我们所描述的主题贴壁的细胞在无菌的连续流电路层流剪应力的方法。细胞的黏附,形态可通过透明腔研究,从代谢物的分析和对未来的实验或文化的剪切曝光后的干细胞的电路样本。
这种方法的总体目标是描述一个技术主题贴壁细胞层流情况,并评估他们的反应以及量化的流体剪切应力1。
我们的流动腔设计和流电路( 图1)包含一个透明的观赏地区,使细胞粘附和细胞形态的成像测试立即流前(图 11A,B)在不同时间点, 在流动 , (图11C)后流( 图11D)。这些实验说明了人类脐带血源性内皮祖细胞(EPCs)和猪内皮祖细胞2,3。
这种方法也适用于其他贴壁细胞类型,如平滑肌细胞(SMCS)或成纤维细胞。
很容易与蒸汽高压灭菌消毒室和电路的所有部分。相对于其他商会,可以恢复后的细胞培养或其他实验,如DNA或RNA的提取,或免疫组化( 图11E)在无菌条件下的流动实验,如微流体商会,大量细胞(> 100万对细胞的大小而定)或扫描电子显微镜5。剪应力可以调整不同的灌流,流体的粘度,或通道的高度和宽度的流量。后者可以减少液量或细胞的需求,同时确保维持一维流动。这是没有必要的试验室之间的高度来衡量,因为室高度不依赖于垫圈的使用,从而大大增加了多个实验的缓解。此外,电路设计,很容易使灌流液样本收集和/或由细胞分泌的流体切应力下暴露的代谢产物定量分析,例如一氧化氮( 图 12 )6 </suP>
我们的流量电路和流室,让我们的主题贴壁细胞,如内皮祖细胞,流体剪切应力定义。由于腔的顶部和底部的透明,细胞粘附和形态可以在实时评估,通过商会本身,或后一个流动的实验和拆卸流室。在这一点上,细胞可以收获无菌条件下,可以重新镀金,或用于收集他们的DNA或RNA等,作进一步的分析。
为了实现层流室的设计必须满足这样几个条件。
首先,流必须层,它可以通过计算其雷诺数(Re),这是惯性力与粘滞力的比例核实。 (如果粘滞力占主导地位 ,再小的流动是层流或“充分发展” -通常 RE < 2300。如果惯性力占主导地位,流动变得越来越随机,直到它是动荡的,是重新 > 4000),我们可以计算出再根据等式(3)8 ,
其中,ρ为流体密度,Q为流量,μ是粘度,w和 h的会议厅,分别在宽度和高度, 和 D H水力直径,根据方程4月8日,
雷诺数三流室,不等高度从166 – 267微米,范围从13.9 – 34.6流速彗星alculated获得15达因/厘米2的剪应力。在流速为100达因/厘米2的剪应力计算,分庭的雷诺数范围从90.4 – 234。所有这些雷诺数比2300低得多,并满足层流标准。
二,速度场和剪切应力沿流道(即充分开发),从流体入口的距离,幻灯片必须大于入口的长度,L E的距离无关。这可以得到满意的入口长度计算,根据方程5月9日 。
上面列出的值,入口长度范围从0.01至0.25厘米。
第三,以确保在横向方向,速度和剪应力不随显著,从一维渠道流值(ΔPH / 2L),H / W的比例必须小于1 。平均壁剪应力二维水流条件下,将根据一维流动壁面剪切应力的95%,H / W必须等于0.10,二维水流条件下的壁面剪切应力壁面剪切应力下的一维流动的97.5%,H / W必须等于0.05。我们设计的流室宽1.7厘米和166 – 267微米的高度尺寸,这些标准是满意的。
压力会随水流方向,如果没有在入口处的横向压力梯度。这可以使用染料或粒子流路进行评估。此外,源源不断实验,脉冲阻尼器插入流电路。脉冲阻尼器的PULSatility引起电路中的滚压泵,并允许我们近似假设源源不断。值得注意的是,应使用的脉冲阻尼器在电路中使用的泵和管兼容,使其可以有效地消除在特定频率辊泵的输出流量脉动。在我们的演示的Masterflex L / S脉冲阻尼器实现时,使用任何的Masterflex L / S系列泵(0 – 600的RPM)的放线和I / P 26管层流。脉动流,一个可编程的泵可用于生成各种波形。
脉动流,一个可编程的泵可用于生成各种波形。
此外,该电路是这样设计的灌流液样本可以很容易地在不同时间点收集细胞或流动介质的污染,而不用担心。在我们的例子中,浓度的NO 2 -化学发光测定一个离子学/的Sievers一氧化氮分析仪(NOA的280的Sievers仪器,博尔德,CO)的先前所描述的 10个。亚硝酸盐的分析中使用的还原剂是碘化钾,醋酸(14.5米乙酸和0.05 M碘化钾),已转换为NO的亚硝酸盐,但不足以减少任何更高,如硝酸盐氮氧化物减排潜力,因而是相对具体为亚硝酸盐。计算的总金额产生的亚硝酸盐是作为产品的生产集中度和电路的总体积,而丢失而采取样品6卷调整。
流实验的成功执行至关重要以下步骤:
一个可能的限制是我们的流动腔的高度是固定的通道高度加工的铝。但是,这并没有验证和调整通道的高度,每次实验前的优势,因此简化了剪应力计算,仅通过调整泵的流量为所需的值。根据您的研究目标,它可能是可取的剪应力不增加泵的转速增加。在这种情况下,我们建议增加灌流液的粘度,如添加葡聚糖中期 11 。
一个流电路的可能限制,介质的大量使用,可问题时,试图量化细胞代谢产物的浓度非常小。虽然这里没有显示,它有可能使用较小的水库和脉冲阻尼器,大大减少了电路体积,降低油管的长度和直径。
此外,还有其他一些市售的系统,可用于细胞培养应用流体切应力。基于微流体系统,如从Fluxion BioFlux系统,装载到作为输入和输出这些渠道12,13,14水库孔板的解决方案在不同的微流体流动渠道,使细胞的同时分析。然而,这些和其他微生物流体系统不兼容标准显微镜载玻片和不允许恢复了进一步的实验,如RT – PCR或免疫印迹,细胞数量足够大。此外,用户友好,成本最低40,000元,并有可能达到了总额超过10万美元,取决于配套设备。
两个macrofluidic系统Flexcell国际公司,Flexcell流光和FlexFlow系统,已成功地用于研究血管内皮细胞15,16,17,人类纤维环细胞18和19流体流动条件下的成纤维细胞。第三个系统,可通过GlycoTech,已利用研究20肿瘤细胞的粘附和白细胞粘附21日至内皮单层。
流光系统允许多张幻灯片,下一次相同的剪应力条件下运行,但缺乏一个观景窗 – 与我们设计 – 不允许进行实时可视化下流动的细胞。
FlexFlow系统有一个观景窗,但需要一个堂堂正正的显微镜,这可能不是在大多数实验室中使用的标准显微镜。此外,FlexFlow系统需要一个细胞涂的盖玻片置于流室倒立时。这排除了可视化荧光细胞上的不透明表面,如钛镀膜玻璃,这是我们在我们的研究表明。最后,专门盖玻片需要购买专门的FlexFlow系统,该系统是在多万美元的价格区间,类似Flexcell流光系统。
