हम एक बाँझ सतत प्रवाह सर्किट में विषय पक्षपाती लामिना का प्रवाह कतरनी तनाव को कोशिकाओं के लिए एक विधि का वर्णन कर रहे हैं. 'कोशिकाओं के आसंजन, आकारिकी पारदर्शी कक्ष के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है, metabolite विश्लेषण और भविष्य के प्रयोगों या संस्कृति के लिए कतरनी प्रदर्शन के बाद काटा कोशिकाओं के लिए सर्किट से प्राप्त नमूनों.
इस विधि के समग्र लक्ष्य लामिना का प्रवाह शर्तों के अनुयायी कोशिकाओं का विषय है और उनकी अच्छी तरह से quantifiable द्रव कतरनी 1 जोर दिया करने के लिए प्रतिक्रिया का मूल्यांकन तकनीक का वर्णन है.
हमारे प्रवाह कक्ष डिजाइन और प्रवाह सर्किट (छवि 1) एक पारदर्शी देखने क्षेत्र है कि सेल और सेल आकारिकी के आसंजन इमेजिंग के परीक्षण के तुरंत प्रवाह पहले (छवि 11a, बी) में सक्षम बनाता है, (छवि 11C) के प्रवाह के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर होता है , और बाद में प्रवाह (11D छवि). इन प्रयोगों मानव गर्भनाल के साथ सचित्र हैं रक्त व्युत्पन्न endothelial पूर्वज (निर्यात संवर्धन परिषदों) कोशिकाओं और सुअर का निर्यात संवर्धन परिषदों 2,3.
इस विधि भी अन्य पक्षपाती सेल प्रकार, जैसे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SMCs) या fibroblasts के लिए लागू है.
कक्ष और सर्किट के सभी भागों को आसानी से भाप वाष्पदावी विसंक्रण के साथ निष्फल रहे हैं. दूसरे के विपरीतकक्षों, जैसे microfluidic कक्षों, कोशिकाओं (> 1 मिलियन सेल आकार पर निर्भर करता है) की बड़ी संख्या बाँझ शर्तों के तहत सेल संस्कृति या अन्य प्रयोगों, जैसे डीएनए या शाही सेना निकासी, या immunohistochemistry (11E छवि) के लिए प्रवाह प्रयोग के बाद बरामद किया जा सकता है, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5 स्कैनिंग. कतरनी तनाव perfusate, तरल पदार्थ दलदलापन, या चैनल ऊंचाई और चौड़ाई के प्रवाह की दर अलग से समायोजित किया जा सकता है. बाद तरल पदार्थ की मात्रा या सेल की जरूरत को कम जबकि यह सुनिश्चित करना है कि एक आयामी प्रवाह बनाए रखा है सकते हैं. यह प्रयोगों के बीच चैम्बर ऊंचाई मापने के लिए आवश्यक नहीं है, के बाद चैम्बर ऊंचाई gaskets के प्रयोग है, जो बहुत कई प्रयोगों की आसानी बढ़ जाती है पर निर्भर नहीं करता है. इसके अलावा, सर्किट डिजाइन आसानी से सक्षम बनाता है और विश्लेषण या तरल पदार्थ कतरनी तनाव जोखिम के तहत कोशिकाओं द्वारा secreted चयापचयों की मात्रा का ठहराव / जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड (12 छवि) 6 perfusate नमूनों का संग्रह </sup>.
हमारे प्रवाह सर्किट और प्रवाह चैम्बर हमें पक्षपाती कोशिकाओं, परिभाषित द्रव कतरनी तनाव जैसे निर्यात संवर्धन परिषदों, विषय के लिए अनुमति देते हैं. चैम्बर ऊपर और नीचे के बाद से कर रहे हैं पारदर्शी, कोशिका आसंजन और आकारिकी वास्तविक समय में या तो मूल्यांकन कर सकते हैं, कक्ष के माध्यम से ही, या एक प्रवाह और प्रवाह कक्ष के disassembly प्रयोग के बाद. उस बिंदु पर, कोशिकाओं बाँझ शर्तों के तहत काटा जा सकता है और या तो फिर से मढ़वाया, या आगे के विश्लेषण के लिए उनके डीएनए या शाही सेना, आदि, लेने के लिए इस्तेमाल किया.
