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Bioengineering

समानांतर थाली फ्लो चैंबर और सतत प्रवाह सर्किट लैिमनार फ्लो कतरें तनाव के तहत endothelial पूर्वज सेल का मूल्यांकन

doi: 10.3791/3349 Published: January 17, 2012

Summary

हम एक बाँझ सतत प्रवाह सर्किट में विषय पक्षपाती लामिना का प्रवाह कतरनी तनाव को कोशिकाओं के लिए एक विधि का वर्णन कर रहे हैं. 'कोशिकाओं के आसंजन, आकारिकी पारदर्शी कक्ष के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है, metabolite विश्लेषण और भविष्य के प्रयोगों या संस्कृति के लिए कतरनी प्रदर्शन के बाद काटा कोशिकाओं के लिए सर्किट से प्राप्त नमूनों.

Abstract

इस विधि के समग्र लक्ष्य लामिना का प्रवाह शर्तों के अनुयायी कोशिकाओं का विषय है और उनकी अच्छी तरह से quantifiable द्रव कतरनी 1 जोर दिया करने के लिए प्रतिक्रिया का मूल्यांकन तकनीक का वर्णन है.

हमारे प्रवाह कक्ष डिजाइन और प्रवाह सर्किट (छवि 1) एक पारदर्शी देखने क्षेत्र है कि सेल और सेल आकारिकी के आसंजन इमेजिंग के परीक्षण के तुरंत प्रवाह पहले (छवि 11a, बी) में सक्षम बनाता है, (छवि 11C) के प्रवाह के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर होता है , और बाद में प्रवाह (11D छवि). इन प्रयोगों मानव गर्भनाल के साथ सचित्र हैं रक्त व्युत्पन्न endothelial पूर्वज (निर्यात संवर्धन परिषदों) कोशिकाओं और सुअर का निर्यात संवर्धन परिषदों 2,3.

इस विधि भी अन्य पक्षपाती सेल प्रकार, जैसे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SMCs) या fibroblasts के लिए लागू है.

कक्ष और सर्किट के सभी भागों को आसानी से भाप वाष्पदावी विसंक्रण के साथ निष्फल रहे हैं. दूसरे के विपरीतकक्षों, जैसे microfluidic कक्षों, कोशिकाओं (> 1 मिलियन सेल आकार पर निर्भर करता है) की बड़ी संख्या बाँझ शर्तों के तहत सेल संस्कृति या अन्य प्रयोगों, जैसे डीएनए या शाही सेना निकासी, या immunohistochemistry (11E छवि) के लिए प्रवाह प्रयोग के बाद बरामद किया जा सकता है, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5 स्कैनिंग. कतरनी तनाव perfusate, तरल पदार्थ दलदलापन, या चैनल ऊंचाई और चौड़ाई के प्रवाह की दर अलग से समायोजित किया जा सकता है. बाद तरल पदार्थ की मात्रा या सेल की जरूरत को कम जबकि यह सुनिश्चित करना है कि एक आयामी प्रवाह बनाए रखा है सकते हैं. यह प्रयोगों के बीच चैम्बर ऊंचाई मापने के लिए आवश्यक नहीं है, के बाद चैम्बर ऊंचाई gaskets के प्रयोग है, जो बहुत कई प्रयोगों की आसानी बढ़ जाती है पर निर्भर नहीं करता है. इसके अलावा, सर्किट डिजाइन आसानी से सक्षम बनाता है और विश्लेषण या तरल पदार्थ कतरनी तनाव जोखिम के तहत कोशिकाओं द्वारा secreted चयापचयों की मात्रा का ठहराव / जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड (12 छवि) 6 perfusate नमूनों का संग्रह

Protocol

1. Endothelial पूर्वज सेल अलगाव

  1. परिधीय मानव रक्त के किसी भी संग्रह के लिए, पहले अपने संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के लिए अपने अनुसंधान प्रोटोकॉल सबमिट करते हैं, और इसके अनुमोदन के बाद, स्वयंसेवक दाताओं प्राप्त सूचित सहमति (परिधीय रक्त संग्रह और ईपीसी अलगाव ड्यूक विश्वविद्यालय आईआरबी द्वारा किया गया था और मंजूरी दे दी ' अमेरिकी नियामक आवश्यकताओं मानव अनुसंधान प्रतिभागियों के संरक्षण से संबंधित) के साथ पूर्ण अनुपालन में है.
  2. जब पशु व्युत्पन्न निर्यात संवर्धन परिषदों के साथ काम कर रहे है, अपने अनुसंधान प्रोटोकॉल अपने संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित है और समिति (IACUC) का उपयोग करें. हमारे सभी सुअर का प्रयोगों के ड्यूक विश्वविद्यालय IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया था और मानवीय देखभाल के उच्चतम मानकों के अनुसार में आयोजित किया गया.
  3. Endothelial पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सहमति स्वयंसेवक दाता से मानक फ़स्त खोलना तकनीक के माध्यम से रक्त संग्रह anticoagulant citrat से भरा बैग में परिधीय रक्त का 50 मिलीलीटर जमाई फॉस्फेट dextrose और हांक बफर नमक समाधान के साथ 1:01 (2 CaCl, 2 MgCl, 4 MgSO) के बिना और Histopaque के बराबर वॉल्यूम पर परत बनाने के लिए अच्छी तरह से परिभाषित परतों के समाधान जलमिश्रित .
  4. अपकेंद्रित्र (30 मिनट, 740 जी, कम को तोड़ने सेटिंग) और mononuclear (एमएनसी) सेल (buffy कोट) परत जमा. Resuspend और है Dulbecco फास्फेट के साथ धोने बहुराष्ट्रीय कंपनियों 3 एक्स खारा buffered (DPBS) 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम एक्स 10 मिनट, 515 ग्राम के साथ, पहले दो पूर्ण ईपीसी विकास मध्यम में 12 - अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाना (MCDB-131 मध्यम 5 के साथ 37 में 200 मिमी एल glutamine, 10% FBS और ईजीएम - दो SingleQuots) के मिलीलीटर ° सी, 5% सीओ 2.
  5. धीरे धीरे हर 24 घंटे पहले 7 दिन है, तो हर दूसरे दिन के लिए मध्यम बदल जाते हैं. ईपीसी कालोनियों के बाद 14 दिनों की एक औसत समय उनके cobblestone आकारिकी पर आधारित पहचाना जा सकता है है. एक बार 12-अच्छी तरह से सतह क्षेत्र की संस्कृति कवर ¼ में निर्यात संवर्धन परिषदों, कोशिकाओं विस्तार और प्रवाह cytometry के साथ परीक्षण द्वारा सतह मार्कर की उपस्थिति के लिए EPC पहचान की पुष्टिCD31 और CD14, CD45 के अभाव के रूप में पहले 6 वर्णित. अन्य assays कि प्रदर्शन किया जा सकता है सेल आकारिकी और DiI एसी एलडीएल के साथ लेबलिंग शामिल हैं.
  6. के लिए प्रयोगों के साथ साथ वर्णित है, पृथक निर्यात संवर्धन परिषदों का विस्तार जब तक वे लगभग 3 टी 37-75 सेल humidified इनक्यूबेटर में EPC माध्यम संस्कृति बोतल में मिला हुआ हैं सेल्सियस, 5% सीओ 2 .

