Vi beskriver en metode til at underkaste tilhænger celler til laminar flow shear stress i en steril kontinuerlig strøm kredsløb. Cellerne "vedhæftning, kan morfologi undersøges gennem den gennemsigtige kammeret, prøver fra kredsløbet for metabolit analyse og celler høstes efter forskydning eksponering for fremtidige eksperimenter eller kultur.
Det overordnede mål med denne metode er at beskrive en teknik til at underkaste tilhænger celler til laminar flow betingelser og evaluere deres reaktion på godt kvantificerbare væske forskydningsspændinger 1.
Vores flow kammer design og flow kredsløb (fig. 1) indeholder en gennemsigtig visning region, der tillader kontrol af celle vedhæftning og billeddannelse af cellemorfologi umiddelbart før flow (Fig. 11A, B), ved forskellige tidspunkter i løbet af flow (Fig. 11C) , og efter flow (Fig. 11D). Disse eksperimenter er illustreret med menneskelige navlestrengsblod afledt endothelial stamceller (EPC'er) og svin EPC'er 2,3.
Denne metode kan også anvendes i andre Tilhænger celletyper, f.eks glatte muskelceller (SMCs) eller fibroblaster.
Kammeret og alle dele af kredsløbet er let steriliseres med damp autoklavering. I modsætning til andrekamre, kan f.eks microfluidic kamre, et stort antal celler (> 1 mio afhængig af cellestørrelse), skal tilbagebetales, efter at strømmen eksperimentet under sterile forhold for cellekultur eller andre eksperimenter, fx DNA eller RNA ekstraktion, eller immunhistokemi (Fig. 11E), eller scanning elektronmikroskopi 5. Den forskydningsspænding kan justeres ved at variere flowhastighed af den perfusat væsken viskositet, eller kanalen højde og bredde. Sidstnævnte kan reducere væske volumen eller celle behov samtidig sikre, at en-dimensionelle flow opretholdes. Det er ikke nødvendigt at måle Afdeling højde mellem eksperimenter, da kammeret højden ikke afhænger af brugen af pakninger, hvilket øger den lethed af flere eksperimenter. Desuden kredsløbsdesign let muliggør indsamling af perfusatet prøver til analyse og / eller kvantificering af metabolitter udskilles af celler i væsker shear stress påvirkning, f.eks nitrogenoxid (Fig. 12) 6 </sup>.
Vores flow kredsløb og flow kammer giver os mulighed for at underkaste Tilhænger celler, fx EPC'er, til definerede væske forskydningsspændinger. Da kammeret top og bund er gennemsigtige, celleadhæsionsmolekyle og morfologi kan evalueres enten i real-tid, gennem kammeret selv, eller efter et flow eksperiment og demontering af flowet kammeret. På dette tidspunkt, kan cellerne høstes under sterile forhold og enten re-belagte, eller bruges til at hente deres DNA eller RNA, mv, til yderligere analyse.
For at opnå laminar flow, skal udformningen af kammeret være sådan, at flere betingelser er opfyldt.
Først skal strømmen være laminar, som kan verificeres ved at beregne sit Reynolds tal (Re), som er forholdet mellem inertikræfter til tyktflydende kræfter. (Hvis tyktflydende kræfter dominerer, Re er lille og strømmen er laminar eller 'fuldt udviklet' – normalt for Re <2300.Hvis inertikræfter dominerer, strømmen bliver mere og mere tilfældige, indtil det er turbulent, som det er tilfældet for Re> 4000.) Vi kan beregne Re henhold til ligning 3 8,
Hvor ρ er den væske tæthed, Q er flowet, μ er viskositeten, w og h er bredden og højden af kammeret, henholdsvis, og D h er det hydrauliske diameter, defineret i henhold til ligning 4 8,
Det Reynolds Antallet af vores tre flow kamre, med højder der spænder fra 166 til 267 μm, interval fra 13,9 til 34,6 på flowhastigheder calculated at opnå en shear stress på 15 dynes / cm 2. Ved strømningshastigheder beregnes for en forskydningsspænding på 100 dynes / cm 2, varierede Reynolds antallet af afdelinger, fra 90,4 til 234. Alle disse Reynolds tal er meget lavere end 2300 og opfylder kriteriet for laminar flow.
For det andet, at for den hastighed feltet og shear stress være uafhængig af afstanden langs strømmen kanal (dvs. fuldt udviklet), afstanden fra væsken indløb til at glide skal være længere end indgangen længde, L e. Dette kan opfyldes ved at beregne indgangen længde, ifølge ligning 5 9.
For de værdier, der er anført ovenfor, spænder indgangen længde 0,01 til 0,25 cm.
For det tredje, for at sikre, at hastigheden og shear stress i den laterale retning, ikke afvigerbetydeligt fra værdien for endimensionale kanal flow (Δ pH / 2L), skal forholdet h / w være langt mindre end 1. For den gennemsnitlige væggen forskydningsspænding under to-dimensionelle flow betingelser for at være 95% af muren forskydningsspænding under én-dimensionelle flow, skal h / w være lig med 0,10, og for muren forskydningsspænding under to-dimensionelle flow betingelser, som skal 97,5% af muren forskydningsspænding under én-dimensionelle flow, skal h / w være lig med 0,05. Med dimensioner af vores designet flow kammer 1,7 cm i bredden og 166 til 267 ìm i højden, er disse kriterier opfyldt.