लामिना का प्रवाह को प्राप्त करने के लिए, कक्ष का डिजाइन ऐसा है कि कई स्थितियों से मुलाकात कर रहे हैं होना चाहिए.
सबसे पहले, प्रवाह लामिना, जो अपनी रेनॉल्ड्स (रे) संख्या है, जो चिपचिपा बलों को inertial बलों के अनुपात की गणना के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है है किया जाना चाहिए. (यदि चिपचिपा बलों प्रबल होना, पुन छोटा है और प्रवाह लामिना या 'पूरी तरह से विकसित' है – रे <2300 के लिए आम तौर पर .यदि inertial बलों प्रबल होना, प्रवाह और अधिक से अधिक यादृच्छिक हो जाता है जब तक यह अशांत है, के रूप में पुन> 4000 के लिए मामला है) हम 3 8 समीकरण अनुसार पुनः गणना कर सकते हैं,
कहाँ ρ द्रव घनत्व है, क्यू प्रवाह दर है, μ दलदलापन है, w और घंटे चौड़ाई और कक्ष की ऊंचाई, क्रमशः रहे हैं, और डी घंटे हाइड्रोलिक व्यास, 4 समीकरण 8 के अनुसार परिभाषित है,
रेनॉल्ड्स हमारे तीन प्रवाह कक्षों की संख्या, 166 से लेकर हाइट्स के साथ – 267 सुक्ष्ममापी, 13.9 से लेकर – प्रवाह दरों में 34.6 ग15 dynes / 2 सेमी की एक कतरनी तनाव प्राप्त करने के लिए alculated. 234 – 100 dynes / 2 सेमी की एक कतरनी तनाव के लिए गणना प्रवाह दरों पर, कक्षों की रेनॉल्ड्स संख्या 90.4 से लेकर . इन रेनॉल्ड्स संख्या के सभी 2300 की तुलना में बहुत कम हैं और लामिना का प्रवाह के लिए कसौटी को पूरा.
दूसरा, वेग क्षेत्र और कतरनी तनाव के लिए प्रवाह चैनल (यानी पूरी तरह से विकसित), द्रव इनलेट से दूरी के लिए प्रवेश द्वार लंबाई, एल ई की तुलना में अब होना चाहिए स्लाइड के साथ दूरी के स्वतंत्र होने के लिए. इस प्रवेश द्वार लंबाई की गणना के द्वारा संतुष्ट किया जा सकता है 9 5 समीकरण के अनुसार .
उपरोक्त मान के लिए, प्रवेश की लंबाई 0.01 से 0.25 सेमी तक पर्वतमाला.
तीसरा, आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि वेग और पार्श्व दिशा में कतरनी तनाव भिन्न नहीं हैसे काफी एक आयामी चैनल प्रवाह के लिए मूल्य (Δ पीएचडी / 2L), / ज w अनुपात 1 से काफी कम किया जाना चाहिए. दो आयामी प्रवाह शर्तों के तहत औसत दीवार कतरनी तनाव के लिए एक आयामी प्रवाह के तहत दीवार कतरनी तनाव का 95% हो के लिए, / ज w 0.10 करने के लिए बराबर हो, और दो आयामी प्रवाह शर्तों के तहत दीवार कतरनी तनाव के लिए हो सकता है एक आयामी प्रवाह के तहत दीवार कतरनी तनाव के 97.5%, / ज w 0.05 करने के लिए बराबर होना चाहिए. हमारे डिजाइन प्रवाह कक्ष चौड़ाई में 1.7 सेमी और 166 के आयामों के साथ – ऊंचाई में 267 सुक्ष्ममापी, इन मानदंडों को संतुष्ट कर रहे हैं.