2. कतरनी तनाव गणना

  1. हम अनुशंसा करते हैं कि इन गणनाओं से पहले कक्ष और चैनल के निर्माण के लिए स्थिति है कि प्राप्त किया जा सकता है की एक पूरी तरह से समझ प्रदर्शन कर रहे हैं. Perfusate के अपने सर्किट में प्रवाह की दर वांछित कतरनी के आधार पर की गणना करने के लिए 1 1 समीकरण अनुसार कोशिकाओं को लागू किया जा जोर दिया,

1 समीकरण

जहां क्यू वांछित प्रवाह दर है, τ लक्ष्य हैtangentially तनाव कोशिकाओं पर अभिनय सुन, डब्ल्यू प्रवाह कक्ष की चौड़ाई है, प्रवाह चैम्बर की ऊंचाई है, और μ perfusate (प्रवाह मध्यम) की दलदलापन है.

  1. चिपचिपाहट के एक ठेठ प्रयुक्त माध्यम के लिए मूल्य (μ) 0.9 CP (.009 छ सेमी -1 -1 s) है. नोट करें कि चिपचिपापन भी उच्च आणविक भार dextran का उपयोग कर, यदि हां, तो 7 वांछित के द्वारा उठाया जा सकता है. लक्ष्य कतरनी तनाव का एक विशिष्ट मूल्य (τ) का उपयोग किया dynes 15 / 2 सेमी (ठेठ धमनी कतरनी तनाव) या 100 dynes / 2 सेमी है, अगर ऊपर अर्थ का उपसर्ग शारीरिक कतरनी तनाव वांछित है. हमारी चैम्बर आम तौर पर 1.9 सेमी और ऊंचाई (ज) के एक 166 की रेंज में चौड़ाई (डब्ल्यू) - 267 सुक्ष्ममापी है.

3. प्रवाह चैम्बर निर्माण

  1. वें के ऊपर और नीचे प्लेटों कटएल्यूमीनियम मिश्र धातु 6061 7 x 2 x 0.5 "और 7 x 2 x 0.25 के नीचे आयाम" के शीर्ष आयाम के साथ आयताकार शेयर से ई चैम्बर.
  2. अवकाश केन्द्र भाग में शीर्ष .125 "गहरी, 0.950 छोड़ने" 1.375 "व्यापक एक्स 0.३,१२५" गहरी द्रव जलाशय के लिए प्रति अंत की थाली है.
  3. 1 / 16 "चौड़ी x 0.625" underside से लंबे समय स्लॉट क्रम में प्रवाह और बहिर्वाह समाप्त होता है पर जलाशय के लिए घुसना ड्रिल.
  4. प्रत्येक ऊपर थाली के अंत में, एक केन्द्र स्थित नली द्रव जलाशय घुसना कंटिया 10/32 polypropylene 1 / 8 के लिए प्रति इंच पथ (TPI) छेद "ड्रिल. आमद अंत में, "polypropylene 1 / 8 के लिए छेद के माध्यम से TPI" 10/32 के साथ एक पक्ष प्लग नली कंटिया बना.
  5. टेपर कांच देखने के खिड़की करने के लिए तरल पदार्थ आमद से 0.518 डिग्री के लिए पर्याप्त तरल पदार्थ का मिश्रण पर ऊपर नीचे.
  6. शीर्ष देखने के खिड़की के साथ लाइन में नीचे की थाली में एक गिलास स्लाइड विंडो कट. चेंबर में मछलीघर सीमेंट, गोंद एक गिलास स्लाइड का उपयोग करना. कम से कम 24 घंटे के लिए इलाज की अनुमति दें.सुनिश्चित करें कि देखने खिड़की recessed इतना है कि एक 75 x 25 x 1 मिमी खुर्दबीन गिलास स्लाइड कक्ष में फ्लश बैठेंगे.
  7. एक ऊपर और नीचे ऐसे प्लेटों के नीचे के आसपास O-अंगूठी के लिए एक अवकाश है कि वे 0.02 द्वारा अलग स्थान दिया गया है "बनाएँ रबर हे - छल्ले सम्मिलित करें.
  8. फ्लैट सिर शिकंजा "8 / 32 के साथ उपयोग करने के लिए ऊपर और नीचे के कक्षों में TPI छेद" 10 मिलान 8 / 32 ड्रिल.

4. फ्लो सर्किट विधानसभा

  1. पहली बार पूरे प्रवाह सर्किट इकट्ठा, तो अपनी नसबंदी के साथ आगे बढ़ना.
  2. "(नाड़ी dampener कनेक्शन के एक छोर 1 / 8) के माध्यम से करने के लिए मुश्किल टयूबिंग के खंड" एक 36 संलग्न. अन्य अंत करने के लिए नरम टयूबिंग की एक 18 "खंड देते हैं.
  3. एक 1 / 8 नरम टयूबिंग अनुभाग "18 के अंत में पुरुष luer एडाप्टर" 4.2 चरण में वर्णित रखें. एक 1 / 8 करने के लिए पुरुष luer कनेक्ट खंड नरम टयूबिंग "महिला luer अनुकूलक एक नया 18 महिला luer अनुलग्न".
  4. एक 250 मिलीलीटर कांच बीकर टोपी में तीन छेद ड्रिल क्रम में टयूबिंग फिट. मैंएक छेद और 250 मिलीलीटर कांच की बोतल (जलाशय के रूप में) (छवि 2) में टोपी में अन्य 2 छेद के माध्यम से हार्ड और सॉफ्ट टयूबिंग की मुफ्त समाप्त होता है में एक नरम टयूबिंग 1.5 "खंड (हवा वेंट के रूप में) nsert. सुनिश्चित करें कि मुश्किल टयूबिंग जलाशय के तल तक पहुँच (जलाशय से बहिर्वाह टयूबिंग के रूप में).
  5. 121 में भाप वाष्पदावी विसंक्रण से ऊपर भागों जीवाणुरहित डिग्री सेल्सियस 60 मिनट के लिए. इसके अलावा एक पूरा प्रवाह चैम्बर, 3 आटोक्लेव x 2 luer एडाप्टर, 4 x साढ़े नरम टयूबिंग, एक पुरुष और एक महिला 1 / 8 "खंडों" और 6 x 5 / 16 "8-32 फ्लैट सिर शिकंजा, चिमटी की एक जोड़ी , एक 75 x 25 x 1 मिमी गिलास स्लाइड (या अन्य इच्छित कोशिका की सतह सामग्री), और 2 शल्य तौलिए.
  6. लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ तौलिये रखें. इस बाँझ क्षेत्र पर सर्किट प्रवाह, प्रवाह चैम्बर, 4 x 4 तरह stopcocks, 1 x एक तरह से पानी निकलने की टोंटी, और 4.5 कदम से सब निष्फल भागों रखें.
  7. अब बाँझ दस्ताने का उपयोग करने के लिए दो चार तरह stopcocks कनेक्ट. खुला नमूना बंदरगाहों पर प्लेस टोपियां. पुरुष और महिला luer प्रवाह सर्किट के दो नरम टयूबिंग क्षेत्रों संलग्न एडेप्टर अलग और जुड़ा stopcocks (छवि 3) सम्मिलित हैं .
  8. नरम एक 30 मिलीलीटर सिरिंज के जलाशय में डाला टयूबिंग संलग्न और सिरिंज पिस्टन हटायें. ईपीसी मध्यम (4 छवि) के 125 मिलीलीटर के साथ बोतल भरें .
  9. हवा वेंट (4 छवि) में एक बाँझ सिरिंज फिल्टर प्लेस.
  10. एक humidified इनक्यूबेटर में 37 में प्रवाह सर्किट हटो डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2.
  11. रोलर पंप टयूबिंग के इस प्रकार के (छवि 5) के साथ प्रयोग के लिए संकेत सिर में हार्ड टयूबिंग दबाना . सुनिश्चित करें कि टयूबिंग रोलर पंप बढ़ते पटरियों के साथ ओवरलैप नहीं करता है है. टयूबिंग मार्क जहां यह एक अंकन कलम के साथ दोनों तरफ पंप सिर से बाहर निकालता है.
  12. सुनिश्चित करें कि सभी stopcocks बंद नमूना बंदरगाहों की दिशा में बंद हो जाती हैं और प्रवाह सर्किट के साथ खुला. पंप प्रारंभ. प्रवाह की दिशा को सत्यापित करें. perfusate fr बढ़ना चाहिएओम नाड़ी dampener में मुश्किल टयूबिंग के माध्यम से गिलास जलाशय.