GlycoTech提供圆形和矩形平行板流商会,显著较便宜,但不能方便像我们商会蒸压干投丙烯酸制造。值得注意的是,其他流量已描述商会高压灭菌似乎是不切实际的,因为他们需要特殊的微观镜头22,23。 GlycoTech系统采用硅橡胶密封圈,顶板和底板之间的中间人,这将改变重复使用厚度的,因此随着时间的推移(采购后,每10个使用新的制造商建议)改变室高度。我们的铝腔可以与内置的O型圈顶部和底部板的完整的反对,并确保实验之间的不断室高度。最后,真空泵,是必要的,实现了在许多流室设计的密封防漏,包括GlycoTech商会,这是没有必要的设计。
虽然这里没有显示,可以保持流室,在显微镜下,在整个流程细胞的粘附和/或行为的实时成像实验。如果需要的话,这是我们建议使用下腔热灯或加热垫的灌流液的温度保持在37 ° C。毛皮在那里,可以更换辊筒泵用注射器泵,如果没有“再循环”无论细胞或代谢物或研究的药物或制剂所需的 24 。
它也有可能流过不同标记细胞的贴壁细胞,例如,超过一层融合内皮祖细胞荧光血小板(血小板检测Achneck 等 。6,25),细胞与细胞之间的相互作用下流体剪切力,以评估。我们的流动腔结合其他可用流商会,如灌流取样口和一个观景窗,有价值的功能,并有一个倒置或直立显微镜的兼容性的重要优势。它是完全可高压灭菌,并允许在不断室高度和无真空泵的需要,实现了防漏密封反复实验。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢乔欧文在生物医学仪器和机加工车间加工和装配莱卡微系统技术通过流商会协助形象细胞流动室部分和马特Maudsley在他的不懈努力。我们非常感激来自杜克灌注服务的凯文柯林斯博士和史蒂夫华莱士流电路设计上的有益的建议,生物医学工程学系。我们还要感谢国家科学基金会研究生研究奖学金计划,支持通过赠款亚历山德拉Jantzen和NIH的支持“自体的EPC的衬里,以改善循环系统的生物相容性协助设备”RC1HL099863 – 01。
Products / Reagents | Company | Product # |
10 ml Syringe | Cole Parmer Instrument Co. | 07940-12 |
1-Way Stopcoks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-00 |
30 ml Syringe | BD Medical | 309650 |
4 -Way Stopcocks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-04 |
Aluminum Alloy | N/A | 6061 |
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Scientific; Nunc | 267061 |
Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 |
DMSO | Research Organics | 2162D |
DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 |
EGM-2 Singlequots | Lonza | CC-4176 |
Female Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | SI-45500-04 |
Fibronectin | Sigma | F0895-2MG |
Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole Parmer Instrument Co. | 34594-24 |
Hard Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 06508-16 |
HBSS | Sigma | H8264-500ML |
Histopaque | Sigma | H8889-500ML |
Hoechst Stain Solution | Sigma | H6024 |
Hyclone FBS | Thermo Scientific | SH30071.01 |
L-glutamine | Lonza | 17-605E |
Male Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | EW-45505-04 |
MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV |
Barbed Polypropylene Fittings | Cole Parmer Instrument Co. | 06365-90 |
O-Rings | N/A | AS568A |
Pulse-Dampener | Cole Parmer Instrument Co. | 07596-20 |
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole Parmer Instrument Co. | 7524-40 |
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole Parmer Instrument Co. | 07518-60 |
Slide | Cole Parmer Instrument Co. | 48500-00 |
Soft Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 96400-16 |
Syringe filter | Cole Parmer Instrument Co. | 02915-12 |
Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 |
Trypsin EDTA | Lonza | CC-5012 |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 |