Vi beskriver en metode å utsette tilhenger celler til laminær skjærspenning i et sterilt kontinuerlig flyt krets. Cellenes vedheft, kan morfologi bli undersøkt gjennom de gjennomsiktige kammer, prøver hentet fra kretsen for metabolitten analyse og celler høstet etter shear eksponering for fremtidige eksperimenter eller kultur.
Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive en teknikk for å utsette tilhenger celler til laminær forhold og vurdere deres respons til godt kvantifiserbare væske skjærspenninger 1.
Våre flow kammer design og flow krets (Fig. 1) inneholder en gjennomsiktig visning regionen som muliggjør testing av celle adhesjon og avbildning av cellemorfologi umiddelbart før flow (11A Fig., B), på ulike tidspunkter i løpet av flow (Fig. 11C) , og etter flow (Fig. 11D). Disse eksperimentene er illustrert med human navlestreng blod-avledet endoteliale progenitorceller (EPCs) og svin EPCs 2,3.
Denne metoden er også gjeldende for andre tilhenger celletyper, for eksempel glatte muskelceller (SMCs) eller fibroblaster.
Kammeret og alle deler av kretsen er lett sterilisert med damp autoklavering. I motsetning til andrekamre, kan f.eks microfluidic kamre, et stort antall celler (> 1 mill. avhengig celle størrelse) bli realisert etter flyten eksperimentere under sterile forhold for cellekultur eller andre forsøk, for eksempel DNA eller RNA ekstraksjon eller immunhistokjemi (Fig. 11e), eller scanning elektron mikroskopi 5. Den skjærspenning kan justeres ved å variere flow rate av perfusate, væsken viskositet, eller kanalen høyde og bredde. Sistnevnte kan redusere væskevolumet eller celle behov samtidig som endimensjonale flow opprettholdes. Det er ikke nødvendig å måle kammer høyde mellom eksperimenter, siden kammeret høyden ikke er avhengig av bruk av pakninger, noe som kraftig øker brukervennligheten av flere eksperimenter. Videre muliggjør kretsteknikk lett innsamling av perfusate prøver for analyse og / eller kvantifisering av metabolitter utskilt av celler i henhold til væske skjærspenning eksponering, for eksempel nitrogenoksid (Fig. 12) 6 </sup>.
Våre flow krets og flyt kammer tillate oss å utsette tilhenger celler, f.eks EPCs, til definerte væske skjærspenninger. Siden kammer topp og bunn er gjennomsiktige, celle adhesjon og morfologi kan evalueres enten i sanntid, gjennom kammeret selv, eller etter en flyt eksperimentere og demontering av flyten kammeret. På dette punktet, kan cellene høstes under sterile forhold og enten re-belagt, eller brukes til å samle sine DNA eller RNA, etc., for videre analyse.
For å oppnå laminær flow, må utformingen av kammeret være slik at flere vilkår er oppfylt.
Først må strømmen være laminære, noe som kan bekreftes ved å beregne sitt Reynolds tall (Re), som er forholdet mellom treghet krefter til viskøse krefter. (Hvis viskøse kreftene dominerer, er Re små og strømningen er laminær eller "fullt utviklet" – som regel for Re <2300.Hvis treghet kreftene dominerer, blir flyten mer og mer tilfeldige til det er turbulent, slik tilfellet er for Re> 4000.) Vi kan beregne Re henhold til ligning 3 8,
Hvor ρ er væsken tetthet, er Q strømningshastigheten er μ viskositet, w og h er bredden og høyden av kammeret, henholdsvis, og D h er den hydrauliske diameter, definert i henhold til ligning 4 8,
Det Reynolds Antallet våre tre flow kamre, med høyder som strekker seg 166-267 mikrometer, range 13,9 til 34,6 ved massestrømmer calculated å få en skjærspenning på 15 dynes / cm 2. På strømningshastigheter beregnet for et skjærspenning på 100 dynes / cm 2, varierte Reynolds antall kamrene 90,4 til 234. Alle disse Reynolds tallene er mye lavere enn 2300 og oppfyller kriteriet for laminær flow.
Sekund til for hastighet feltet og skjærspenning være uavhengig av avstanden langs flyten kanalen (dvs. fullt utviklet), avstanden fra væske inntaket til å skyve må være lengre enn inngangen lengden, L e. Dette kan oppfylles ved beregning inngangen lengden, i henhold til ligning 5 9.
For verdiene ovenfor, varierer inngangen lengde 0,01 til 0,25 cm.
Tredje, for å sikre at hastigheten og skjærspenning i lateral retning ikke varierevesentlig fra den verdien for endimensjonale kanal flow (Δ Ph / 2L), må forholdet h / w være mye mindre enn en. For den gjennomsnittlige veggen skjærspenning under to-dimensjonale strømningsforhold å være 95% av veggen skjærspenning under en-dimensjonal flyt, må h / w være lik 0,10, og for veggen skjærspenning under to-dimensjonale strømningsforhold å være 97,5% av veggen skjærspenning under en-dimensjonal flyt, må h / w være lik 0,05. Med dimensjoner på våre utformet flyt kammer 1,7 cm i bredden og 166-267 mikrometer i høyden, er disse kriteriene oppfylt.