5. ईपीसी फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. जबकि सर्किट warms प्रवाह 37 डिग्री सेल्सियस, स्लाइड पर बोने के लिए कोशिकाओं को तैयार है. नोट करें कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग अगर कोशिकाओं को अपारदर्शी सामग्री, जैसे टाइटेनियम (तिवारी) पर देखे जा रहे हैं आवश्यक है.
  2. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 90 μl के साथ 50 μg सीटीओ पाउडर गिराए द्वारा सेल ट्रैकर ऑरेंज (सीटीओ) के एक 1 मिमी स्टॉक समाधान बनाएँ. प्रकाश जोखिम (बत्ती बारी प्रवाह हुड के नीचे काम करते हुए) से इस मिश्रण को ढाल करने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. सीरम मुक्त MCDB 131 मध्यम की 18 मिलीलीटर में सीटीओ स्टॉक समाधान के 36 μl गिराए द्वारा सीटीओ के 2 सुक्ष्ममापी काम कर समाधान बनाएँ.
  4. सहधारा T-75 10 मिलीलीटर DPBS (Ca या मिलीग्राम बिना) के साथ सेल संस्कृति बोतल के पास 3 में निर्यात संवर्धन परिषदों कुल्ला.
  5. 2 सुक्ष्ममापी सीटीओ काम प्रत्येक फ्लास्क के समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें. 37 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस प्रत्येक फ्लास्क 10 मिलीलीटर DPBS (Ca या मिलीग्राम बिना) के साथ x 2 कुल्ला.
  6. ईपीसी मध्यम के 5 मिलीलीटर में centrifugation 600g और resuspend पर एक्स 5 मिनट से धो लें.

6. स्लाइड के सेल बोने से पहले चैम्बर विधानसभा प्रवाह

  1. एक गिलास, टाइटेनियम, या अन्य सामग्री से बाहर कर दिया स्लाइड, इस्तेमाल किया जा सकता है और स्लाइड सतह बहुलक स्पिन कोटिंग के साथ द्वारा संशोधित किया जा सकता है या धातु की एक परत जोड़ने. एक बाँझ आयताकार चार कक्ष सेल संस्कृति पोत (या उपयोग टिशू कल्चर स्लाइड फ्लास्क अगर polystyrene सतह वांछित है) स्लाइड में रखें. स्लाइड पर कोशिकाओं और 1.5 बीज x 10 6 कोशिकाओं ईपीसी मध्यम x 6 घंटा की 5 मिलीलीटर में अगर एक सहधारा सेल परत प्रवाह की दीक्षा (11a छवि) में वांछित है गणना.
  2. आदेश में तरल पदार्थ कतरनी तनाव के तहत फैल सेल और आसंजन का परीक्षण करने के लिए, 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रवाह के प्रारंभ (जल्दी बोने) से पहले केवल 15 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति (

7. प्रवाह चैम्बर विधानसभा

  1. बाँझ दस्ताने का प्रयोग, महिला luer एडाप्टर "एक 1 / 8 नरम टयूबिंग खंड" एक 2 कनेक्ट. एक और 2 पुरुष luer एडाप्टर "नरम टयूबिंग एक 1 / 8 करने के लिए खंड" कनेक्ट.
  2. "महिला अंतर्वाह बंदरगाह luer अनुकूलक के साथ नरम टयूबिंग 2 संलग्न है." 2 संलग्न बहिर्वाह बंदरगाह के लिए पुरुष luer के साथ नरम टयूबिंग. इन luer adapters के दोनों 4 तरह stopcocks संलग्न. पक्ष बंदरगाह बंद बुलबुला जाल आ रहा संबंधक के लिए शेष 2 "नरम टयूबिंग टुकड़ा कनेक्ट और एक तरह से पानी निकलने की टोंटी (छवि 6) देते हैं .
  3. बाँझ चिमटी का प्रयोग, सेल संस्कृति पोत (या एक स्लाइड कुप्पी का उपयोग अगर, स्लाइड पर फ्लास्क निकालने) से सेल वरीयता प्राप्त स्लाइड हटाने और प्रवाह कक्ष के नीचे की थाली पर अवकाश में यह जगह. सुनिश्चित करें कि स्लाइड सेल वरीयता प्राप्त ओर का सामना करना पड़ के साथ रखा है.
  4. Pipet स्लाइड पर गर्म ईपीसी माध्यम से 10 मिलीलीटर. मध्यम स्लाइड और प्रवाह चैम्बर, ख को कवर करने की अनुमति देंut नीचे की थाली पर O-अंगूठी पर मध्यम फैल नहीं करते हैं.
  5. नीचे की थाली पर प्रवाह कक्ष के ऊपर थाली प्लेस, पेंच छेद aligning. ध्यान रखना चेंबर में हवाई बुलबुले दो प्लेटें समानांतर रखने के द्वारा इस कदम के दौरान परिचय.
  6. भाड़ में प्लेटों के साथ (एक स्वचालित बैटरी चालित इस प्रक्रिया पेचकश गति).
  7. आमद बुलबुला जाल से हवाई बुलबुले और बुलबुला अंतर्वाह ओर जाल बंदरगाह से जुड़ी 1 तरह पानी निकलने की टोंटी खोलने के द्वारा निकालें धीरे ईपीसी मध्यम के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर अंतर्वाह टयूबिंग फ्लश. फिर से इस पानी निकलने की टोंटी और यह टोपी (छवि 7) बंद.
  8. अब चैम्बर चैनल से बहिर्वाह बंदरगाह 4 - जिस तरह से पानी निकलने की टोंटी खोलने और धीरे प्रवाह कक्ष के माध्यम से ईपीसी मध्यम निस्तब्धता, फिर से एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर से हवाई बुलबुले को दूर. यदि बड़े बुलबुले बने हुए हैं, एक कोण 45 ° (8 छवि) के चैम्बर के बहिर्वाह अंत बढ़ा .
  9. 4 तरह पानी निकलने की टोंटी के कनेक्शन के सभी कैप और करीबउन्हें बंद. इनक्यूबेटर में इकट्ठे प्रवाह सर्किट (9 छवि) के साथ प्रवाह चैम्बर हटो .
  10. प्रवाह सर्किट पंप रोकें. रिसाव को रोकने के लिए और बाँझ कक्ष के अंदर रखने के प्रवाह की दिशा में प्रवाह सर्किट stopcocks बंद करें. प्रवाह हुड से प्रवाह चैम्बर प्रवाह सर्किट करने के लिए परिवहन. प्रवाह सर्किट प्रवाह चैम्बर कनेक्ट. प्रवाह की दिशा में stopcocks खोलें. प्रवाह पंप पुनरारंभ. सुनिश्चित करें कि perfusate सही दिशा में बहती है. प्रवाह की दर को वांछित कतरनी तनाव को समायोजित करें.
  11. प्रवाह प्रयोग के दौरान, प्रवाह चैम्बर सर्किट से छवि को हटाया जा सकता है प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं. ऐसा करने के क्रम में प्रवाह चैम्बर प्रवाह सर्किट से पानी निकलने की टोंटी - पानी निकलने की टोंटी कनेक्शन काट. चैम्बर के बाँझपन बनाए रखने के लिए, बंद सर्किट प्रवाह की दिशा में stopcocks प्रवाह चैम्बर stopcocks प्रवाह बंद करो और सभी stopcocks प्रवाह सर्किट को हटाने के लिए पहले टोपीइनक्यूबेटर (9 छवि) से.

