på overfladen af vævskultur retter. Hvis cellerne løsne sig på et tidspunkt i løbet af proceduren anbefales det at afslutte eksperimentet og afrimning et nyt hætteglas med celler.
Spatio-temporale kontrol af transgene udtryk i gnavere er let opnås ved at præcise anatomiske målrette og udviklingsstadium af dyret. Effektiv AAV-medieret genoverførsel er blevet vist i livmoderen 12,13. I den voksne hjerne, kan området inficeret med rAAV partikler efter stereotaxic injektion justeres fra meget små målrettede regioner, til langt større områder, der ikke kun af ændringer i den virale titer, men også ved at ændre injektion parametre. Disse indbefatter bl.a. mængde og hastighed af injektioner og inddragelsen af polyol mannitol med virussuspension 14. Mannitol kan også bruges til at øge infektion i en række forskellige væv efter systemisk rAAV injektion 15 </ Sup>.
Emballagen kapacitet rAAV (cirka 4,7 kb) er nok den mest begrænsende faktor i forhold til de gener, der kan udtrykkes fra disse virale vektorer. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at dette delvis kan overvindes ved at dele større gener eller udtryk kassetter i separate rAAV vektorer og indføre en bro sekvens, indleder genekspression, når virioner inficere den samme celle 16. Expression niveauer af gener bæres af rAAV vektorer kan også blive øget væsentligt ved hjælp af selv-gratis rAAV vektorer 17. Stereotaxic injektion af rAAV vektorer giver en hurtig, billig og effektiv metode til at fremkalde genekspression i en region-specifik måde. I kombination med 2. generation RNA-interferens strategier 18 rAAVs kan også bruges til region-specifikke gen-knock down. rAAVs kan kombineres med Cre-transgene mus eller celle-typespecifikke initiativtagere at opnå kredsløbs-og celle-type-Specifik genekspression, som gør det genetiske manipulationer med høj rumlig opløsning 2,19-21, mens montering rAAVs med fx Tet-systemet tilføjer tidsmæssig kontrol over virus-medieret genekspression 22,23. Disse eksempler illustrerer den enorme kombinatoriske potentiale i disse vektorer og forudsige en hurtig stigning i rAAV-baserede undersøgelser i løbet af de kommende år.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
References
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