Trykket vil variere kun i retning av strømmen hvis det ikke lateral trykkgradienter ved inngangen. Dette kan vurderes å bruke fargestoffer eller partikler i flyten banen. Videre, for jevn flyt eksperimenter, er en puls støtdempere inn i flyten kretsen. Pulsen demper tar ut mesteparten av Pulsatility forårsaket av valsen pumpe i kretsen, og tillater oss å omtrentlige forutsetningen om jevn flyt. Av notatet, bør pulsen demper utnyttet være kompatibelt med pumpe og slange som brukes i kretsen, slik at det effektivt kan eliminere pulseringer i produksjonen flyt for bestemte frekvenser i valsen pumpen. I demonstrasjonen vår Masterflex L / S puls støtdempere oppnår laminær flow når den brukes på utløpsrøret med noen Masterflex L / S serien pumpe (0-600 RPM) og I / P 26 tubing. For pulsatile flyt, kan en programmerbar pumpe brukes til å generere ulike bølgeformer.
For pulsatile flyt, kan en programmerbar pumpe brukes til å generere ulike bølgeformer.
Videre er kretsen utformet slik at prøver av perfusate kan enkelt hentes på ulike tidspunkt uten å risikere kontaminering av celler eller flow medium. I vårt eksempel konsentrasjonen av NO 2 – ble målt ved chemiluminescence meden Ionics / Sievers Nitric Oxide Analyzer (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO) som tidligere beskrevet 10. Den reductant brukes til nitritt analyse ble kalium iodide i eddiksyre (14,5 M eddiksyre og 0,05 M KI), som har redusert potensial til å konvertere nitritt til NO men er utilstrekkelig for å redusere eventuelle høyere oksider av nitrogen som nitrat og dermed er relativt spesifikke for nitritt. Den totale mengden nitritt produsert ble beregnet som produktet av konsentrasjon produsert og det totale volumet av kretsen mens justert for volumet tapt mens man tar prøver seks.
Følgende trinn er kritiske for en vellykket gjennomføring av flow eksperimenter:
En mulig begrensning av våre flow kammer er at høyden er fastsatt av høyden på kanalen maskinert i aluminium. Dette har imidlertid fordelen av ikke å måtte verifisere og justere høyden på kanalen før hvert forsøk, og derfor forenkler skjærspenning beregningene bare ved å justere pumpen strømme til ønsket verdi. Avhengig av din forskning mål, kan det være ønskelig åøke skjærspenning uten å øke pumpehastigheten. I dette tilfellet anbefaler vi å øke perfusate er viskositet, f.eks legge dekstran til mediet 11.
En mulig begrensning av flyten krets er det store volum av mediet som brukes, noe som kan være problematisk når du forsøker å kvantifisere svært små konsentrasjoner av celle metabolitter. Selv ikke vist her, er det mulig å betydelig redusere kretsen volumet ved å bruke et mindre reservoar og puls støtdempere og senke rør lengde og diameter.
I tillegg er det flere andre kommersielt tilgjengelige systemer som kan brukes til å søke væske skjærspenning til celler i kultur. Microfluidic-baserte systemer, f.eks BioFlux systemet fra Fluxion, aktiverer samtidig analyser av celler i ulike microfluidic flow kanaler lastet med løsningen i vel plater som fungerer som inngang og utgang reservoarer for disse kanalene 12,13,14. Men disse og andre mikrofluidic systemer er ikke kompatible med standard objektglass og tillater ikke for utvinning av et tilstrekkelig stort antall celler for videre eksperimenter, slik som RT-PCR og Western Blot. Videre, de er mindre brukervennlig, koste minimum $ 40.000 og kan nå totalt mer enn 100.000 dollar, avhengig av tilbehør.
To macrofluidic systemer tilgjengelig fra Flexcell International Corporation, Flexcell Streamer og FlexFlow systemer, har blitt brukt til å studere endotelceller 15,16,17, menneskelige ringrommet celler 18 og fibroblaster 19 i henhold til væskestrøm forhold. Et tredje system, tilgjengelig gjennom GlycoTech, har vært benyttet til å studere svulst celle adhesjon 20 og leukocytter vedheft 21 til endoteliale monolayers.
Streamer systemet tillater flere lysbilder som skal kjøres under samme skjærspenning forhold på en gang, men mangler et vindu og – i motsetning til våredesign – tillater ikke for sanntids visualisering av cellene under flyt.