8. Perfusate नमूना संग्रह

  1. Perfusate नमूने के विश्लेषण के लिए आसान संग्रह, (जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड संश्लेषण), पहली थामने पंप के लिए.
  2. पल्स हतोत्साहित करने के लिए निकटतम स्थित पानी निकलने की टोंटी बंद करें. अपनी सुरक्षात्मक टोपी निकालें और एक छोटे आकार सिरिंज, जैसे 3 मिलीलीटर सिरिंज, नमूना पोर्ट में डालने. टोपी रखें और सुनिश्चित करें कि यह उल्टा रखकर दूषित नहीं बन जाएगा.
  3. चैम्बर प्रवाह की दिशा में पानी निकलने की टोंटी को बंद करें, नमूना बंदरगाह और सर्किट पल्स dampener खोलने की दिशा में रखते हुए.
  4. नमूने के वांछित राशि है, जैसे 150 μl सर्किट से ड्रा. सिरिंज को हटाने से पहले बंद नमूना बंदरगाह की ओर पानी निकलने की टोंटी को बंद करें. स्टोर 80 डिग्री सेल्सियस (नाइट्रिक ऑक्साइड निर्धारण के लिए एक बाद में समय बिंदु पर) - एक लेबल शीशी और फ्रीज में perfusate नमूना.
  5. नमूना बंदरगाह रिकैप और सुनिश्चित करें कि सभी stopcocks को आरंभ करने से पहले खुले हैं प्रवाह.

9. प्रतिनिधि परिणाम

हमारे जल्दी से बीज विधि का उपयोग, मानव रक्त प्राप्त endothelial पूर्वज कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए टाइटेनियम स्लाइड्स पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और 15 dynes / 2 सेमी की शारीरिक (धमनी) कतरनी बलों के तहत पालन.

10 चित्र में दिखाया गया है, निर्यात संवर्धन परिषदों 210 से प्रवाह के प्रभाव ± 11.4 सुक्ष्ममापी दो के तहत फैल, बोने के तुरंत बाद 657 के लिए, ± 39.1 3 घंटे के बाद, और 1152 से 2 सुक्ष्ममापी ± 55.3 2 सुक्ष्ममापी 15 के तरल पदार्थ कतरनी तनाव के 24 घंटे के बाद dynes / 2 सेमी (पी <.0001, एक तरह से एनोवा के साथ समूहों के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है) . सेल क्षेत्र है, जो या तो प्रकाश या फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ पारदर्शी कक्ष के माध्यम से imaged किया जा सकता है में वृद्धि करने के लिए समानांतर, गोलाई 2 6 समीकरण के अनुसार गणना

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878 x 10 -3 ± 5.9 x 10 -3, तुरंत बोने के बाद 671, 10 -3 x ± 19.2 x 10 3 घंटे के बाद -3, और 526 x 10 -3 ± 19.2 x 10 -3 के बाद 48 घंटे से कम एक ही तरल पदार्थ कतरनी तनाव जोखिम के (समूहों के बीच अंतर को फिर से सांख्यिकीय पी <.0001, एक तरह से एनोवा के साथ महत्वपूर्ण है).

चित्रा 11D दिखाता है कि निर्यात संवर्धन परिषदों संरेखित और पूरबी 15 dynes / 2 सेमी के रूप में 6 घंटे की एक स्थिर बोने की अवधि, चित्रा 11a में दिखाया के बाद उनके यादृच्छिक उन्मुखीकरण की तुलना में 48 घंटे द्रव कतरनी तनाव के बाद प्रवाह की दिशा में है.

हमारी पद्धति का भी विश्लेषण और / या secreted सेल चयापचयों की मात्रा का ठहराव पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर perfusate के नमूने प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में हम उत्पादन चित्रित48 घंटे 12 चित्र में सुअर का निर्यात संवर्धन परिषदों के साथ प्रवाह प्रयोग के दौरान नाइट्राइट की tion (सं 2) . हम सीधे मध्यम नमूनों में एक सं लिए किराए मार्कर प्रवाह सर्किट से अलग अलग समय बिंदुओं पर एकत्र 6 घंटे में 12.0 nmol, 12 घंटे में 13.1 nmol, 24 में 16.3 nmol के रूप में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) के इस प्राथमिक ऑक्सीकरण उत्पाद मापा घंटे, और 1 x 10 15 dynes / 6 2 सेमी से कम 6 कक्षों के लिए 48 घंटे के बाद 24.6 nmol .

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रवाह सर्किट विधानसभा और प्रवाह प्रयोग के योजनाबद्ध दिखा एक सिंहावलोकन. फ्लो (ए) सर्किट विधानसभा प्रवाह कक्ष के बिना . यहाँ शामिल जलाशय, dampener नाड़ी, हार्ड टयूबिंग, मुलायम टयूबिंग, 4 तरह stopcocks और जुड़ा luer एडेप्टर, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हवा फिल्टर कर रहे हैं. (बी) के माध्यम से प्रवाह चैम्बर हार्ड टयूबिंग प्रवाह पंप सिर खंड कनेक्ट कर रहा है. (सी) ईपीसी वरीयता प्राप्त प्रवाह चैम्बर (डी) के नीचे की थाली में स्लाइड के sertion. विधानसभा प्रवाह सर्किट के प्रवाह कक्ष के साथ पूरा करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. बंध्याकरण के लिए पूरी तरह से इकट्ठे प्रवाह सर्किट.

चित्रा 3
चित्रा 3. Stopcocks साथ इकट्ठे प्रवाह सर्किट के बाद नसबंदी शामिल है .

चित्रा 4
चित्रा 4 ईपीसी माध्यम के 125 मिलीलीटर के साथ कांच के जलाशय भरना.