दबाव केवल प्रवाह की दिशा में भिन्न अगर वहाँ प्रवेश द्वार पर कोई पार्श्व दबाव gradients. यह प्रवाह – पथ में रंजक या कणों का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, निरंतर प्रवाह प्रयोगों के लिए, एक पल्स dampener प्रवाह सर्किट में डाला जाता है. पल्स dampener puls के बाहर सबसे अधिक लेता हैatility सर्किट में रोलर पंप की वजह से है, और हमें सतत प्रवाह के लगभग धारणा करने की अनुमति देता है. ध्यान से, नाड़ी का उपयोग dampener पंप और टयूबिंग के सर्किट में इस्तेमाल के साथ संगत हो सकता है, इतना है कि यह प्रभावी ढंग से रोलर पंप के विशिष्ट आवृत्तियों के लिए उत्पादन के प्रवाह में pulsations को समाप्त कर सकते हैं चाहिए. हमारे प्रदर्शन में Masterflex एल / एस पल्स dampener लामिना का प्रवाह प्राप्त होता है जब किसी भी Masterflex श्रृंखला एल / एस पंप (0 – 600 RPMs के) के साथ निर्वहन लाइन पर इस्तेमाल किया है और मैं / पी 26 टयूबिंग. काँपने के गुणवाला प्रवाह के लिए, एक प्रोग्राम पंप विभिन्न waveforms उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
काँपने के गुणवाला प्रवाह के लिए, एक प्रोग्राम पंप विभिन्न waveforms उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इसके अलावा, सर्किट perfusate की कि ऐसे नमूने आसानी से प्रवाह या मध्यम कोशिकाओं के संक्रमण के जोखिम के बिना बनाया गया है अलग अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है. हमारे उदाहरण में, सं की एकाग्रता 2 – chemiluminescence के साथ मापा गया थाIonics Sievers / नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक (280 NOA, Sievers उपकरण, बोल्डर, CO) के रूप में पहले 10 में वर्णित है . नाइट्राट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया reductant एसिटिक एसिड (14.5 एम एसिटिक एसिड और 0.05 एम की) है, जो कमी संभावित सं नाइट्राइट कन्वर्ट है, लेकिन नाइट्रेट जैसे नाइट्रोजन के किसी भी उच्च आक्साइड को कम करने के लिए अपर्याप्त है में पोटेशियम योडिद था और इस तरह अपेक्षाकृत है नाइट्राट के लिए विशिष्ट. कुल राशि का उत्पादन नाइट्राइट उत्पादन एकाग्रता और सर्किट की कुल मात्रा के उत्पाद के रूप में गणना की गई, जबकि खो दिया है जबकि 6 नमूने लेने की मात्रा के लिए समायोजन.
निम्न चरणों का प्रवाह प्रयोगों के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हैं:
हमारे प्रवाह चैम्बर के एक संभव सीमा है कि ऊंचाई चैनल की ऊंचाई एल्यूमीनियम में machined द्वारा तय हो गई है. हालांकि, यह सत्यापित करने के लिए और प्रत्येक प्रयोग करने के लिए पहले चैनल की ऊंचाई समायोजित नहीं करने का लाभ है और इसलिए केवल वांछित मूल्य के लिए पंप प्रवाह का समायोजन करके कतरनी तनाव गणना सरल है. अपने अनुसंधान के लक्ष्यों पर निर्भर करता है, यह करने के लिए वांछनीय हो सकता हैपंप गति बढ़ाने के बिना कतरनी तनाव बढ़ा सकते हैं. इस मामले में हम perfusate दलदलापन बढ़ाने की सिफारिश, जैसे मध्यम 11 dextran जोड़ने .
प्रवाह सर्किट का एक संभव सीमा माध्यम की बड़ी मात्रा में प्रयोग किया जाता है, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब सेल चयापचयों का बहुत छोटे सांद्रता मात्रा ठहराना करने का प्रयास कर सकते हैं. हालांकि यहाँ दिखाया नहीं, यह संभव है करने के लिए काफी एक छोटे जलाशय और नाड़ी हतोत्साहित का उपयोग करके सर्किट मात्रा को कम करने और टयूबिंग की लंबाई और व्यास में कमी.