Trykket varierer kun i retning af flow, hvis der ikke er nogen lateral pres gradienter ved indgangen. Dette kan vurderes ved hjælp af farvestoffer eller partikler i strømmen stien. Yderligere, for lind strøm eksperimenter, er en pulsdæmper indsat i strømmen kredsløb. Den pulsdæmper tager ud det meste af Pulsatility forårsaget af rullen pumpen i kredsløb, og giver os mulighed for at tilnærme antagelsen om lind strøm. Af note, skal pulsen udnyttes dæmper være foreneligt med pumpe og slanger, der anvendes i kredsløb, så den effektivt kan fjerne svingningerne i output flow for de specifikke frekvenser i valsen pumpen. I vores demonstration den Masterflex L / S pulsdæmper opnår laminar flow, når det bruges om decharge linje med enhver Masterflex L / S-serie pumpe (0 til 600 omdrejninger) og I / P 26 slanger. For pulsatile flow, kan en programmerbar pumpe bruges til at generere forskellige kurveformer.
For pulsatile flow, kan en programmerbar pumpe bruges til at generere forskellige kurveformer.
Desuden er kredsløbet konstrueret således, at prøver af perfusat kan nemt blive indsamlet på forskellige tidspunkter uden risiko for forurening af celler eller flow medium. I vores eksempel, at koncentrationen af NO 2 – blev målt ved kemiluminescence meden Ionics / Sievers Nitric Oxide Analyzer (NOA 280 af Sievers Instruments, Boulder, CO), som tidligere beskrevet 10. Det reduktionsmiddel anvendes til nitrit analyse blev kaliumiodid i eddikesyre (14,5 M eddikesyre og 0,05 M KI), der har reduktionspotentiale at konvertere nitrit til NO, men er utilstrækkelig til at mindske eventuelle højere nitrogenoxider, såsom nitrat og dermed er relativt specifik for nitrit. Det samlede beløb producerede nitrit blev beregnet som produktet af producerede koncentration og den samlede mængde af banen, mens du justerer for volumen tabt, mens udtagning af prøver 6.
Følgende trin er afgørende for en vellykket gennemførelse af flow eksperimenter:
En mulig begrænsning af vores flow kammeret er, at højden er fastsat af højden af kanalen fræset ind i aluminium. Men dette har den fordel ikke at skulle kontrollere og justere højden af kanalen før hver eksperimentere og derfor simplificerer forskydningsspænding beregningerne ved blot at justere pumpens flow til den ønskede værdi. Afhængig af din forskning mål, kan det være ønskeligt atøge forskydningsspænding uden at øge pumpehastighed. I dette tilfælde anbefaler vi, at perfusatet er viskositet, fx tilføje Dextran til mediet 11.
En mulig begrænsning af flow kredsløb er den store mængde medie, der anvendes, hvilket kan være problematisk, når de forsøger at kvantificere meget små koncentrationer af celle metabolitter. Selv om det ikke er vist her, er det muligt for markant at reducere kredsløbet lydstyrken ved hjælp af en mindre beholder og pulsdæmper og falde rør længde og diameter.
Derudover er der flere andre kommercielt tilgængelige systemer, der kan bruges til at anvende væske shear stress til celler i kultur. Mikrofluid-baserede systemer, f.eks BioFlux systemet fra Fluxion, tillader simultan analyser af celler i forskellige mikrofluid flow kanaler fyldt med opløsning i såvel plader som input og output reservoirer for disse kanaler 12,13,14. Men disse og andre mikrofluidisk systemer er ikke kompatible med standard objektglas og ikke giver mulighed for inddrivelse af et tilstrækkeligt stort antal celler til videre eksperimenter, såsom RT-PCR eller Western Blot. Desuden er de mindre brugervenlige, koster et minimum på $ 40.000 og kan nå en total på mere end $ 100.000, afhængigt af ekstraudstyr.
To macrofluidic systemer tilgængelige fra Flexcell International Corporation, Flexcell Streameren og FlexFlow systemer, med succes er blevet brugt til at studere endotelceller 15,16,17, menneskelige annulus celler 18 og fibroblaster 19 under væske strømning. Et tredje system, som er tilgængelig via GlycoTech, er blevet anvendt til at studere tumor celleadhæsionsmolekyle 20 og leukocyt vedhæftning 21 til endotel monolag.
Streameren system giver flere sider at køre under samme forskydningsspænding betingelser på én gang, men mangler et vindue og – i modsætning til voresdesign – ikke giver mulighed for real-time visualisering af celler under flow.