चित्रा 5
चित्रा सर्किट 5. प्रवाह प्रवाह पंप सिर में प्रवाह चैम्बर सम्मिलन से पहले clamped.

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चित्रा 6 शीर्ष चैम्बर प्लेट विधानसभा.

7 चित्रा
7 चित्रा ईपीसी मध्यम के साथ बुलबुला जाल Flushing चैम्बर के प्रवाह की ओर से बुलबुले को दूर करने के लिए..

8 चित्रा
8 चित्रा ईपीसी मध्यम के साथ चैम्बर स्लाइड और कक्ष का बहिर्वाह की ओर से बुलबुले को दूर Flushing.

9 चित्रा
9 चित्रा पूरी तरह से एक प्रवाह प्रयोग के दौरान डाला प्रवाह कक्ष के साथ प्रवाह सर्किट इकट्ठे हुए.

10 चित्रा
10 चित्रा. ईपीसी क्षेत्र (2 सुक्ष्ममापी में) प्रवाह प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर बढ़ जाती है .

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11 चित्र (ए) HUCB निर्यात संवर्धन परिषदों के लाइट माइक्रोस्कोप छवि एक fibronectin लेपित गिलास स्लाइड पर x 100 बढ़ाई में प्रवाह करने के लिए x 6 घंटे पहले वरीयता प्राप्त. (बी) HUCB तिवारी स्लाइड x 15 प्रवाह करने के लिए पहले मिनट पर लेबल के साथ निर्यात संवर्धन परिषदों CTO और त्वरित वरीयता प्राप्त x 100 बढ़ाई फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना. (सी) HUCB निर्यात संवर्धन परिषदों के साथ ही तिवारी स्लाइड नीचे के रूप में (बी), 100 dynes / 2 सेमी पर 3 घंटे के प्रवाह के बाद और x 100 बढ़ाई पर पारदर्शी कक्ष के माध्यम से imaged. प्रवाह के 3 घंटे के बाद कोशिकाओं के प्रसार, लेकिन अभी भी यादृच्छिक उन्मुखीकरण नोट. (डी) x 100 बढ़ाई प्रवाह जोखिम के 48 घंटे के बाद अब वही तिवारी स्लाइड,. निर्यात संवर्धन परिषदों CTO और सेल नाभिक Hoechst डाई (नीला) के साथ प्रवाह के बाद दाग कर रहे हैं के साथ लेबल रहे हैं. प्रवाह की दिशा में कोशिकाओं के संरेखण ध्यान दें. (ई) तिवारी पर तुलना करने के लिए सुअर निर्यात संवर्धन परिषदों के बाद प्रवाह के 48 घंटे और 15 dynes / सेमी

12 चित्रा
12 चित्रा. ग्राफ़ प्रवाह के 48 घंटे के के दौरान सुअर का निर्यात संवर्धन परिषदों के सं उत्पादन दर्शाया गया है . कोई एक प्राथमिक ऑक्सीकरण उत्पाद है, नाइट्राइट (कोई 2 -), मध्यम प्रवाह के दौरान अलग समय बिंदुओं पर एकत्र नमूनों से सं के लिए एक किराए मार्कर के रूप में मापा गया था.

13 चित्रा
13 चित्रा प्रवाह चैम्बर और एल्यूमीनियम मिश्र धातु 6061 आयताकार शेयर से बना है, शीर्ष (ए) 0.5 जा रहा है "x 2" x 7 खंड "और नीचे अनुभाग आयाम में 0.25 (बी)" x 2 "x 7" के साथ .. सबसे ऊपर हैइसके नीचे संपर्क O-अंगूठी 0.45 करने के लिए सतह पर planed क्रम में सील के लिए उदासी बीमा शीर्ष भाग इसके मध्य भाग में 0.125 recessed है. "है, जो x 1.375" द्रव जलाशय "एक 0.3125 के लिए प्रति अंत" 0.95 पत्ते. शीर्ष अनुभाग जलाशय 3/8-24 TPI और 0.25 "के लिए लड़ी पिरोया स्टेनलेस स्टील प्लग प्राप्त गहरी पिरोया है. 1 / 16 को मापने "x 0.625" स्लॉट नीचे है कि जलाशय के लिए घुसना में machined थे. अंतर्वाह की ओर प्लग 10/32 नली पानी निकलने की टोंटी को देते कंटिया "एक polypropylene 1 / 8 के लिए छेद के माध्यम से" है. प्रत्येक इकाई में अंत के एक केन्द्र स्थित लड़ी पिरोया 0.45 "x 2" अंत में नली कंटिया "एक 1 / 8 polypropylene के लिए गहरी भाग" 10/32 0.25 TPI है. समाप्त होता है एक .07 "धागे के नीचे से छेद के माध्यम से जलाशय घुसना करने के लिए शीर्ष अनुभाग के नीचे एक पतला क्षेत्र 0.६८७५ है." का उपयोग व्यापक है, 1.460 की दूरी "के लिए एक स्लॉट LH के केंद्र से 0.518 डिग्री. इस शंकु एक फ्लैट 0.6875 "व्यापक .०,११८ x" गहरी और 0.590 glas के अंत से "क्षेत्र के लिए मिश्रणोंएस अवकाश (या अन्य सतह, जैसे टाइटेनियम स्लाइड). यह फ्लैट ग्लास (या अन्य सतह, जैसे टाइटेनियम स्लाइड) के साथ भरा हो सकता है एक बार स्लाइड स्थापित किया गया है चाहिए. शंकु और फ्लैट पॉलिश कर रहे हैं. स्लाइड की सतह है .०११८ "नीचे सतह से recessed ०.०,११८" अवकाश आरएच छोर पर जलाशय स्लॉट के लिए जारी है. एक हे - अंगूठी पूरी तरह स्लॉट और स्लाइड O-अंगूठी नाली और स्लाइड के बीच मूल सतह के 0.020 "छोड़ने के आसपास recessed है ऊपर और नीचे की इकाइयों दस छेद के लिए drilled हैं. शीर्ष अनुभाग 8 / 32 TPI Countersunk फ्लैट के लिए निकासी छेद है सिर शिकंजा नीचे अनुभाग शीर्ष छेद मिलान रखा छेद है और 8 / 32 TPI लड़ी पिरोया नीचे इकाई इसकी सतह के साथ एक स्पष्ट गिलास स्लाइड विंडो recessed फ्लश कोशिका की सतह गिलास स्लाइड (या टाइटेनियम स्लाइड) पर स्थित है. इकाई O-अंगूठी एक नाली जो चौड़ाई के साथ शीर्ष इकाई में स्लॉट शामिल नीचे स्लाइड और आंतरिक O-अंगूठी नाली के बीच मूल सतह के 0.04 "छोड़ गया है. O-Rinजी एस लाल सिलिकॉन AS568A, ऊपर और नीचे अनुभाग के लिए अनुभाग 046 के लिए डैश संख्या 044 हैं.