इसके अतिरिक्त, वहाँ कई अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम है कि संस्कृति में कोशिकाओं के लिए तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू इस्तेमाल किया जा सकता हैं. Microfluidic आधारित प्रणाली, Fluxion से BioFlux प्रणाली जैसे, विभिन्न microfluidic प्रवाह अच्छी तरह से और इन 12,13,14 चैनलों के लिए इनपुट और आउटपुट जलाशयों के रूप में अभिनय प्लेटों में समाधान के साथ भरी हुई चैनलों में कोशिकाओं के साथ – साथ विश्लेषण सक्षम. हालांकि, इन और अन्य सूक्ष्मfluidic प्रणाली मानक खुर्दबीन स्लाइड के साथ संगत नहीं हैं और RT-पीसीआर या वेस्टर्न ब्लाट के रूप में आगे प्रयोगों के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त बड़ी संख्या की वसूली के लिए अनुमति नहीं है. इसके अलावा, वे कम उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं, 40,000 डॉलर की एक न्यूनतम लागत और अधिक से अधिक $ 100,000 की कुल पहुंच सकता है, सहायक उपकरण पर निर्भर करता है.
दो macrofluidic Flexcell अंतर्राष्ट्रीय निगम, Flexcell की किरण और FlexFlow प्रणाली से उपलब्ध सिस्टम सफलतापूर्वक किया गया है करने के लिए endothelial कोशिकाओं 15,16,17, मानव वलय 18 कोशिकाओं और द्रव का प्रवाह शर्तों के तहत 19 fibroblasts अध्ययन किया. एक तिहाई प्रणाली, GlycoTech के माध्यम से उपलब्ध है, ट्यूमर कोशिका 20 आसंजन और endothelial monolayers ल्युकोसैट 21 आसंजन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है.
किरण प्रणाली कई स्लाइड्स एक ही बार में एक ही कतरनी तनाव की शर्तों के तहत चलाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन एक को देखने और खिड़की का अभाव है – हमारे विपरीतडिजाइन प्रवाह के तहत कोशिकाओं का वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति नहीं है.
FlexFlow प्रणाली एक को देखने की खिड़की है, लेकिन एक ईमानदार माइक्रोस्कोप, जो मानक ज्यादातर प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी नहीं हो सकता है की आवश्यकता है. इसके अलावा, FlexFlow प्रणाली सेल लिपटे एक कवर जब प्रवाह चैम्बर में रखा उलटा हो पर्ची की आवश्यकता है. यह जैसे टाइटेनियम – लेपित गिलास, एक अपारदर्शी सतह पर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं है, जो हम अपने अध्ययन में प्रदर्शन के दृश्य precludes. अन्त में, विशेष कवर फिसल जाता है के लिए विशेष रूप से FlexFlow प्रणाली है, जो बहु – हजार डॉलर कीमत रेंज में है Flexcell की किरण प्रणाली के लिए समान के लिए खरीदा जा जरूरत है.
GlycoTech परिपत्र और आयताकार समानांतर थाली प्रवाह कक्षों, जो काफी कम महंगा है, लेकिन डाली एक्रिलिक है कि आसानी से हमारे चैम्बर तरह autoclaved स्टेम नहीं किया जा सकता है से निर्मित कर रहे हैं प्रदान करता है. ध्यान से, अन्य प्रवाह कक्षों में वर्णित किया गया है कि Autoclavable होने के लिएक्योंकि वे विशेष सूक्ष्म 22,23 लेंस की आवश्यकता अव्यावहारिक दिखाई . GlycoTech प्रणाली सिलिकॉन रबर gaskets के ऊपर और नीचे प्लेटों के बीच interposed, जो दोहराया उपयोग के साथ मोटाई में परिवर्तन और इसलिए समय (निर्माता के बाद हर दस का उपयोग करता है नए क्रय की सिफारिश) पर चैम्बर ऊंचाई परिवर्तन का इस्तेमाल. हमारे O-अंगूठी में बनाया के साथ एल्यूमीनियम चैम्बर ऊपर और नीचे प्लेटों की पूरी विरोध के लिए अनुमति देता है और प्रयोगों के बीच लगातार कक्ष ऊंचाई सुनिश्चित करता है. अन्त में, वैक्यूम पंप करने के लिए कई प्रवाह चैम्बर डिजाइन में रिसाव प्रूफ मुहर सहित GlycoTech कक्षों, जो हमारे डिजाइन में आवश्यक नहीं कर रहे हैं, को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं.