Det FlexFlow Systemet har en rude, men kræver en opretstående mikroskop, som måske ikke være standard mikroskopet anvendes i de fleste laboratorier. Endvidere FlexFlow system kræver en celle-belagt dækning slip at være omvendt, når den placeres i det flow kammer. Dette udelukker visualisering af fluorescerende celler på en uigennemsigtig flade, såsom titanium-belagte glas, som vi viser i vores undersøgelse. Endelig har specialiseret dække smutter skal købes specielt til FlexFlow system, som er i multi-tusind-dollar prisklasse, svarende til Flexcell Streamer systemet.
GlycoTech tilbyder cirkulære og rektangulære parallel-plade flow kamre, der er betydeligt billigere, men fremstillet af støbt acryl, der ikke bekvemt kan dæmme autoklaveres som vores kammer. Det skal bemærkes, at andre flow kamre, der er blevet beskrevet være autoklaverbarsynes upraktisk, fordi de kræver specielle mikroskopiske linser 22,23. Det GlycoTech Systemet udnytter silicium gummipakninger der skydes ind mellem top-og bundplader, som vil ændre sig i tykkelse med gentagen brug, og derfor ændre kammer højde over tid (producentens anbefaler køb af nye efter hver tiende bruger). Vores aluminium kammer med indbygget O-ringe giver mulighed for fuldstændig modstand af top og bund plader og sikrer konstant kammer højde mellem eksperimenter. Endelig vakuumpumper er nødvendige for at opnå en vandtæt tætning i mange flow-kammer design, herunder GlycoTech kamre, som ikke er nødvendige i vores design.
Betragtninger ikke vist her, kan strømmen kammeret holdes under et mikroskop under hele flowet eksperiment for real-time scanning af celleadhæsionsmolekyle og / eller adfærd. Hvis dette ønskes, anbefaler vi at bruge varmelamper eller en opvarmet pad under kammeret for at opretholde den perfusatet temperatur på 37 ° C. FurDerfra kan valsen pumpe blive erstattet med en sprøjtepumpe, hvis der ikke "recirkulering" af enten celler eller metabolitter eller efterforskningsmæssig narkotika eller agenter ønskes 24.
Det er også muligt at flyde anderledes mærkede celler i løbet af vedhængende celler, fx fluorescerende blodplader over et lag af sammenflydende EPC'er (ved hjælp af trombocyt assay beskrevet af Achneck et al. 6,25) for at evaluere celle-til-celle interaktion under væske forskydningsspænding. Vores flow kammer kombinerer værdifulde funktioner i andre tilgængelige flow kamre, såsom en perfusatets prøveudtagning havn og et vindue og har den vigtige fordel af kompatibilitet med enten en omvendt eller opret mikroskop. Det er fuldt autoklaverbar og giver mulighed for gentagne forsøg på konstant kammer højde og uden brug af vakuum pumper for at opnå en tæt forsegling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Joe Owen i Biomedicinsk Instrument og Machine Shop for hans utrættelige indsats i bearbejdning og samling af flow kammeret dele og Matt Maudsley fra Leica Microsystems for at bistå i teknikker til billede celler gennem flow kamre. Vi står i gæld til Kevin Collins fra Duke Perfusion Services og Dr. Steve Wallace i Department of Biomedical Engineering for nyttige forslag på flow kredsløbsdesign. Vi vil også gerne takke National Science Foundation Graduate Research Fellowship program til støtte for Alexandra Jantzen og NIH for deres støtte gennem Grant "Autolog EPC foring for at forbedre biokompatibilitet af kredsløbssygdomme hjælpe enheder" RC1HL099863-01.
Products / Reagents | Company | Product # |
10 ml Syringe | Cole Parmer Instrument Co. | 07940-12 |
1-Way Stopcoks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-00 |
30 ml Syringe | BD Medical | 309650 |
4 -Way Stopcocks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-04 |
Aluminum Alloy | N/A | 6061 |
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Scientific; Nunc | 267061 |
Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 |
DMSO | Research Organics | 2162D |
DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 |
EGM-2 Singlequots | Lonza | CC-4176 |
Female Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | SI-45500-04 |
Fibronectin | Sigma | F0895-2MG |
Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole Parmer Instrument Co. | 34594-24 |
Hard Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 06508-16 |
HBSS | Sigma | H8264-500ML |
Histopaque | Sigma | H8889-500ML |
Hoechst Stain Solution | Sigma | H6024 |
Hyclone FBS | Thermo Scientific | SH30071.01 |
L-glutamine | Lonza | 17-605E |
Male Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | EW-45505-04 |
MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV |
Barbed Polypropylene Fittings | Cole Parmer Instrument Co. | 06365-90 |
O-Rings | N/A | AS568A |
Pulse-Dampener | Cole Parmer Instrument Co. | 07596-20 |
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole Parmer Instrument Co. | 7524-40 |
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole Parmer Instrument Co. | 07518-60 |
Slide | Cole Parmer Instrument Co. | 48500-00 |
Soft Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 96400-16 |
Syringe filter | Cole Parmer Instrument Co. | 02915-12 |
Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 |
Trypsin EDTA | Lonza | CC-5012 |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 |