Discussion

हमारे प्रवाह सर्किट और प्रवाह चैम्बर हमें पक्षपाती कोशिकाओं, परिभाषित द्रव कतरनी तनाव जैसे निर्यात संवर्धन परिषदों, विषय के लिए अनुमति देते हैं. चैम्बर ऊपर और नीचे के बाद से कर रहे हैं पारदर्शी, कोशिका आसंजन और आकारिकी वास्तविक समय में या तो मूल्यांकन कर सकते हैं, कक्ष के माध्यम से ही, या एक प्रवाह और प्रवाह कक्ष के disassembly प्रयोग के बाद. उस बिंदु पर, कोशिकाओं बाँझ शर्तों के तहत काटा जा सकता है और या तो फिर से मढ़वाया, या आगे के विश्लेषण के लिए उनके डीएनए या शाही सेना, आदि, लेने के लिए इस्तेमाल किया.

लामिना का प्रवाह को प्राप्त करने के लिए, कक्ष का डिजाइन ऐसा है कि कई स्थितियों से मुलाकात कर रहे हैं होना चाहिए.

सबसे पहले, प्रवाह लामिना, जो अपनी रेनॉल्ड्स (रे) संख्या है, जो चिपचिपा बलों को inertial बलों के अनुपात की गणना के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है है किया जाना चाहिए. (यदि चिपचिपा बलों प्रबल होना, पुन छोटा है और प्रवाह लामिना या 'पूरी तरह से विकसित' है - रे <2300 के लिए आम तौर पर .यदि inertial बलों प्रबल होना, प्रवाह और अधिक से अधिक यादृच्छिक हो जाता है जब तक यह अशांत है, के रूप में पुन> 4000 के लिए मामला है) हम 3 8 समीकरण अनुसार पुनः गणना कर सकते हैं,

3 समीकरण

कहाँ ρ द्रव घनत्व है, क्यू प्रवाह दर है, μ दलदलापन है, w और घंटे चौड़ाई और कक्ष की ऊंचाई, क्रमशः रहे हैं, और डी घंटे हाइड्रोलिक व्यास, 4 समीकरण 8 के अनुसार परिभाषित है,

4 समीकरण

रेनॉल्ड्स हमारे तीन प्रवाह कक्षों की संख्या, 166 से लेकर हाइट्स के साथ - 267 सुक्ष्ममापी, 13.9 से लेकर - प्रवाह दरों में 34.6 ग15 dynes / 2 सेमी की एक कतरनी तनाव प्राप्त करने के लिए alculated. 234 - 100 dynes / 2 सेमी की एक कतरनी तनाव के लिए गणना प्रवाह दरों पर, कक्षों की रेनॉल्ड्स संख्या 90.4 से लेकर . इन रेनॉल्ड्स संख्या के सभी 2300 की तुलना में बहुत कम हैं और लामिना का प्रवाह के लिए कसौटी को पूरा.

दूसरा, वेग क्षेत्र और कतरनी तनाव के लिए प्रवाह चैनल (यानी पूरी तरह से विकसित), द्रव इनलेट से दूरी के लिए प्रवेश द्वार लंबाई, एल ई की तुलना में अब होना चाहिए स्लाइड के साथ दूरी के स्वतंत्र होने के लिए. इस प्रवेश द्वार लंबाई की गणना के द्वारा संतुष्ट किया जा सकता है 9 5 समीकरण के अनुसार .

5 समीकरण

उपरोक्त मान के लिए, प्रवेश की लंबाई 0.01 से 0.25 सेमी तक पर्वतमाला.

तीसरा, आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि वेग और पार्श्व दिशा में कतरनी तनाव भिन्न नहीं हैसे काफी एक आयामी चैनल प्रवाह के लिए मूल्य पीएचडी / 2L), / ज w अनुपात 1 से काफी कम किया जाना चाहिए. दो आयामी प्रवाह शर्तों के तहत औसत दीवार कतरनी तनाव के लिए एक आयामी प्रवाह के तहत दीवार कतरनी तनाव का 95% हो के लिए, / ज w 0.10 करने के लिए बराबर हो, और दो आयामी प्रवाह शर्तों के तहत दीवार कतरनी तनाव के लिए हो सकता है एक आयामी प्रवाह के तहत दीवार कतरनी तनाव के 97.5%, / ज w 0.05 करने के लिए बराबर होना चाहिए. हमारे डिजाइन प्रवाह कक्ष चौड़ाई में 1.7 सेमी और 166 के आयामों के साथ - ऊंचाई में 267 सुक्ष्ममापी, इन मानदंडों को संतुष्ट कर रहे हैं.

दबाव केवल प्रवाह की दिशा में भिन्न अगर वहाँ प्रवेश द्वार पर कोई पार्श्व दबाव gradients. यह प्रवाह - पथ में रंजक या कणों का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, निरंतर प्रवाह प्रयोगों के लिए, एक पल्स dampener प्रवाह सर्किट में डाला जाता है. पल्स dampener puls के बाहर सबसे अधिक लेता हैatility सर्किट में रोलर पंप की वजह से है, और हमें सतत प्रवाह के लगभग धारणा करने की अनुमति देता है. ध्यान से, नाड़ी का उपयोग dampener पंप और टयूबिंग के सर्किट में इस्तेमाल के साथ संगत हो सकता है, इतना है कि यह प्रभावी ढंग से रोलर पंप के विशिष्ट आवृत्तियों के लिए उत्पादन के प्रवाह में pulsations को समाप्त कर सकते हैं चाहिए. हमारे प्रदर्शन में Masterflex एल / एस पल्स dampener लामिना का प्रवाह प्राप्त होता है जब किसी भी Masterflex श्रृंखला एल / एस पंप (0 - 600 RPMs के) के साथ निर्वहन लाइन पर इस्तेमाल किया है और मैं / पी 26 टयूबिंग. काँपने के गुणवाला प्रवाह के लिए, एक प्रोग्राम पंप विभिन्न waveforms उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

काँपने के गुणवाला प्रवाह के लिए, एक प्रोग्राम पंप विभिन्न waveforms उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इसके अलावा, सर्किट perfusate की कि ऐसे नमूने आसानी से प्रवाह या मध्यम कोशिकाओं के संक्रमण के जोखिम के बिना बनाया गया है अलग अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है. हमारे उदाहरण में, सं की एकाग्रता 2 - chemiluminescence के साथ मापा गया थाIonics Sievers / नाइट्रिक ऑक्साइड विश्लेषक (280 NOA, Sievers उपकरण, बोल्डर, CO) के रूप में पहले 10 में वर्णित है . नाइट्राट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया reductant एसिटिक एसिड (14.5 एम एसिटिक एसिड और 0.05 एम की) है, जो कमी संभावित सं नाइट्राइट कन्वर्ट है, लेकिन नाइट्रेट जैसे नाइट्रोजन के किसी भी उच्च आक्साइड को कम करने के लिए अपर्याप्त है में पोटेशियम योडिद था और इस तरह अपेक्षाकृत है नाइट्राट के लिए विशिष्ट. कुल राशि का उत्पादन नाइट्राइट उत्पादन एकाग्रता और सर्किट की कुल मात्रा के उत्पाद के रूप में गणना की गई, जबकि खो दिया है जबकि 6 नमूने लेने की मात्रा के लिए समायोजन.