Det FlexFlow Systemet har en visningsvinduet, men krever en oppreist mikroskop, som kanskje ikke standarden mikroskop brukes i de fleste laboratorier. Videre krever FlexFlow systemet en celle-belagt dekkglass å være invertert når den plasseres inn i flyten kammeret. Dette utelukker visualisering av fluorescerende celler på en ugjennomsiktig overflate, som titan-belagte glass, som vi viser i vår studie. Til slutt, den spesialiserte dekkglass må kjøpes spesielt for FlexFlow systemet, som er i den multi-tusen-dollar prisklasse, ligner på Flexcell Streamer systemet.
GlycoTech tilbyr sirkulære og rektangulære parallell-plate flow kamre, som er betydelig billigere, men produsert av støpt akryl som ikke enkelt kan demme autoklaveres som kammer vår. Av notatet, til andre flow kamre som har blitt beskrevet være autoklaverbarsynes upraktisk fordi de krever spesielle mikroskopiske linser 22,23. Den GlycoTech systemet benytter silikongummi pakninger interposed mellom topp og bunnplater, noe som vil endre seg i tykkelsen med gjentatt bruk og derfor endre kammer høyde over tid (det produsenten anbefaler å kjøpe nye etter hvert tiende bruker). Våre aluminium kammer med innebygd O-ringer gjør for fullstendig opposisjon av topp og bunn plater og sikrer konstant kammer høyde mellom eksperimenter. Til slutt, vakuumpumper er nødvendig for å oppnå en lekkasjesikker segl i mange flyt chamber design, inkludert GlycoTech kamre, som ikke er nødvendige i vårt design.
Mens ikke vist her, kan flyten kammeret holdes under et mikroskop under hele flyten eksperiment for sanntids avbildning av celle adhesjon og / eller atferd. Dersom dette er ønskelig, anbefaler vi at du bruker varme lamper eller et oppvarmet pad under kammeret å opprettholde perfusate temperaturen ved 37 ° C. FurDerfra kan valsen pumpe bli erstattet med en sprøyte pumpe, hvis ingen "resirkulering" av enten celler eller metabolitter eller investigational narkotika eller midler er ønsket 24.
Det er også mulig å flyte annerledes merkede celler over tilhenger celler, for eksempel fluorescerende blodplater over et lag av confluent EPCs (med blodplate analysen beskrevet av Achneck et al. 6,25) til å vurdere celle-til-celle interaksjon henhold væske skjærspenning. Våre flow kammer kombinerer nyttige funksjoner fra andre tilgjengelige flow kamre, for eksempel en perfusate sampling port og et vindu og har den viktige fordelen av kompatibilitet med enten en invertert eller oppreist mikroskop. Det er fullt autoklaverbare og gir mulighet for gjentatte forsøk på konstant kammer høyde og uten behov av vakuumpumper for å oppnå en tett forsegling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Joe Owen i Biomedical Instrument og Machine Shop for sin utrettelige innsats i maskinering og montering av flow kammer deler og Matt Maudsley fra Leica Microsystems for å bistå i teknikker for å image cellene gjennom flyt kamre. Vi står i gjeld til Kevin Collins fra Duke Perfusjons Services og Dr. Steve Wallace i Department of Biomedical Engineering for nyttige forslag på flyt krets design. Vi vil også takke National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program for støtte Alexandra Jantzen og NIH for deres støtte gjennom Grant "Autolog EPC fôr for å forbedre biokompatibilitet av sirkulasjons bistå enheter" RC1HL099863-01.
Products / Reagents | Company | Product # |
10 ml Syringe | Cole Parmer Instrument Co. | 07940-12 |
1-Way Stopcoks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-00 |
30 ml Syringe | BD Medical | 309650 |
4 -Way Stopcocks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-04 |
Aluminum Alloy | N/A | 6061 |
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Scientific; Nunc | 267061 |
Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 |
DMSO | Research Organics | 2162D |
DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 |
EGM-2 Singlequots | Lonza | CC-4176 |
Female Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | SI-45500-04 |
Fibronectin | Sigma | F0895-2MG |
Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole Parmer Instrument Co. | 34594-24 |
Hard Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 06508-16 |
HBSS | Sigma | H8264-500ML |
Histopaque | Sigma | H8889-500ML |
Hoechst Stain Solution | Sigma | H6024 |
Hyclone FBS | Thermo Scientific | SH30071.01 |
L-glutamine | Lonza | 17-605E |
Male Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | EW-45505-04 |
MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV |
Barbed Polypropylene Fittings | Cole Parmer Instrument Co. | 06365-90 |
O-Rings | N/A | AS568A |
Pulse-Dampener | Cole Parmer Instrument Co. | 07596-20 |
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole Parmer Instrument Co. | 7524-40 |
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole Parmer Instrument Co. | 07518-60 |
Slide | Cole Parmer Instrument Co. | 48500-00 |
Soft Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 96400-16 |
Syringe filter | Cole Parmer Instrument Co. | 02915-12 |
Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 |
Trypsin EDTA | Lonza | CC-5012 |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 |