जबकि यहाँ दिखाया नहीं, प्रवाह चैम्बर कोशिका आसंजन और / या व्यवहार के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए पूरे प्रवाह के प्रयोग के दौरान एक खुर्दबीन के नीचे रखा जा सकता है. अगर यह वांछित है, हम चैम्बर के तहत गर्मी दीपक या एक गर्म पैड का उपयोग करने की अनुशंसा पर 37 perfusate तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस फरवहाँ, रोलर पंप एक सिरिंज पंप के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यदि या तो कक्षों या चयापचयों या investigational दवाओं या एजेंटों का कोई पुनःपरिसंचरण '24 वांछित है .
पक्षपाती कोशिकाओं, सहधारा निर्यात संवर्धन परिषदों की एक परत पर जैसे फ्लोरोसेंट प्लेटलेट्स (प्लेटलेट Achneck एट अल द्वारा वर्णित परख का उपयोग 6,25) पर अलग लेबल कोशिकाओं प्रवाह द्रव कतरनी तनाव के अंतर्गत सेल करने वाली सेल बातचीत का मूल्यांकन यह भी संभव है. हमारे प्रवाह चैम्बर अन्य perfusate नमूने बंदरगाह और एक को देखने खिड़की के रूप में उपलब्ध प्रवाह कक्षों, मूल्यवान सुविधाओं को जोड़ती है है और या तो एक औंधा या ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ संगतता के महत्वपूर्ण लाभ है. यह पूरी तरह से Autoclavable है और निरंतर कक्ष ऊंचाई पर और वैक्यूम पंप की जरूरत के लिए एक leakproof मुहर प्राप्त करने के बिना दोहराया प्रयोगों के लिए अनुमति देता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों जो ओवेन बायोमेडिकल साधन और मशीन शॉप में मशीनिंग में और प्रवाह कक्षों के माध्यम से छवि कोशिकाओं को तकनीक में सहायता के लिए Leica माइक्रोसिस्टम्स से प्रवाह चैम्बर भागों और मैट Maudsley कोडांतरण अपने अथक प्रयासों के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. हम ड्यूक परफ्यूज़न सेवा से केविन कोलिन्स और प्रवाह सर्किट डिजाइन पर उपयोगी सुझाव के लिए बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग में डॉ. स्टीव वालेस ऋणी हैं. हम भी उनके समर्थन के लिए एलेक्जेंड्रा Jantzen और NIH अनुदान के माध्यम से "ऑटोलॉगस ईपीसी अस्तर के संचार के biocompatibility में सुधार उपकरणों की सहायता" RC1HL099863 01-समर्थन के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप कार्यक्रम को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Products / Reagents | Company | Product # |
10 ml Syringe | Cole Parmer Instrument Co. | 07940-12 |
1-Way Stopcoks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-00 |
30 ml Syringe | BD Medical | 309650 |
4 -Way Stopcocks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-04 |
Aluminum Alloy | N/A | 6061 |
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Scientific; Nunc | 267061 |
Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 |
DMSO | Research Organics | 2162D |
DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 |
EGM-2 Singlequots | Lonza | CC-4176 |
Female Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | SI-45500-04 |
Fibronectin | Sigma | F0895-2MG |
Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole Parmer Instrument Co. | 34594-24 |
Hard Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 06508-16 |
HBSS | Sigma | H8264-500ML |
Histopaque | Sigma | H8889-500ML |
Hoechst Stain Solution | Sigma | H6024 |
Hyclone FBS | Thermo Scientific | SH30071.01 |
L-glutamine | Lonza | 17-605E |
Male Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | EW-45505-04 |
MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV |
Barbed Polypropylene Fittings | Cole Parmer Instrument Co. | 06365-90 |
O-Rings | N/A | AS568A |
Pulse-Dampener | Cole Parmer Instrument Co. | 07596-20 |
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole Parmer Instrument Co. | 7524-40 |
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole Parmer Instrument Co. | 07518-60 |
Slide | Cole Parmer Instrument Co. | 48500-00 |
Soft Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 96400-16 |
Syringe filter | Cole Parmer Instrument Co. | 02915-12 |
Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 |
Trypsin EDTA | Lonza | CC-5012 |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 |