निम्न चरणों का प्रवाह प्रयोगों के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हैं:

  1. यह प्रवाह सेट अप के दौरान बुलबुला गठन से बचने के लिए वांछनीय है, क्योंकि बुलबुले के लिए रवाना उनकी सतह से कोशिकाओं आंसू की क्षमता है. यह ख्याल रख रही है जब नीचे हिस्सा है, जो सबसे अच्छा है पर प्रवाह चैम्बर के शीर्ष भाग रखने से बचा जा सकता हैदोनों एक दूसरे के समानांतर रखने और नीचे पर readjustments बिना एक प्रस्ताव में शीर्ष कम द्वारा पूरा किया. ऐसा करने में, छोटे हवाई बुलबुले कि वर्तमान और / या प्रवाह चैनल में तैरते हो सकता है, एल्यूमीनियम आवास के दोनों छोर पर बुलबुला जाल में बँट जाएगा.
  2. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि जलाशय में बहिर्वाह टयूबिंग जलाशय नीचे के नीचे पहुंचता है है. अन्यथा, हवा टयूबिंग है कि जलाशय से चैम्बर की ओर जाता है है अगर perfusate स्तर टयूबिंग अंत से थोड़ा नीचे गिर जाता है में चूसा जा सकता है.
  3. शोधकर्ता पंप प्रवाह की दिशा ताकि पंप प्रवाह के प्रारंभ, जो हवा सर्किट और चैम्बर में चूसा जा रहा में परिणाम होगा पर गलती से विपरीत दिशा में नहीं चलता है के साथ परिचित होना चाहिए.
  4. फोम (विकृत सीरम में निहित प्रोटीन के कारण) के गठन से बचने के लिए, हम टयूबिंग है कि कक्ष से जलाशय perfusa ऊपर लगभग एक इंच होता है कम सलाहजलाशय के अंदर ते स्तर. हालांकि, यह प्रवाह मध्यम स्तर से ऊपर रखते हुए आप प्रयोग के दौरान जलाशय में प्रवाह सत्यापित करने के लिए अनुमति देता है.
  5. जब कक्ष भागों एक साथ पंगा लेना, यह महत्वपूर्ण है के लिए दृढ़ता से एक हाथ से आवास समझ जबकि अपने दूसरे हाथ से बिजली का शराबी ऑपरेटिंग. ध्यान दें कि बिजली का शराबी की गति टोक़ है जो करने के लिए 'के आसपास चैम्बर लात एक बार पेंच कड़ा है क्षमता है में अनुवाद किया जाएगा.
  6. सर्किट में निर्मित करना और उनकी सतह से कोशिकाओं उठाने से कोई दबाव लहरों से बचने सुनिश्चित करें कि सभी stopcocks प्रवाह आरंभ करने से पहले खुले हैं.
  7. लंबी अवधि के प्रवाह के अध्ययन के लिए विशेष रूप से (> 48 घंटे) हम कठिन है और अधिक लचीला पंप सिर में डाला जा टयूबिंग के टूटने को रोकने टयूबिंग का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
  8. यह संभव है कि ट्यूबिंग पंप बीमार समायोजित पंप सिर दांत की वजह से सिर के अंदर 'उत्प्रवासित'. इसलिए हम कैसे टब के करीब ध्यान दे सुझाव हैआईएनजी पंप सिर में सुरक्षित है और एक अंकन ऐसी है कि आप आसानी से अगर टयूबिंग 'में खींच लिया है' या प्रयोग के दौरान उखाड़ फेंकना है नोटिस कर सकते हैं कलम के साथ टयूबिंग के प्रत्येक के अंत अंकन.
  9. हमेशा ध्यान सर्किट और चैम्बर के हर एक संबंधक से पहले की जाँच करने के लिए क्रम में एक दोषपूर्ण कनेक्शन की वजह से प्रयोग के दौरान perfusate के रिसाव को रोकने के छिड़काव शुरू. यह नाड़ी dampeners के प्रवाह और बहिर्वाह connectors के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है!
  10. प्रकाश जोखिम सीमा यदि आप फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करें याद रखें.

हमारे प्रवाह चैम्बर के एक संभव सीमा है कि ऊंचाई चैनल की ऊंचाई एल्यूमीनियम में machined द्वारा तय हो गई है. हालांकि, यह सत्यापित करने के लिए और प्रत्येक प्रयोग करने के लिए पहले चैनल की ऊंचाई समायोजित नहीं करने का लाभ है और इसलिए केवल वांछित मूल्य के लिए पंप प्रवाह का समायोजन करके कतरनी तनाव गणना सरल है. अपने अनुसंधान के लक्ष्यों पर निर्भर करता है, यह करने के लिए वांछनीय हो सकता हैपंप गति बढ़ाने के बिना कतरनी तनाव बढ़ा सकते हैं. इस मामले में हम perfusate दलदलापन बढ़ाने की सिफारिश, जैसे मध्यम 11 dextran जोड़ने .

प्रवाह सर्किट का एक संभव सीमा माध्यम की बड़ी मात्रा में प्रयोग किया जाता है, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब सेल चयापचयों का बहुत छोटे सांद्रता मात्रा ठहराना करने का प्रयास कर सकते हैं. हालांकि यहाँ दिखाया नहीं, यह संभव है करने के लिए काफी एक छोटे जलाशय और नाड़ी हतोत्साहित का उपयोग करके सर्किट मात्रा को कम करने और टयूबिंग की लंबाई और व्यास में कमी.

इसके अतिरिक्त, वहाँ कई अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम है कि संस्कृति में कोशिकाओं के लिए तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू इस्तेमाल किया जा सकता हैं. Microfluidic आधारित प्रणाली, Fluxion से BioFlux प्रणाली जैसे, विभिन्न microfluidic प्रवाह अच्छी तरह से और इन 12,13,14 चैनलों के लिए इनपुट और आउटपुट जलाशयों के रूप में अभिनय प्लेटों में समाधान के साथ भरी हुई चैनलों में कोशिकाओं के साथ - साथ विश्लेषण सक्षम. हालांकि, इन और अन्य सूक्ष्मfluidic प्रणाली मानक खुर्दबीन स्लाइड के साथ संगत नहीं हैं और RT-पीसीआर या वेस्टर्न ब्लाट के रूप में आगे प्रयोगों के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त बड़ी संख्या की वसूली के लिए अनुमति नहीं है. इसके अलावा, वे कम उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं, 40,000 डॉलर की एक न्यूनतम लागत और अधिक से अधिक $ 100,000 की कुल पहुंच सकता है, सहायक उपकरण पर निर्भर करता है.

दो macrofluidic Flexcell अंतर्राष्ट्रीय निगम, Flexcell की किरण और FlexFlow प्रणाली से उपलब्ध सिस्टम सफलतापूर्वक किया गया है करने के लिए endothelial कोशिकाओं 15,16,17, मानव वलय 18 कोशिकाओं और द्रव का प्रवाह शर्तों के तहत 19 fibroblasts अध्ययन किया. एक तिहाई प्रणाली, GlycoTech के माध्यम से उपलब्ध है, ट्यूमर कोशिका 20 आसंजन और endothelial monolayers ल्युकोसैट 21 आसंजन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है.

किरण प्रणाली कई स्लाइड्स एक ही बार में एक ही कतरनी तनाव की शर्तों के तहत चलाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन एक को देखने और खिड़की का अभाव है - हमारे विपरीतडिजाइन प्रवाह के तहत कोशिकाओं का वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति नहीं है.

FlexFlow प्रणाली एक को देखने की खिड़की है, लेकिन एक ईमानदार माइक्रोस्कोप, जो मानक ज्यादातर प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी नहीं हो सकता है की आवश्यकता है. इसके अलावा, FlexFlow प्रणाली सेल लिपटे एक कवर जब प्रवाह चैम्बर में रखा उलटा हो पर्ची की आवश्यकता है. यह जैसे टाइटेनियम - लेपित गिलास, एक अपारदर्शी सतह पर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं है, जो हम अपने अध्ययन में प्रदर्शन के दृश्य precludes. अन्त में, विशेष कवर फिसल जाता है के लिए विशेष रूप से FlexFlow प्रणाली है, जो बहु - हजार डॉलर कीमत रेंज में है Flexcell की किरण प्रणाली के लिए समान के लिए खरीदा जा जरूरत है.

GlycoTech परिपत्र और आयताकार समानांतर थाली प्रवाह कक्षों, जो काफी कम महंगा है, लेकिन डाली एक्रिलिक है कि आसानी से हमारे चैम्बर तरह autoclaved स्टेम नहीं किया जा सकता है से निर्मित कर रहे हैं प्रदान करता है. ध्यान से, अन्य प्रवाह कक्षों में वर्णित किया गया है कि Autoclavable होने के लिएक्योंकि वे विशेष सूक्ष्म 22,23 लेंस की आवश्यकता अव्यावहारिक दिखाई . GlycoTech प्रणाली सिलिकॉन रबर gaskets के ऊपर और नीचे प्लेटों के बीच interposed, जो दोहराया उपयोग के साथ मोटाई में परिवर्तन और इसलिए समय (निर्माता के बाद हर दस का उपयोग करता है नए क्रय की सिफारिश) पर चैम्बर ऊंचाई परिवर्तन का इस्तेमाल. हमारे O-अंगूठी में बनाया के साथ एल्यूमीनियम चैम्बर ऊपर और नीचे प्लेटों की पूरी विरोध के लिए अनुमति देता है और प्रयोगों के बीच लगातार कक्ष ऊंचाई सुनिश्चित करता है. अन्त में, वैक्यूम पंप करने के लिए कई प्रवाह चैम्बर डिजाइन में रिसाव प्रूफ मुहर सहित GlycoTech कक्षों, जो हमारे डिजाइन में आवश्यक नहीं कर रहे हैं, को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं.

जबकि यहाँ दिखाया नहीं, प्रवाह चैम्बर कोशिका आसंजन और / या व्यवहार के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए पूरे प्रवाह के प्रयोग के दौरान एक खुर्दबीन के नीचे रखा जा सकता है. अगर यह वांछित है, हम चैम्बर के तहत गर्मी दीपक या एक गर्म पैड का उपयोग करने की अनुशंसा पर 37 perfusate तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस फरवहाँ, रोलर पंप एक सिरिंज पंप के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यदि या तो कक्षों या चयापचयों या investigational दवाओं या एजेंटों का कोई पुनःपरिसंचरण '24 वांछित है .

पक्षपाती कोशिकाओं, सहधारा निर्यात संवर्धन परिषदों की एक परत पर जैसे फ्लोरोसेंट प्लेटलेट्स (प्लेटलेट Achneck एट अल द्वारा वर्णित परख का उपयोग 6,25) पर अलग लेबल कोशिकाओं प्रवाह द्रव कतरनी तनाव के अंतर्गत सेल करने वाली सेल बातचीत का मूल्यांकन यह भी संभव है. हमारे प्रवाह चैम्बर अन्य perfusate नमूने बंदरगाह और एक को देखने खिड़की के रूप में उपलब्ध प्रवाह कक्षों, मूल्यवान सुविधाओं को जोड़ती है है और या तो एक औंधा या ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ संगतता के महत्वपूर्ण लाभ है. यह पूरी तरह से Autoclavable है और निरंतर कक्ष ऊंचाई पर और वैक्यूम पंप की जरूरत के लिए एक leakproof मुहर प्राप्त करने के बिना दोहराया प्रयोगों के लिए अनुमति देता है.

Disclosures

उत्पादन और इस वीडियो लेख के नि: शुल्क प्रवेश कोल-Parmer साधन कंपनी द्वारा प्रायोजित है

Acknowledgments

लेखकों जो ओवेन बायोमेडिकल साधन और मशीन शॉप में मशीनिंग में और प्रवाह कक्षों के माध्यम से छवि कोशिकाओं को तकनीक में सहायता के लिए Leica माइक्रोसिस्टम्स से प्रवाह चैम्बर भागों और मैट Maudsley कोडांतरण अपने अथक प्रयासों के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. हम ड्यूक परफ्यूज़न सेवा से केविन कोलिन्स और प्रवाह सर्किट डिजाइन पर उपयोगी सुझाव के लिए बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग में डॉ. स्टीव वालेस ऋणी हैं. हम भी उनके समर्थन के लिए एलेक्जेंड्रा Jantzen और NIH अनुदान के माध्यम से "ऑटोलॉगस ईपीसी अस्तर के संचार के biocompatibility में सुधार उपकरणों की सहायता" RC1HL099863 01-समर्थन के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप कार्यक्रम को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml Syringe Cole-Parmer 07940-12
1-Way Stopcoks Cole-Parmer 30600-00
30 ml Syringe BD Biosciences 309650
4 -Way Stopcocks Cole-Parmer 30600-04
Aluminum Alloy N/A 6061
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) Thermo Fisher Scientific, Inc. 267061
Cell Tracker Orange Invitrogen C34551
DMSO Research Organics 2162D
DPBS (-/-) Invitrogen 14190-144
EGM-2 Singlequots Lonza Inc. CC-4176
Female Luer Adaptor Cole-Parmer SI-45500-04
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-2MG
Glass Bottle (250ml) with Cap Cole-Parmer 34594-24
Hard Tubing Cole-Parmer 06508-16
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Histopaque Sigma-Aldrich H8889-500ML
H–chst Stain Solution Sigma-Aldrich H6024
Hyclone FBS Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30071.01
L-glutamine Lonza Inc. 17-605E
Male Luer Adaptor Cole-Parmer EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium Cellgro 15-100-CV
Barbed Polypropylene Fittings Cole-Parmer 06365-90
O-Rings N/A AS568A
Pulse-Dampener Cole-Parmer 07596-20
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) Cole-Parmer 7524-40
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) Cole-Parmer 07518-60
Slide Cole-Parmer 48500-00
Soft Tubing Cole-Parmer 96400-16
Syringe filter Cole-Parmer 02915-12
Sytox Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11368
Trypsin EDTA Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution Lonza Inc. CC-5002

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References

  1. Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
  2. Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
  3. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  4. Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
  5. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
  6. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  7. Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
  8. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. Pearson Education. (2004).
  9. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. Pearson Education. (2009).
  10. Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
  11. Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
  12. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
  13. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  14. Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
  15. Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
  16. Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
  17. Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
  18. Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
  19. Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
  20. Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
  21. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
  22. Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
  23. Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  24. Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
  25. Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
समानांतर थाली फ्लो चैंबर और सतत प्रवाह सर्किट लैिमनार फ्लो कतरें तनाव के तहत endothelial पूर्वज सेल का मूल्यांकन
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Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F. H., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).More

Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F. H., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).

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